治疗疼痛的活性剂和方法

专利名称：治疗疼痛的活性剂和方法
治疗疼痛的活性剂和方法相关申请的交叉参考本申请要求于2008年9月3日提交的美国临时申请号61/094，0 的权益，该美国临时申请在此以其整体引入作为参考，用于所有目的。
背景技术：
疼痛是一种包括感官感受的复杂现象，其通常涉及意识到有害刺激或机体伤害。 个体通过各种原因经历疼痛，从各种日常伤害和疼痛，到更严重的损伤或疾病。尽管它引起不愉快，但疼痛是人类和其它动物存在的重要部分；实际上，其对于健康存活是非常关键的。疼痛是身体防御系统的一部分，引发精神和生理行为以终止疼痛体验。其促进了学习，因此将更少地重复疼痛刺激。疼痛激励生物避开与疼痛相关的有害刺激。初始的疼痛表明伤害在逼近，诸如来自很快即将断裂的骨头的疼痛。疼痛还能促进康复过程，因为多数生物将保护受伤区域以避免进一步的疼痛。已发现许多分子介质与疼痛感知相关联，包括钠、钾和钙离子通道。当今正在使用许多不同的镇痛药。实例包括非留体抗炎剂(NSAID)诸如水杨酸盐、麻醉药诸如吗啡、具有麻醉特性的合成药诸如曲马朵，以及其他各种药物。发明概述本发明尤其提供了缓解疼痛的活性剂，其例如包括含有YGRKKRRQRRRKLSSIESDV (SEQ ID NO 1)的氨基酸序列，或具有少于10个缺失、替换或插入的该序列的变体，或该序列或变体的拟肽。本发明还包括治疗疼痛的方法，包括以有效治疗或有效预防疼痛的方案给正在经历疼痛或有疼痛风险的患者施用本发明的活性剂。任选地，该剂量为lmg/kg以下。任选地，剂量为10_5至lO^g/kg。任选地，该患者没有经历选自以下的至少一种疾病或病症 中风、癫痫、缺氧、CNS的外伤性损伤、阿尔茨海默病以及帕金森病。任选地，该患者没有或确信没有罹患这些疾病的任一种。任选地，疼痛位于外周部位。任选地，疼痛位于CNS。任选地，外周地施用该肽或拟肽。任选地，鞘内地施用该肽或拟肽。任选地，通过使该肽或拟肽与N型钙通道结合实现疼痛的治疗或预防。本发明还包括包含tat肽或由tat肽组成的活性剂，其中所述的tat肽具有包含 YGRKKRRQRRR(SEQ ID NO :2)的氨基酸序列，或具有该序列的少于4个缺失、替换或插入的其变体，或该tat肽或变体的拟肽，治疗疼痛的方法，包括以有效治疗或有效预防疼痛的方案给正在经历疼痛或有疼痛风险的患者施用此类肽。任选地，该tat肽没有与NMDAR 2B 9C 连接。任选地，该tat肽没有与PSD95-NMDAR相互作用的抑制剂连接。任选地，该tat肽与 NMDAR 2B 9C连接。任选地，所施用的tat肽没有以可检测的量进入CNS中。任选地，该方案主要导致N型钙通道的抑制，而不是PSD-95与NMDAR或NOS相互作用的抑制。附图简述

图1A、B、C 受体结合/抑芾岍究的结果，其评估肽iTat-NI^Bgc (YGRKKRRQRRRKLSSIESDV, SEQ ID NO 1)抑制多种放射性标记的配体与细胞受体结合的能力。图2 施用各种肽对DRG神经元的N型钙离子电流(上图)或全细胞电流(下图)的振幅的影响。“之前”即将施用肽之前的钙电流的常态振幅；Tat-NR2B9c: YGRKKRRQRRRKLSSIESDV(SEQ ID NO 1) ；1990 =Tat 肽 YGRKKRRQRRR(SEQ ID NO 2)； 1991 肽 2B9c (KLSSIESDV, SEQ ID NO 3)；肽 Tat_NR2B9c :YGRKKRRQRRRKLSSIESDV (SEQ ID NO 1) ；1992 肽 Tat_NR2B9c_AA(YGRKKRRQRRRKLSSIEADA，SEQ ID NO :4) ；1993 肽 F-Tat-NR2B9c(FGRKKRRQRRRKLSSIESDV，SEQ ID NO 5) ；1994 肽 Tat_NR2B9c K 至 A :YGRKKRRQRRRALSSIESDV, SEQ ID NO :6) ；1995 肽 F_Tat_NR2B9c K 至 A (FGRKKRRQRRRALSSIESDV, SEQ ID NO :7) ； 1987 :Tat_NR2B9c 的 D-异构体；1976 : YGRKKRRQRRRKLSSIESDX，其中X =正缬氨酸(SEQ ID NO 9) ；1977 :YGRKKRRQRRRKLSSIESDX， 其中X = L-叔丁基-甘氨酸(SEQ ID NO 10)。图3 :Tat-NR2B9c以剂量依赖的方式逆转了外周神经受伤后大鼠的疼痛超敏感性。图3A:与仅用盐水溶媒治疗的大鼠(n = 9只动物，空心柱)相比，用低剂量 Tat-NR2B9c (每只动物IOOpmol ；η = 15只动物；实心柱)治疗的动物显示出疼痛超敏感性的降低(即，升高的缩爪阈值)。星号表明与溶媒对照相比P < 0. 05 ；柱表示平均值士 SEM。 图3Β 在施用I~at-NR2B9C后0和2小时，Tat-NR2B9c缓解疼痛效果的持续时间(以逆转疼痛超敏感性的方式测得)，如通过平均缩爪阈值(士SEM)所测得的那样。在即将施用 Tat-NR2B9c之前(时间=0)测量缩爪阈值，然后在60,90和120分钟后测量(*表示与t =0相比ρ < 0. 05)。图3C 静脉内施用更高剂量的Tat-NR2B9c (10mg/kg i. v.)显示出对外周神经损伤后的疼痛超敏感性没有效果。在即将施用Tat-NR2B9c之前(时间=0)测量缩爪阈值，然后在60、90和120分钟后测量(*表示与t = 0相比ρ < 0. 05)。图4 各种肽对背根神经节(DRG)神经元N型钙电流的IC5tl的确定。1990 Tat 肽 YGRKKRRQRRR (SEQ ID NO 2) ；1991 肽 2B9c (KLSSIESDV，SEQ ID NO 3) ； 1992 :T at-NR2B9c-AA(YGRKKRRQRRRKLSSIEADA, SEQ ID NO :4) ； 1993 :F-Tat_NR2B9c(FGRKKRRQ RRRKLSSIESDV, SEQ ID NO :5) ；1994 :Tat_NR2B9c K 至 A:YGRKKRRQRRRALSSIESDV，SEQ ID NO 6) ； 1995 :F-Tat-NR2B9cK 至 A(FGRKKRRQRRRALSSIESDV, SEQ ID NO :7) ；1976 YGRKKRRQRRRKLSSIESDX，其中X =正缬氨酸(SEQ ID NO :9) ；1977 YGRKKRRQRRRKLSSIESDX, 其中 X = L-叔丁基-甘氨酸(SEQ ID NO :10) ； 1987 :Tat_NR2B9c 的 D-异构体。图5A和5B 在DRG神经元中，Tat_NR2B9c对N型钙电流的与L型电流相比的选择性。图5A显示Tat-NR2B9c (100 μ Μ)和ω -芋螺毒素(1 μ Μ)对培养的DRG神经元钙电流的影响。图5Β显示在Tat-NR2B9c的存在下(细胞内100 μ Μ), DRG钙电流的硝苯地平抑制。图6 :Tat-NR2B9c对N型钙电流的抑制没有功能依赖性。通过不同的频率(0. 07、10、20、50Hz)在一个代表性DRG神经元中记录电流。如指出的那样施用Tat-NR2B9c (100 μ M)。电流显示出强的频率依赖性减少，并且频率的升高未增加 Tat-NR2B9c的抑制效果。图7 通过Tat_NR2B9c对钙电流的抑制不是电压依赖性的。在培养的DRG神经元中Ca2+的I-V关系。在存在或不存在10 μ M硝苯地平的情况下施用Tat-NR2B9c(10， 100 μ Μ)。应用50ms电压钳逐步地从-40至+50mV从_60mV的保持电位来激发电流。发明详述I.定义
“融合多肽”指由正常情况下不作为融合肽的氨基酸序列中融合在一起的两种(或多种)不同的异源多肽组成的复合多肽，即单条连续的氨基酸序列。术语“PDZ结构域”指具有约90个氨基酸的模块蛋白质结构域，其特征在于与脑突触蛋白质PSD-95、果蝇分隔连接蛋白质Discs-Large(DLG)、以及上皮紧密连接蛋白质 ZOl(ZOl)的显著的序列同一性(例如，至少60% )。PDZ结构域也称为Discs-Large同源重复(“DHR”)和GLGF重复。PDZ结构域一般表现为维持核心共有序列(Doyle, D. Α. , 1996, Cell 85 :1067-76)。示例性的含PDZ结构域的蛋白质和PDZ结构域序列公开于US申请号 10/714，537中，其整体引入本文作为参考。术语“PL蛋白质”或“PDZ配体蛋白质”指与PDZ结构域形成分子复合物的天然存在的蛋白质，或指下述蛋白质其羧基末端，当与全长蛋白质分开表达时(例如，作为3-25 个残基的肽片段，例如3、4、5、8、9、10、12、14或16个残基)，形成所述分子复合物。分子复合物可以使用例如在US申请号10/714，537中描述的“A测定法”或“G测定法”在体外观察或在体内观察。术语“NMDA受体”或“NMDAR”指已知与NMDA相互作用的膜结合蛋白质。该术语因此包括本申请背景部分中描述的各种亚基形式。此种受体可以是人或非人的(例如，小鼠、 大鼠、兔、猴)°“PL 基序”指能与 PDZ 蛋白的 PDZ 结构域结合的 3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、20 或25个连续的氨基酸。例如，可在PL蛋白质C端发现的C末端PL序列(例如，PL蛋白至少3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、20或25个连续(末端残基)。其他PL基序可在蛋白质内部发现(“内部PL序列”)。"PL肽”是包括与PDZ结构域特异性结合的PL基序、或由该PL基序组成、或以其他方式基于该PL基序的肽。“拟肽”指具有与由天然氨基酸组成的肽基本上相同的结构和/或功能特征的合成化学化合物。拟肽可以完全地包含氨基酸的合成的非天然类似物，或是部分天然肽氨基酸和部分非天然氨基酸类似物的嵌合分子。拟肽还可以掺入任何数量的天然氨基酸保守替换位点，只要此种替换基本上不改变模拟物的结构和/或抑制活性或结合活性。多肽模拟成分可以含有非天然结构组分的任何组合，所述非天然结构组分一般来自3个结构组a)非天然酰胺键(“肽键”)连接的残基连接基团；b)代替天然存在的氨基酸残基的非天然残基；或c)诱导二级结构模拟，即诱导或稳定二级结构例如β转角、Y转角、β折叠、α螺旋构象等的残基。在包含tat肽和第二治疗肽的双功能肽的拟肽中，tat肽或第二肽或两者都可以是拟肽。此外，多肽可具有拟肽键，诸如N-甲基化键(-N(CH3)-CO-)；酯键(-C(R) H-C-O-O-C(R)-N-)；酮亚甲基键(-CO-CH2-)；氮杂键(_NH_N(R)-C0-)，其中R是任意的烷基，例如甲基；碳氮键(-CH2-NH-)；羟基亚乙基键(-CH(OH)-CH2-)；硫代酰胺键(-CS-NH-)； 烯族双键(-CH = CH-)；逆酰胺键(-NH-C0-)；肽衍生物(-N(R)-CH2-CO-),其中R是天然存在于碳原子上的“正常”侧链。这些修饰可发生在沿着肽链的任意键上，甚至可同时出现在多处处)。例如，肽可包括酯键。多肽还可掺入还原肽键，即Ii1-CH2-NH-R2，其中R1和 &是氨基酸残基或序列。还原肽键可作为二肽亚单位引入。此类多肽可对蛋白酶活性具抗性，并且在体内可拥有延长的半衰期。亲和元件还可以是类肽(N-取代的甘氨酸)，其中侧链与沿着分子骨架上的氮原子连接，而不是如在氨基酸上那样的与α -碳连接。
术语“特异性结合”指2种分子例如配体和受体之间的结合，其特征在于一种分子 (配体)即使在许多其他不同分子的存在下也与另一种特定分子(受体)结合的能力，即在异质的分子混合物中显示出对一种分子优先于其它分子的结合。配体与受体的特异性结合也可以通过在过量未标记配体的存在下，可检测标记的配体与受体结合的减少得以证明 (即，结合竞争测定法)。术语“试剂”或“活性剂”通常是具有或可能具有期望活性的化合物。除非另外指出，所述期望活性是治疗活性或药理学活性，诸如缓解或预防疼痛。活性剂包括已经为已知药物的化合物、药理学活性已得到鉴定但正在经历进一步的治疗评估的化合物、以及作为待筛选药理学活性的集合和化合物库的成员的化合物。例如，活性肽是作为肽的活性剂。活性嵌合剂包含与内化肽连接的活性剂。术语“活性剂”意欲不仅包括所指出的活性剂，而且还包括所指出活性剂的功能活性类似物、变体或衍生物。“内化活性剂”不需要具有治疗活性，但可使所连接的治疗剂通过细胞内递送至细胞(和/或跨血脑屏障递送)。“治疗”或“药理学”的活性是指在筛选系统中展示出活性的活性剂，其表明该活性剂是或可能在预防或治疗疼痛或疾病(例如，与疼痛相关的疾病)中有用。该筛选系统可以是体外、细胞、动物或人。尽管可能还需要证实其在治疗疾病中的实际预防或治疗用途， 但仍然可将活性剂描述为具有治疗或药理学活性。“显著的”是指指ρ值< 0.05、优选< 0.01且最优选< 0.001。II.概述本发明提供了可用于治疗疼痛的活性剂。示例性的活性剂包括肽 Tat-NR2B9c (YGRKKRRQRRRKLSSIESDV, SEQ ID NO 1)，或由肽 Tat_NR2B9c 组成。该肽之前作为通过抑制PSD95与NMDA受体和/或NOS的相互作用而抑制中风或类似病症的损伤效应的活性剂而描述。本申请提供了显示Tat-NR2B9c肽在疼痛的缓解中有效的数据。可在低于抑制PSD-95与NMDAR或NOS相互作用所需的剂量的肽剂量下获得疼痛的缓解。尽管对机制的了解不是实现本发明所需的，但Tat_NR2Bc肽在治疗或预防疼痛中的效果似乎是通过不同于抑制PSD-95与NMDAR及NOS相互作用的其他机制。一种可能的机制是通过与N型钙通道结合。非PSD95介导的作用机制在比之前所描述的治疗诸如中风和癫痫的神经疾病的方法更低的Tat-NR2Bc治疗剂量下有效，其中所述之前描述的方法涉及用Tat-NR2B9c抑制PSD95的相互作用。III.疼痛在其最宽泛的应用中，“疼痛”是指对经历疼痛的个体而言高度主观的经验现象， 并且通常受到该个体的精神状态、包括环境和文化背景的影响。“物理”疼痛通常与第三方可感知的刺激相关，其引起实际的或潜在的组织损伤。在这一意义上，根据国际疼痛研究协会(IASP)，疼痛可认为是“与实际的或潜在的组织损伤相关的，或依据此类损伤描述的感官或精神体验”。然而，疼痛的某些例子没有可感知的原因。例如，精神性疼痛，包括由于心理因素或时断时续的综合征而造成现存身体疼痛的加重，患有精神疾病的人在没有任何可感知的疼痛原因的证据下所感受到的疼痛。1)疼痛类型疼痛包括伤害性疼痛、神经性/神经源性疼痛、穿透痛、异常性疼痛、痛觉过敏、感觉过敏、触物感痛、感觉异常、痛觉过度、幻肢痛、心因性疼痛、痛性感觉丧失、神经痛、神经炎。其他的分类包括恶性疼痛、心绞痛疼痛和/或特发性疼痛、复杂区域性疼痛综合征I、 复杂区域性疼痛综合征II。疼痛的类型和症状不必是互斥的。这些术语意图如同IASP定义。伤害性疼痛由外周神经的特定感觉伤害感受器针对有害性刺激的反应而引起，其将伤害刺激编码为动作电位。伤害感受器通常位于Α-δ和C纤维上，其为终止于皮下、腱、 关节中以及体内器官中的游离神经末梢。背根神经节(DRG)神经元提供了外周和脊髓之间的连接位点。信号通过脊髓处理，到达脑干和丘脑部位，并最终到达大脑皮层，在这里其通常(但不总是)引发疼痛的感觉。伤害性疼痛可由可能刺激或损伤组织的许多化学、热、生物(例如，感染)或机械事件所引起，所述事件通常在引起伤害感受器中痛感活性所需的某最小强度阈值之上。神经性疼痛通常是外周或中枢神经系统的异常功能的结果，它们分别导致外周或中枢神经性疼痛。国际疼痛研究协会将神经性疼痛定义为由神经系统的原发损害或功能失调所引发或引起的疼痛。神经性疼痛通常涉及对神经系统的实际损伤，尤其是在慢性情况下。炎症伤害性疼痛通常是组织损伤及所导致的炎性过程的结果。神经性疼痛可在任何可观察的对组织的损伤的表观愈合后(例如，数月或数年)仍然持续。在神经性疼痛的情况下，来自受影响区域的感觉加工可能变得异常，并且通常不引起疼痛的无害刺激(例如，热、接触/压力)可能会引起疼痛(即，异常性疼痛)，或有害刺激可能引起应答正常疼痛刺激的夸张的疼痛感受(即，痛觉过敏)。此外，通过正常刺激可能引发与电刺痛或冲击或“手脚发麻”类似的感觉(即，感觉异常)和/或具有不愉快性质的感觉(即，触物感痛)。穿透痛是现有慢性疼痛的加剧。感觉过敏是由对刺激作出的异常疼痛反应所导致的疼痛综合征。在多数情况下的刺激是伴随升高的疼痛阈值的重复，其中所述的疼痛阈值可认为是患者可识别为疼痛的最小疼痛体验。神经性疼痛的实例包括触觉异常性疼痛(包括神经损伤后诱导的)、神经痛(例如，疱疹之后(或带状疱疹之后)的神经痛、三叉神经痛)、反射交感性营养不良/灼痛(神经外伤)、癌症疼痛的成分(例如，由癌症本身或与诸如炎症的相关病症引起的疼痛，或由诸如化疗、手术或放疗的治疗所引起的疼痛)、幻肢痛、受压性神经病变(例如，腕管综合征)、以及神经病变，诸如外周神经病变(例如，由糖尿病、HIV、慢性酒精滥用、暴露于其他毒剂(包括许多化疗剂)、维生素缺乏、以及大量其他医学症状所引起的)。神经性疼痛包括由神经系统在神经损伤后的病理性操作的表达所引起的疼痛，其中所述神经损伤由各种原因引起，例如外科手术、受伤、带状疱疹、糖尿病神经病变、腿或臂的截肢、癌症等。与神经性疼痛相关的医学症状包括外伤性神经损伤、中风、多发性硬化、脊髓空洞症、脊髓损伤和癌症等。引起疼痛的刺激通常引发炎性反应，炎性反应本身又能引起疼痛经验。在一些病症中，疼痛似乎由伤害感受及神经病因素的复杂混合引起。例如，慢性疼痛通常包括炎性伤害感受疼痛或神经性疼痛，或两者的混合。最初的神经系统功能紊乱或损伤可能引发神经的炎性介质释放，并且随后引发神经性炎症。例如，偏头痛可能表示神经性和伤害感受疼痛的混合。此外，肌筋膜疼痛可能是继发于来自肌肉的痛感输入，但异常的肌肉活性可能是神经性病症的结果。2)疼痛的症状
患者经历的疼痛症状可能或可不伴随临床医生可辨别的疼痛病症。相反，疼痛可由临床病症来证实，而患者没有感觉到症状。疼痛的症状可包括对疼痛的反应，例如，以行为改变的形式。对疼痛的示例性反应包括故意避免疼痛刺激，意欲保护身体或身体一部分不受疼痛刺激的保护反应，意欲最小化疼痛及促进愈合的反应、疼痛交流以及生理反应。交流反应可包括疼痛的发声，或脸部表情或姿势的改变。生理反应包括由植物性神经系统或内分泌系统介导的反应，例如，升高的肾上腺素和去甲肾上腺素释放、增加的胰高血糖素和/或激素和/或皮质激素的输出。可监测的生理改变包括活动的影响，诸如痉挛、抽搐、麻痹、瞳孔散大、发抖、感觉过敏和/或改变的反射。针对疼痛的生理心血管反应包括血压的改变、脉搏率和质量的改变、外周循环减少、紫绀和充血。增加的肌张力(声调)也是疼痛的症状。对疼痛作出反应的大脑功能的改变可通过各种技术监测，诸如脑电描记法(EEG)、额部肌电图描记法(FEMG)或正电子成像术(PET)。疼痛的其他症状是牵涉性痛，其为位于引起疼痛的刺激的附近部位或远离实际部位的疼痛感。通常，当神经在其原点或附近受到压迫或损伤时，会发生牵涉性痛。在这一情况下，通常在神经发挥功能的区域内感受到疼痛感，即使该损害来自其它部位。常见的实例发生在椎间盘突出中，其中源自脊髓的神经根受到相邻椎间盘物质的压迫。尽管疼痛可能从受损的椎间盘本身产生，但是在由该受压迫的神经发挥功能的区域内(例如，大腿、膝盖或脚)也能感受到疼痛。伤害感受活性是伤害性疼痛的症状。甚至在没有有意识地察觉疼痛的情况下，伤害性疼痛也可能引发撤回反射和各种自主反应，诸如苍白、发汗、心搏缓慢、低血压、头晕、 恶心和昏厥。IV.活性剂本发明的镇痛剂包括肽和拟肽。本发明的例证性活性剂是其中tat肽在其C端与 NMDAR 2B 9C融合的嵌合多肽。此类嵌合多肽具有氨基酸序列YGRKKRRQRRRKLSSIESDV (SEQ ID NO :1)。也可以使用这一序列的变体和模拟物。一些变体在该例证性序列的任一端具有侧翼序列。在每一端的侧翼序列通常具有少于20、10或5个氨基酸。如果存在侧翼序列的话，在N端，侧翼序列可以是来自HIV tat蛋白的其他残基。侧翼序列还可以是通常用于连接两个肽结构域的类型的连接子氨基酸，例如Gly(kr)4(SEQ ID N0:11), T GEK P (SEQ ID NO :12)、GGRRGGGS(SEQ ID NO 13)或 LRQRDGERP (SEQ ID NO :14)(例如，参见 Tang 等(1996)，J. Biol. Chem. 271，15682-15686 ；Hennecke 等(1998)，Protein Eng. 11， 405-410))。例如，侧翼氨基酸的数目不超过10。或者，不存在侧翼氨基酸。其他变体具有缺失的残基。例如，一些变体缺失了 NMDAR 2B 9C(KLSSIESDV, SEQ ID NO 3)的一部分或全部。一些变体缺失了 YGRKKRRQRRRKLSSIESDV (SEQ ID NO 1)序列的少于 2、3、4、5、6、7、8、9、10 或 11 个残基。一些变体具有 YGRKKRRQRRRKLSSIESDV (SEQ ID NO 1)序列的氨基酸替换。优选地，任何替换都是保守的替换，诸如在C端第三个位置由T 替换S。在一些变体中，替换的数目少于2、3、4、5、6、7、8、9或10个残基。一些变体包括插入的内部氨基酸。此类内部插入的数目通常少于2、3、4、5、6、7、8、9、10、11。优选不替换或缺失带正电的残基(例如，Y、R和K)，或者如果替换的话，用其他带正电的残基替换它们。 其他活性剂是序列YGRKKRRQRRRKLSSIESDV (SEQ ID NO 1)的拟肽，其中用非天然氨基酸替换至少一个残基和/或用非肽键替换至少一个肽键。拟肽通常具有与基础肽类似的电荷分布和三维构型，但是具有升高的稳定性或药物动力学。本发明的一些活性剂在少于2、3、4、 5、6、7、8、9或10个位点与多核苷酸YGRKKRRQRRRKLSSIESDV(SEQ ID NO 1)有差异，其中的差异可以是缺失、替换，包括非内部替换。本发明的另一例证性的活性剂是tat肽。tat肽是包括过多呈递碱性残基的tat 蛋白的片段，其具有促进所连接的分子摄入细胞或跨过屏障(例如，血脑屏障)的能力。 Tat蛋白在HIV-I、HIV-2和SIV病毒中发现。Tat肽约占据HIV-1 tat蛋白的残基35-70、 40-65或43-60。在HIV-2和SIV中，tat的这一部分一般相应于HIV-2或SIV tat蛋白的残基 70-100,75-95 或 78-91。来自 HIV-I 的代表性 tat 蛋白作为 GenBank I. D. 9629358 (NP_057853. 1)提供，其具有以下序列MEPVDPRLEPffKHPGSQPKTACTNCYCKKCCFHCQVCFITKALGISYGRKKRRQRRRAHQNSQTHQASL SKQPTSQPRGDPTGPKE (SEQID NO :15)。下划线部分称为标准tat肽。该标准tat肽是本发明所使用的优选活性剂。还提供了 tat肽的变体和模拟物。一些活性剂包括tat肽，但是缺乏独立地具有药理学活性的其他部分(例如，NMDAR 2B 9C肽)或其他已知缓解疼痛的活性剂。一些变体在该例证性序列的任一端具有侧翼序列。在每一端的侧翼序列通常具有少于20、10或 5个氨基酸。如果存在侧翼序列的话，侧翼序列可以是来自HIV tat蛋白的其他残基，诸如上面提供的序列。侧翼序列还可增加其他的功能，诸如NMDA 2B 9c或以下讨论的其他镇痛药。侧翼序列还可以是上面讨论的连接子。其他变体具有缺失的残基。一些变体缺失了 YGRKKRRQRR(SEQ ID NO :16)序列的少于2、3、4或5个残基。一些变体具有YGRKKRRQRRR(SEQ ID NO 2)序列的氨基酸替换。优选地，任何替换都是保守替换。任选地，替换保持或增加了存在的带正电残基数。在一些变体中，替换的数目少于2、3、4或5个。一些变体包括插入的内部氨基酸。此类内部插入的数目通常少于2、3、4或5个。优选地，不替换或缺失带正电的残基(例如，Y、R和K)，或者如果替换的话，用其他带正电的残基替换它们。其他活性剂是序列YGRKKRRQRRR(SEQ ID NO :2)的拟肽，其中用非天然氨基酸替换至少一个残基和/或用非肽键替换至少一个肽键。拟肽通常具有与基础肽类似的电荷分布和三维构型， 但是具有升高的稳定性或药物动力学。本发明的一些活性剂在少于2、3、4个位点与多核苷酸YGRKKRRQRRR(SEQ ID NO 2)有差异，其中的差异可以是缺失、替换，包括非内部替换。 一些活性剂在单个位点上不同。一些变体包含tat蛋白的至少7、8、9、10或12个连续的氨基酸。一些变体基本上由tat蛋白的一部分组成，或包含tat蛋白的一部分，其中至少约 60%、70%、80%、90%或100%的氨基酸是碱性的(例如，组氨酸(H)、赖氨酸(K)和精氨酸 (R)) ο 一些tat肽包含Tat蛋白的至少7、8、9、10、11、12或13个连续残基。一些活性剂包含 YGRKKRRQRRR(SEQ ID NO 2)的至少 7、8、9 或 10 个连续残基，例如 YGRKK (SEQ ID NO: 17)。一些片段保持了如所述片段的N末端那样的天然存在的酪氨酸残基(Y)。可针对摄入细胞的保持、跨血脑屏障的能力、抑制N型钙通道和/或在动物模型中抑制疼痛的能力筛选上述活性剂。此类筛选的实例在以下描述。优选的活性剂至少具有被摄入细胞的能力和在动物模型中抑制疼痛的能力。一些活性剂还具有抑制N型钙通道的能力和/或跨越血脑屏障的能力。诸如前文所述的那些肽可任选地衍生化(例如乙酰化、磷酸化和/或糖基化)，以促进与抑制剂的亲合力，促进抑制剂跨越细胞膜被转运的能力，或促进稳定性。作为特定的实例，对其中C-端第三个残基为S或T的抑制剂而言，可在使用肽之前将该残基磷酸化。本发明肽可以通过固相合成或重组方法进行合成。拟肽可以使用科学和专利文献中描述的各种操作和方法进行合成，例如Organic Syntheses Collective Volumes, Gilman 等(编辑)John Wiley & Sons，Inc.，NY, al-0beidi (1998) Mol. Biotechnol. 9 205-223 ；Hruby(1997)Curr. Opin. Chem. Biol. 1 :114-119 ；Ostergaard (1997)Mol. Divers. 3 :17-27 ；Ostresh (1996)Meth ods Enzymo1. 267 :220_234。本发明的活性剂还可与第二治疗剂、或诸如治疗剂、标记的第二部分、或第二内化活性剂连接。用于与本发明的方法联合的其他活性剂的实例在下文描述。除tat 之外的其他内化活性剂的实例包括触角足内化肽SGRQIKIWFQNRRMKWKKC (SEQ ID N0 18) (Bonfanti, Cancer Res. 57，1442-6(1997))(及其变体)、Penetratin、SynBl 和 3、 Transportan, Amphipathic、HSV VP22、gp41NLS、多聚精氨酸，和以下参考文献中所述的其他内化月太(Temsamani，Drug Discovery Today,9(23) :1012-1019,2004 ；De Coupade, Biochem J. ,390 :407-418,2005 ；Saalik Bioconjugate Chem. 15 :1246—1253，2004 ;Zhao， Medicinal Research Reviews 24(1) :1-12,2004 ；Deshayes, Cellular and Molecular Life Sciences 62 :1839-49，2005)(均引入本文作为参考)。两种或多种活性剂的偶联可以融合蛋白的形式完成，或通过偶联或缀合活性剂完成。大量这类活性剂是市售的并由S. S. Wong，Chemistry of Protein Conjugation and Cross-Linking, CRC Press (1991)综述。交联活性剂的一些实例包含J-琥珀酰亚胺基 3-(2-吡啶二硫基)丙酸酯(SPDP)或N，N' -(1，3-亚苯基)二马来酰亚胺；N，N'-亚乙基-双-(碘乙酰胺)或具有6至11个碳亚甲基桥的其他这种活性剂(其对巯基相对特异)；和1，5_ 二氟-2，4-二硝基苯(其与氨基和酪氨酸基团形成不可逆的连接)。其他交联活性剂包括P，P' -二氟_m，m' -二硝基二苯基砜(其与氨基和酚基形成不可逆的交联)；二甲基己二酸(其对氨基特异)；苯酚-1，4-二磺酰氯(其主要与氨基反应)；六亚甲基二异氰酸酯或二异硫氰酸酯，或偶氮基苯基-对-二异氰酸酯(其主要与氨基反应)；戊二醛(其与几种不同的侧链反应)和双-重氮基联苯胺(其主要与酪氨酸和组氨酸反应)。任选地，镇痛剂(例如，tat肽)不与另一镇痛剂或另一治疗剂连接或缀合。任选地，镇痛剂与不是镇痛剂的另一治疗剂缀合。任选地将活性剂(例如，tat肽)与未与其缀合或连接的第二活性剂联合施用。所述活性剂可同时或在不同的时间联合施用，例如，在彼此间隔的一小时内、一天内或一周内施用。所述活性剂可以单一制剂一起联合施用或在分开的制剂中联合施用。或者，该镇痛剂不与另一镇痛剂或其他治疗剂进行联合施用。V.所治疗的患者本发明的活性剂可施用于患有上述疼痛或有罹患上述疼痛的风险、和/或一种或多种疼痛症状的任何个体。所述个体优选为哺乳动物，诸如人。除人之外的哺乳动物包括灵长类(例如，猴)或啮齿类(例如，小鼠或大鼠)。所述方法可用于治疗或预防患有或未患有并发症或疾病易感性患者的疼痛。在一些方法中，该患者未罹患兴奋性中毒引起的病症，或最近(例如，在前一小时、一天、一周、 一月或一年)未罹患兴奋性中毒引起的病症。在一些方法中，已知或怀疑该患者患有奋性中毒引起的病症，但是不知道或不怀疑罹患兴奋性中毒的发作，或最近(例如，在前一小时、一天、一周、一月或一年)有兴奋性中毒的发作。在一些方法中，已知该患者患有兴奋性中毒引起的病症，但不确信当前经历由兴奋性中毒引起的神经变性或损伤。在一些实施方案中，该患者没有由兴奋性中毒引起的病症，所述病症由通过谷氨酸受体介导的兴奋性中毒引起，诸如NMDA受体介导的兴奋性中毒损伤。此类病症包括脊髓损伤、中风、外伤性脑损伤以及中枢神经系统(CNQ的神经退行性疾病，诸如多发性硬化、 阿尔茨海默病、肌萎缩性脊髓侧索硬化症(ALS)、帕金森病、酒精中毒和亨廷顿病。在一些方法中，该患者没有已知的兴奋性中毒介导的神经元损伤。在其他方法中， 该患者没有罹患由于疾病或病症引起的疼痛，例如，该患者正经历由外伤引起的疼痛。在其他情况下，该患者未患有无痛或不引起显著疼痛的其他医学病症。VI.治疗方法将本发明的活性剂施用于患有疼痛或有疼痛风险的患者。治疗是指施用活性剂， 导致缓解、减少、延缓、抑制和/或预防疼痛或疼痛的至少一种体征或症状。治疗包括任何的疼痛体征或症状的强度和/或持续时间的减少，即使其他体征或症状没有改变或甚至由该治疗使得其升高。在治疗的预防应用中，将至少一种活性剂施用于和普通人群相比处于升高的发展疼痛的风险或疼痛的至少一种症状上升的患者。此类患者包括已知将处于疼痛高风险的患者，例如，将进行手术或罹患与严重或慢性疼痛相关的疾病的患者，诸如糖尿病和癌症。可在疼痛发作或上升或加重之前，以缓解疼痛、降低疼痛风险或延缓疼痛发作的有效量施用活性剂。在治疗应用中，将至少一种活性剂施用于怀疑罹患或已经罹患疼痛的患者。例如以终止、或至少减轻疼痛或其并发症的至少一种症状的有效量施用该活性剂。本发明的方法可用于治疗或有效预防任何类型的疼痛，包括之前描述的那些及其任何组合。一些方法用于治疗或有效预防神经性疼痛，包括中枢神经或外周神经或两者。一些方法用于治疗慢性疼痛，例如，持续超过1、3、6或12个月的疼痛。一些方法用于治疗严重慢性疼痛。在治疗性治疗当中，任选地在疼痛发生后尽可能快地开始治疗。可以1、2、3、4、8、 16、M小时或更大的时间间隔施用多剂量。给药还可以是每天地或每周地，或以根据疼痛强度加重的不规则间隔。施用还可以基于连续的，诸如通过输注。对患有与兴奋性中毒相关的并发症的患者进行疼痛治疗时，可在该活性剂治疗兴奋性中毒神经变性的治疗时间窗口之外的时间点施用该活性剂以缓解疼痛。例如，在兴奋性中毒发作后约4、5、6、8、12、18、24、48或120小时后施用该活性剂以治疗疼痛。可通过测定该活性剂对疼痛的作用来监测患者对施用活性剂(例如，本发明的肽或拟肽)的反应。1)联合治疗本发明的活性剂可与用于治疗疼痛和/或用于治疗与疼痛相关的潜在疾病的常用活性剂联合施用。可同时或在不同的时间分开施用该两种活性剂。或者，两种活性剂可彼此相连形成双功能活性剂。A)活性剂的联合可与本发明的活性剂一起施用的镇痛剂的一些实例包括芋螺毒素和醋酸普兰林肽。芋螺毒素包括抑制神经和肌肉的乙酰胆碱受体的α-芋螺毒素；抑制电压依赖性钠通道失活的S-芋螺毒素；以及钾通道的κ-芋螺毒素；抑制肌肉中电压依赖性钠通道的μ-芋螺毒素；或优选抑制N型电压依赖性钙通道的ω-芋螺毒素(阿坎酸)；以及该天然存在的肽的合成衍生物。优选的芋螺毒素包括ω-芋螺毒素-GVIA、ω-芋螺毒素-MVIIA(也成为SNX-111、齐考诺肽和阿坎酸)、具有比阿坎酸更好的治疗指数的 AM336 (ω -芋螺毒素-CVID)、以及huwentoxin-I。其他有用的镇痛剂包括能与各种疼痛相关受体结合的肽配体、或其活性片段或衍生物。实例包括α-内啡肽、内吗啡肽-1、内吗啡肽-2、皮啡肽、β-酪朊吗啡肽(牛或人)、吗啡感受素、亮氨酸脑啡肽、甲硫氨酸脑啡肽、 DALDA、以及PL107、P物质、速激肽、神经激肽、前列腺素、缓激肽、血清素、神经营养因子、趋化因子、肉毒毒素、prokineticin以及NKl受体拮抗剂；其一部分描述于US 2006-0105947 和US6759520中，其在此全文并入本文作为参考。可与本发明的活性剂一起施用的小分子镇痛剂的实例包括NSAID、COX 2抑制剂、 C0X-3抑制剂、iNOS抑制剂、PAR2受体拮抗剂、精神抑制剂、阿片类、N-乙酰胆碱受体激动剂、甘氨酸拮抗剂、辣椒素受体拮抗剂、神经激肽拮抗剂降钙素基因相关肽拮抗剂以及环氧合酶(COX)-抑制性一氧化氮供体(CINOD)。其他镇痛药包括甲基吗啡、维柯丁(Vicodin)、 吗啡、德美罗、羟可酮、盐酸丙氧酚和丙氧酚。其他镇痛药靶向于任意的以下离子通道或受体钙通道(例如，L-型和/或 N-型)、酸敏感性离子通道家族(ASIC) (Waldmann等，1997) ；P2X家族的ATP-敏感性离子通道(Chen等，1995 ；Lewis等，1995 ；Chessel等，2005)；伤害感受器特异性TTX-不敏感Na 通道(Nav 1. 8 和 Navl. 9) (Akopian 等，1996 ；Dib-Hajj 等，2002)；辣椒素受体诸如 TRPVl ； 烟碱型乙酰胆碱受体；阿片受体(例如μ、S或κ)受体)；阿片样受体(例如，0RL-1) ；P 物质通过其起作用的NKl受体；以及细胞外疼痛介质的其他受体，所述介质诸如前列腺素、 缓激肽、血清素、腺苷、神经营养因子、ΑΤΡ、蛋白酶、趋化因子和prokineticin，其活化可引起外周伤害感受器的敏化。B)用于疼痛相关疾病的联合治疗本发明的活性剂(例如，tat肽)还可与用于治疗疼痛相关疾病的治疗剂联合施用。该治疗剂和镇痛剂可作为分开的药物或连接在一起(例如，作为融合蛋白)施用。可在此类联合治疗中使用的治疗剂包括醋酸亮丙瑞林、胰岛素、催产素、exendin-4，、甲状旁腺激素、降钙素、恩夫韦肽、依替巴肽antegrilin)、DDAVP、奥曲肽或醋酸普兰林肽，或其活性片段或衍生物。许多疾病可与疼痛相关。例如，可导致慢性疼痛的疾病包括糖尿病、关节炎(例如，骨关节炎、类风湿关节炎和青少年慢性关节炎)、癌症或化疗的毒性作用、纤维肌痛、带状疱疹、肠易激综合征、血管问题或镰状细胞病。与偶发的一般疼痛相关的疾病包括风湿性多肌痛、臆想病、抑郁症、糖尿病、 恶性贫血、镰状细胞病和梅毒。与神经性疼痛相关的疾病包括神经痛(例如，三叉神经痛、不典型面痛以及由带状疱疹或疱疹引起的带状疱疹神经痛)、外周的神经病、 Charcot-Marie-Tooth病、弗里德赖希共济失调、糖尿病(例如，糖尿病性神经病变)、饮食缺陷(尤其维生素B-12)、过度的酒精使用(酒精性神经病变)、尿毒症(来自肾衰竭)、癌、 艾滋病、肝炎、科罗拉多蜱传热、白喉、格-巴二氏综合征、没有发展为艾滋病的HIV感染、麻风病、莱姆病、多发性结节性动脉炎、类风湿关节炎、结节病、舍格伦综合征、梅毒、系统性红斑狼疮，以及暴露于有毒化合物。与炎性疼痛相关的疾病包括㈧关节炎疾病，例如类风湿关节炎；青少年慢性关节炎；系统性红斑狼疮(SLE)；痛风性关节炎；硬皮病；骨关节炎；银屑病关节炎；强直性脊柱炎；莱特尔氏综合征(反应性关节炎)；成年斯蒂尔病；来自病毒感染的关节炎；来自细菌传染的关节炎，例如，淋病性关节炎和非淋病性细菌性关节炎(脓毒性关节炎)；三级莱姆病；结核性关节炎；以及来自真菌感染的关节炎，诸如酵母病；(B)自身免疫疾病，例如格-巴二氏综合征、桥本甲状腺炎、恶性贫血、艾迪生病、I型糖尿病、系统性红斑狼疮、皮肌炎、舍格伦综合征、红斑狼疮、多发性硬化、重症肌无力、莱特尔氏综合征和格雷夫斯病。(C) 结缔组织病，例如脊椎关节炎、皮肌炎和纤维肌痛；(D)损伤引起的炎症；(E)感染，例如结核病或间质性角膜炎；以及(G)关节炎症，例如滑囊炎或肌腱炎。头疼的类型包括肌肉的/ 肌源性头痛、血管性头痛、牵引性或炎症性头痛、丛集性头痛、激素性头痛、反跳性头痛或慢性鼻窦炎头痛。躯体疼痛可与以下相关过度的肌肉收缩、反复运动疾病、诸如多肌炎的肌肉疾病、皮肌炎、狼疮、纤维肌痛、风湿性多肌痛，以及横纹肌溶解、肌痛、感染诸如肌肉脓肿、旋毛虫病、流行性感冒、莱姆病、疟疾、落矶山斑疹热、禽流感、普通感冒、社会获得性肺炎、脑膜炎、猴痘、严重急性呼吸综合征、中毒性休克综合征、旋毛虫病、伤寒，以及上呼吸道感染。 内脏痛可与诸如以下的疾病相关肠易激综合征、慢性功能性腹痛(CFAP)、功能性便秘、功能性消化不良、非心脏胸痛(NCCP)和慢性腹痛、慢性胃肠炎，例如胃炎、炎性肠病，例如克罗恩病、溃疡性结肠炎、微观结肠炎、憩室炎和肠胃炎；间质性膀胱炎；肠局部缺血；胆囊炎；阑尾炎；胃食管反流；溃疡、肾结石、尿路感染、胰腺炎和疝。与慢性疼痛相关的许多疾病在PCT公开物WO 07/138336中得以公开，其在此全文引入本文作为参考。VII.药物组合物、剂量和给药途径可以以药物组合物的形式施用本发明的活性剂。通常在GMP条件下制备药物组合物。可以以包含下文所示的任意剂量的单位剂量形式(即，用于单次施用的剂量)提供药物组合物。可以利用常规的混合、溶解、制粒、制备糖锭剂、磨细、乳化、包囊、包埋或冻干方法制备药物组合物。尤其是，可以将本发明的冻干的活性剂用于下文所述的制剂和组合物中。可以使用一种或多种便于将活性剂加工为可药用制剂的生理学上可接受的载体、 稀释剂、赋形剂或辅料，以常规方式配制药物组合物。适合的制剂取决于所选择的给药途径施用可以是胃肠外、静脉内、口服、皮下、动脉内、颅内、鞘内、腹膜内、局部、鼻内或肌内施用。优选静脉内施用。如果期望的话(例如，疼痛位于身体的特定区域)，可局部地或区域性地将本发明的活性剂施用至该区域，例如，通过肌内注射。可任选地将该活性剂施用于CNS，例如静脉内或鞘内施用，诸如当疼痛是全身性的或涉及CNS组织时即可如此。还可以这样的方式施用活性剂，使得该活性剂与外周神经系统(例如，背根神经节)接触。用于肠胃外施用的药物组合物优选是无菌和基本上等渗的。对于注射，可将活性剂配制在水溶液，优选生理上相容的缓冲液例如汉克氏溶液、林格溶液或生理盐水或乙酸盐缓冲液中(以减少注射部位的不适)。该溶液可以含有配制剂，诸如助悬剂、稳定剂和/或分散剂。或者，该活性剂可以为粉末形式，用于在使用前用合适溶媒例如灭菌的无热原水重构。对于经粘膜施用，可以在制剂中使用对于待渗透的屏障合适的穿透剂。这种施用途径可以用于将化合物递送至鼻腔或用于舌下施用。对于口服施用，可以用可药用载体将该活性剂配制为例如片剂、丸剂、糖锭剂、胶囊、液体、凝胶、糖浆剂、浆体、混悬剂等，用于由待治疗的患者口服摄取。对于口服固体制剂，例如粉剂、胶囊和片剂，合适的赋形剂包括填充剂例如糖类，诸如乳糖、蔗糖、甘露醇和山梨醇；纤维素制品诸如玉米淀粉、小麦淀粉、大米淀粉、马铃薯淀粉、明胶、黄蓍胶、甲基纤维素、羟丙甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、和/或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)；制粒剂；和粘合剂。 需要时，可以加入崩解剂，诸如交联聚乙烯吡咯烷酮、琼脂或海藻酸或其盐诸如海藻酸钠。 需要时，固体剂型可以使用标准技术进行糖包衣或肠包衣。对于口服液体制剂诸如混悬液、 酏剂和溶液，合适的载体、赋形剂或稀释剂包括水、甘油、油、醇。另外，可以加入矫味剂、防腐剂、着色剂等。除先前描述的制剂外，还可将该活性剂配制为储库型制剂。此种长效制剂可以通过植入(例如皮下或肌内)或通过肌内注射施用。因此，例如化合物可以用合适的聚合或疏水材料(例如，作为在可接受油中的乳剂)或离子交换树脂进行配制，或配制为微溶的衍生物，例如微溶的盐。或者，可以采用其他药物递送系统。脂质体和乳剂可以用于递送活性剂。尽管通常以更大的毒性为代价，但是也可以采用某些有机溶剂诸如二甲基亚砜。另外，化合物可以使用持续释放系统进行递送，诸如含有治疗剂的固体聚合物的半透性基质。根据其化学性质，持续释放胶囊可以释放该活性剂数周直至超过100天。根据治疗剂的化学性质和生物稳定性，可以采用用于蛋白质稳定化的其它策略。如果本发明的活性剂含有带电荷的侧链或末端，它们可以以游离酸或碱或可药用盐的形式包含在任何上述制剂中。可药用盐是基本上保留游离碱的生物活性并可以通过与无机酸反应而制备的那些盐。药用盐倾向于在水性和其他质子溶剂中比相应的游离碱形式更可溶。本发明的活性剂以有效达到预期目的的量使用。治疗有效量意指活性剂的量足以消除、减少目前正在经历疼痛的体征和/或症状的患者中至少一种疼痛的体征和/或症状， 或抑制其恶化。例如，如果与对照未治疗患者群体比较，某个量显著减少在治疗的患者(人或动物)群体中的至少一种疼痛体征或症状，那么它被视为治疗有效的。如果治疗的患者个体达到比未通过本发明方法治疗的可比较患者的对照群体中的平均结果更有利的结果， 那么该量也视为治疗有效的。活性剂的预防有效量是指活性剂的量足以延迟、抑制或阻止患者中的至少一种疼痛体征或症状的发展，其中所述患者目前尚未经历体征和/或症状， 但相对于一般群体有升高的发展此种体征和/或症状的危险。例如，如果相对于未用该活性剂治疗的对照群体，用活性剂治疗的有发展疼痛症状危险的患者群体出现减少的体征或症状，那么该量视为预防有效的。提及有效量意指治疗或预防有效量。提及有效方案意指达到如上所述的预期目的所需的有效量和给药频率的组合。假设平均体重为7^g，对人合适的剂量通常少于300μπιΟ1，例如少于30μπιΟ1。有时剂量为 0. 03nmol 至 30ymol,例如 0. 03nmol 至 3ymol，或 0. 3nmol 至 600ymol,或 3nmol至60 μ mol，或30nmol至30 μ mo 1。有些剂量范围包括每个体重为75kg的患者0. 05 至500nmol活性剂的总剂量，任选地为0. 5至50nmol/患者，例如约0. 5、1、2、5、10、20或 50nmol/75kg患者。在一些方法中，每75kg患者的总剂量为1-lOnmol，例如1、5或lOnmol。 在一些情况下，每75kg患者的总剂量可以是0. I-Inmol，例如0. 1、0. 2、0. 5或0. 8nmol。在其他情况下，每75kg患者的剂量可以是lO-lOOnmol，例如20、50、80或IOOnmol0任选地， 每75kg患者的剂量少于2250nmol。任选地，每75kg患者的剂量少于75nmol。可调节剂量， 以适应体重的变化。可将上述剂量通过例如除以75kg而转换为nmol活性剂/kg体重。可通过乘以活性剂的摩尔质量(例如，Tat-NR2B9c为2519)将剂量从摩尔单位转化为克单位。在人体中使用的治疗剂的合适剂量通常少于10mg/kg，例如少于lmg/kg。 剂量有时为 1(Γ4 至 lmg/kg、1(Γ4 至 0. lmg/kg、1(Γ4 至 20μ g/kg、或 1(Γ3 至 2 μ g/kg、或 10_2 至2μ g/kg，例如50、100、150、200、500、1000或1500ng/kg。有些剂量范围包括每kg体重 10-200ng活性剂的剂量，诸如每个患者约1、5、10、20、50、80、120、160或200ng/kg。在一些方法中，剂量为2-20 μ g/kg,例如2、4、6、8、10、12、16、18或20 μ g/kg。任选地，该剂量为少于75 μ g/kg。任选地，该剂量为少于2. 5 μ g/kg。每位患者的总剂量可通过将每kg体重的剂量乘以患者体重(以kg为单位)计算得到。例如，75kg患者的总剂量可通过将上述剂量乘以75而计算得到。还可以以需要的药物代谢动力学参数表示剂量，诸如与所指出的剂量方案、施用频率和途径相当的Cmax(即，施用药物后观察到的药物在血液中的最大或“峰”浓度)、C〒
(血液中平均稳态浓度)以及AUC(即，血浆(例如血清或血液)浓度-时间曲线下的面积)。所施用的剂量依赖于所治疗的患者、患者的体重、痛苦的严重度、施用的方式和处方医师的判断。可以在可检测到症状时或甚至检测不到症状时间歇地反复治疗。可以单独或与其他药物组合提供治疗。本发明活性剂的治疗有效剂量可以提供治疗裨益而不引起实质性毒性。可以在细胞培养物或实验动物中通过标准的药学方法测定该活性剂的毒性，例如通过测定LD5tl (群体的50%致死剂量)或LD1C1C1(群体的100%致死剂量)。毒性效应和疗效间的剂量比是治疗指数。优选显示高治疗指数的活性剂，例如肽或拟肽(参见例如Fingl等，1975，The Pharmacological Basis of Therapeutics, 11 ) °VIII.钙通道如上所述，对本发明活性剂在治疗疼痛中的功效作出至少部分贡献的一种机制涉及与N型钙通道结合，尤其是通过ω-芋螺毒素GVIA阻断的神经N型通道。任选地，该活性剂与VDCC的α工亚单位结合。N型钙通道位于突触前神经末端，调节神经递质释放，包括来自初级传入伤害感受性受体的脊髓末端的那些神经递质。在药物齐考诺肽(或I^rialt，其为鸡心螺肽ω-芋螺毒素M-VII-A前体的合成形式)方面已经很好地表征了与N型通道结合的药理学作用。已将与N型钙通道的结合与多种活性联系起来，包括比由吗啡诱导的强得多的镇痛作用。N型钙通道是由a1B-(Cav2. 2)、β-和α2 δ-亚基和有时还有γ亚基组成的杂寡聚复合物。α1Β-亚基形成主要通道并由单个基因编码。存在四种023-亚基基因(α 2 δ-1-α 2 δ -4) (Snutch 等，Molecular properties of voltage-gated calcium channels. In :Voltage_gated calcium(Zamponi G 编辑)，第 61-94 页。New York :Landes Bioscience,2005. Catterall, Biochemical studies ofCa2+channels. In :Voltage-Gated Calcium (Zamponi G H车t)，H 48—60 胃。NewYork =Landes Bioscience，2005) 。
禾中在N型钙通道的高度保守性。优选将Williams 等，1992 (Science 257 (5068)，389-395 (1992)，Genebank 登录号 Q00975,物种人类(Homo Sapiens))和 Coppola 等，1994(FEBS Lett. 338(1)， 1-5(1994) ,Genebank 登录号 055017，物种小鼠(Mus Musculus))和 Dubel 等，1992 (Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α. 89(11), 5058-5062 (1992) Genebank 登录号 Q02294,物种褐鼠 (Rattusnorvegicus))描述的α 1Β-亚基N型钙通道用于筛选，包括具有与完整蛋白质相似的钙通道活性的剪接变体及其片段。在本发明的筛选方法中也可以使用与任何上述序列至少具有90%序列同一性的等位基因变体和物种变体。任选地，α 1Β亚基可与α 2(a-e)/ δ、 β 1-4和/或γ亚基组合使用。IX.筛选方法和测试法可通过多种测试法来测试或确认本发明活性剂的期望活性。通常对活性剂与对照比较来进行平行测试，并且从可检测的且优选为统计学上显著的差异(例如，相对于对照更强的结合、更强的细胞摄入、更强的疼痛减少或抑制)看出需要的活性。1.测量对靶标(例如，钙通道)的结合可使用已知结合此类通道的经标记的肽(例如齐考诺肽)，通过竞争结合测试法， 针对与目标靶点(例如，N-型钙通道)的结合而筛选活性剂。N型钙通道可以以纯化的形式提供，或从细胞中天然表达或重组表达。如果以纯化的形式提供，则可任选地将N-型钙通道固定在珠子上或微量滴定孔中。与经标记的肽和所测试的活性剂温育后，和钙通道结合的标签的量与所测试的活性剂结合钙通道的能力成反比。可在微量滴定板的孔中，在高通量基础上进行该测试法。还可以包括阴性对照和阳性对照。阴性对照可以是溶媒。阳性对照可以是已知结合N-型钙通道的肽的未标记的形式。2.测量靶标的体外抑制可以针对其抑制靶标活性，例如抑制N型钙通道介导的离子电流的能力来筛选活性剂。抑制表示钙通道运载的所测量的离子电流的统计学显著的降低。所测量电流的这类降低应当大于20%降低，更优选大于30%降低，更优选大于40%降低。可以例如在表达钙电流的背根神经节神经元中进行全细胞膜片钳记录来测量抑制。背根神经节(DRG) 的培养物从妊娠13-14天的Swiss小鼠制备。简言之，将DRG切片并在37°C进行20分钟胰蛋白酶消化，将其机械解离并接种在用聚-D-赖氨酸涂覆的盖玻片上。将其在无血清的 MEM(Neurobasal MEM, B-27-Gibco Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA)巾士音#。 3—5 天后，添加10 μ M FUDR溶液来抑制神经胶质增殖。在潮湿的5% CO2空气中于37°C下维持培养物，并且一周换液两次。接种10-14天后在室温下进行全细胞记录。电生理学记录用 Axopatch-IB放大器(Axon Instruments, Foster City, CA)以电压钳模式进行全细胞记录。使用两阶段钳(PP83 ；Narishige，东京，日本)，从薄壁的硼硅玻璃(直径1. 5mm ；World Precision Instruments, Sarasota，FL)构建电阻为 3—5ΜΩ 的记录电极。使用 pClamp 9 (Axon Instruments)程序将数据数字化、过滤QkHz)并在线获得。向移液管中填充含有(mM) =CsCl 110、MgCl2 3,EGTA 10,HEPES 10,MgATP 3,GTP 0· 6 的溶液。用 CsOH 将 pH 调节至 7. 2。浸浴溶液(bath solution)在 pH(NaOH) 7· 4 下含有(mM) =CaCl2 UBaCl2 10,HEPES 10、TEA-Cl 160、葡萄糖10、TTX 0. 0002。使用40ms去极化脉冲，将全细胞电流从_60mV的保持电位激发至+20mV，每1 应用一次。为了测试使用依赖性的抑制，使用IOms去极化脉冲， 将电流从-60mV的保持电位激发至+20mV，分别每0. 02s(50Hz)、0· 05s(20Hz)、0· Is(IOHz) 或15s(0. 07Hz)应用一次。可通过检查使用该靶标的特定抑制剂的其他抑制来鉴定测试活性剂抑制靶标的性质，如在实施例中描述的那样。3.体内镇痛活性评估可针对在动物中预防或缓解疼痛来筛选活性剂。人是哺乳动物的优选类型。还可使用除人之外的其他哺乳动物，诸如灵长类(例如，猴)或啮齿类(例如，小鼠或大鼠)。哺乳动物(例如，啮齿类动物)的针对疼痛的伤害感受测试包括甩尾(脊椎介导的伤害性反射)测试(D ‘ Amour 等(1941)，J. Pharmacol. Exp. Ther. 72 :74-79)、热板试验、Randall-Selitto 测试(Swingle 等(1971)，Proc. Soc. exp. Biol. Med. 137 :536-538) 以及夹尾试验。此类测试可用于评估对不同种类的有害刺激的伤害感受阈值，诸如对热 (甩尾测试、热板试验、Hargreaves缩爪测试，以及通过将尾或后爪短暂浸入热水中)的阈值；或对刺穿刺激的触觉阈值，例如通过用于异常性疼痛的Von Frey测试，J Neurosci Methods. 1999 Mar 1 ；87 (2) 185-93。可通过用棉签轻击后爪的跖面评估动态异常性疼痛， 其中如果动物在开始击打8秒内对棉花刺激作出反应，则认为存在动态异常性疼痛。可测量针对有害化学试剂的疼痛反应，例如通过腹膜内注射稀醋酸后监测腹部蠕动，以及通过将辣椒素添加至饮用水后的厌饮测试(其可用于评估三叉神经伤害感受性)。用于炎性疼痛的测试包括福尔马林爪测试(Tjolsen等(1992)，Pain 51 :5_17)、 用于福尔马林诱导的脸部疼痛测试(Clavelou等(1989)，Neurosci. Lett. 103 :349-353)、 以及施用诸如鹿角菜胶、辣椒素或缓激肽的物质后的爪测试。可通过各种模型模拟关节炎症状，包括将例如鹿角菜胶、尿酸或芥末油的试剂或佐剂注射至各种关节中。可通过腹膜内注射诸如缓激肽、乙酰胆碱、醋酸或苯醌的物质来构建内脏疼痛模型。链佐星 (STZ)-诱导的糖尿病神经病模型在3周内诱导了可重复的机械性异常疼痛(Chen和Pan， J Neurophysiol 87 :2726-2733,2002) 用于外周神经损伤导致的神经性疼痛的测试包括慢性缩窄性损伤(例如，Bennet 和Xie，坐骨神经结扎模型，Pain 33 :87-107)；部分神经结扎(Seltzer等，1990)、脊神经横切或结扎(Lombard等，1979 ；Kim & Chung，1992)、神经冻伤(deleo等，1994)、坐骨神经缺血(Kupers等，1998)。常用的测试是触觉异常性疼痛测试(Chaplan等(1994) J. Neurosci. Meth. 53 :55-63)。紫杉醇诱导的神经性疼痛不含有炎性成分。对某些外周神经性病症特异的模型包括三叉神经痛(Vos和Maciewicz，1994)、糖尿病神经病(Burchiel等，1985)以及长春新碱神经病(Aley等，1996)的动物模型。神经瘤模型(Wall等，1979)可反映截肢造成的幻痛。由脊髓损伤产生的疼痛的动物模型包括脊髓横切或部分横切(Levitt &Levitt, 1981)、辐射诱导的局部缺血模型(Hao等.1991)、采用脊柱内注射使君子酸盐的兴奋性中毒模型(Yezeierski & Park, 1993)，以及挫伤模型(Siddall 等，1995)。在人类中，可应用各种测试评估疼痛和测试活性剂对疼痛的效果。可在施用之前及之后评估任意一种或多种疼痛症状，包括上面讨论的那些。在施用后一种或多种症状的任何显著性降低表明该活性剂是治疗有效的。已设计了多种疼痛问卷和评分来评估患者疼痛，其应用了不同的方法。可以单次测量(仅为强度)或应用多次测量(持续时间和强度) 来评估疼痛。可在英国国立卫生图书馆启动的“Do Once and Siare”(DOaS)的痛觉测定计划报告草稿的附录35中找到疼痛评级系统列表，其在此全文引入本文作为参考。有用的疼痛评分包括视觉模拟评分法、McGill疼痛问卷、以及描述词差别评分法。此类疼痛评级系统和评分法在以下参考文献中描述，它们各自都全文引入本文作为参考^Measurement of pain”，J. Rheumatol. 9(5) :768-9. PMID 6184474，Melzack R(1975 年 9 月)；"The McGill Pain Questionnaire :major properties and scoring methods", Pain 1(3) :277-99, PMID 1235985,Gracely RH,KwiIosz DM(1988 年 12 月)；“The Descriptor Differential Scale :applying psychophysical principles to clinical pain assessment Pain 35(3) :279-88, PMID 3226757 ；"The subjective experience of acute pain. An assessment of the utility of lOindices”，Clin J Pain 5(2) :153-9, PMID 2520397， Hartrick CT, Kovan JP, Shapiro S (2003 年 12 月)(不完全引用？)。还可应用测痛计测量患者对疼痛的敏感性(疼痛阈)。有用的测痛计包括声波痛觉计(palpometer)、控压痛觉计、基于激光的测痛计镇痛仪(IITC Life kiences)、基线测痛仪(Kom Kare公司)、测量皮肤对疼痛敏感性的毕恩斯特勒姆痛觉计、或测量上腹部敏感性的博阿斯痛觉计。4.测量活性剂的内摄作用可在动物中针对内摄或转运活性测试活性剂。例如可以标记活性剂(如tat肽)， 然后注射进动物诸如小鼠中。例如，腹膜内或静脉注射是合适的。注射后约1小时，处死小鼠，用固定液(盐水中的3%多聚甲醛、0.25%戊二醛、10%蔗糖、10U/mL肝素)灌注。然后取出脑，冷冻并切片。使用共聚焦显微镜分析切片的荧光。从荧光测定内摄活性，任选地相对于阳性对照和阴性对照测定。合适的阳性对照是包含标准tat肽序列的活性剂。合适的阴性对照是经荧光标记的没有tat肽的活性剂。也可以使用未标记的溶媒作为阴性对照。可在细胞培养物中进行类似实验，以测试tat变体(参见US20030050M;3)。对皮层神经元培养物施用任选地与活性肽连接的、经荧光标记的变体tat肽。施用后使用荧光显微镜在数分钟内测定摄入量。可如同动物摄入实验所述，相对于阳性和阴性对照来测定提高的摄入量。
实施例实施例1 对Tat_NR2B9c的副作用进行筛选Tat-NR2B9c是标准tat肽和以前显示出对大鼠中风模型有效的KLSSIESDV (SEQ ID NO 3)的嵌合肽。本实施例针对抑制已知配体与多种受体蛋白质结合的能力筛选肽 Tat-NR2B9c。所筛选的受体的实例包括N型钙通道。筛选作为竞争性结合测试法进行，其中在存在未经标记的配体以提高灵敏度的情况下，10 μ M浓度的未经标记的Tat-NR2B9c与1125标记的配体竞争结合其受体。在10 μ M 下，Tat-NR2B9c显示100%抑制放射性标记的ω -芋螺毒素GVIA与N型钙通道的结合。在该浓度下iTat-NI^Bgc还显示对IL-8/IL-8RB的80%的抑制。实施例2 标准Tat肽的诱变标准tat肽和有效的镇痛药的序列YGRKKRRQRRRKLSSIESDV(Tat-NR2B9c)(SEQ ID NO 1)(IGKGAKCSRLMIDCCTGSCRSGIiCG (齐考诺肽)(SEQ ID NO 19)测试了 Tat_NR2B9c变体对N型钙通道的抑制。这些变体包括在Tat_NR2B9c第1 位上Y残基突变为F的变体，以及在Tat-NR2B9c的一串碱性残基上具有修饰的变体。每种肽以ΙΟΟμΜ施用。测试了以下的肽(Ca2+电流被显示为每种肽后面的百分比)1990 TAT :YGRKKRRQRRR(SEQ ID NO 2) (57+/-1. 6 % (n = 5)) ；1991 2B9c :KLSSIESDV(SEQ ID NO 3) (94 +/" 1. 7 % (η = 5)) ； 1992 Tat-NR2B9c-AA ；YGRKKRRQRRRKLSSIEADA (SEQ ID NO 4) (74+/-2. 4 % (n = 6)) ； 1993F_Tat_NR2B9c :FGRKKRRQRRRKLSSIESDV(SEQ ID NO :5) (91 +/"I. 6% (n = 5)) ； 1994 Tat_NR2B9c K 至 A :YGRKKRRQRRRALSSIESDV (SEQ ID NO :6) (77+/-1. 8% (n = 7)) ； 1995 F_Tat_NR2B9c K 至 A :EGRKKRRQRRRALSSIESDV (SEQ ID NO: 7) (97+/-0. 2% (n = 6)) ；1976 :YGRKKRRQRRRKLSSIESDX(SEQ ID NO :9)其中 X =正缬氨酸 (66+/-3. 4 % (η = 6)) ；1977 :YGRKKRRQRRRKLSSIESDX(SEQ ID NO :10)其中 X = L-叔丁基-甘氨酸(65+/-5. 1% (η = 5)) ； 1987 :Tat_NR2B9c 的 D-异构体(82+/-2. 2% (η = 6))。 Tat-NR2B9c (68+/-1. 7% (η = 7)) 0数据被表示为平均值+/_标准误差。还在以下的膜片钳测试法中测试了肽。针对其抑制N-型钙通道介导的离子电流的能力来筛选肽，这通过在表达N-型钙电流的背根神经节神经元中应用全细胞膜片钳记录来进行。背根神经节(DRG)的培养物从妊娠13-14天的Swiss小鼠制备。简言之，将DRG 切片并在37°C下进行20分钟胰蛋白酶消化，将其机械解离并接种在用聚-D-赖氨酸涂覆的盖玻片上。将它们在无血清 MEM(Neurobasal MEM，B-27-Gibco Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA)中培养。3-5天后，添加10 μ M FUDR溶液来抑制神经胶质增殖。在潮湿的5% CO2空气中于37°C下维持培养物，并且一周换液两次。接种10-14天后在室温下进行全细胞记录。电生理学记录用Axopatch-IB放大器(Axon Instruments,FosterCity,CA)以电压钳模式进行全细胞记录。使用两阶段钳(PP83 ；Narishige，东京，日本)，从薄壁的硼硅玻璃 (直径 1. 5mm ;World Preeision Instruments, Sarasota,FL)构建电阻为 3—5ΜΩ 的记录电极。使用pClamp 9 (Axon Instruments)程序在线将数据数字化、过滤QkHz)并获取。向移液管中填充含有(mM) :CsCl 110、MgCl23、EGTA 10,HEPES 10,MgATP 3,GTP 0. 6 的溶液。 用 CsOH 将 pH 调节至 7. 2。浸浴溶液在 pH(NaOH) 7. 4 下含有(mM) =CaCl2 UBaCl2 10,HEPES 10、TEA-Cl 160、葡萄糖10、TTX 0. 0002。使用40ms去极化脉冲，将全细胞电流从_60mV的保持电位激发至+20mV，每1 应用一次。为了测试使用依赖性的抑制，使用IOms去极化脉冲， 将电流从-60mV的保持电位激发至+20mV，分别每0. 02s(50Hz)、0· 05s(20Hz)、0· Is(IOHz) 或 15s (0. 07Hz)应用一次。结果显示于图2中。上部分显示存在所示肽时全细胞钙电流的平均值+/_标准误差，其相对于应用所述肽之前该细胞中的全细胞钙电流进行标准化。图2的下部分显示代表性的全细胞示踪，上部分中的平均值来自于所述代表性全细胞示踪。数据显示 Tat-NR2B9c的tat部分可介导N型钙通道的抑制。Tat_NR2B9c的N-端酪氨酸的突变几乎完全解除了该嵌合肽抑制N型钙通道的能力。Tat-NR2B9c的C-端部分(KLSSIESDV (SEQ IDNO 3)), F-Tat-NR2B9c或1994Tat_NR2B9c K至A显示对N型钙通道活性无显著抑制。肽 1992、1994和1987与单独的tat相比显示通道活性的显著提高，但仍然显示N型钙通道活性量的一些降低。所有这些肽与单独的标准Tat相比提供了降低的对N-型钙通道的结合， 这表明包含这些Tat变体序列之一的药物的治疗指数升高。实施例3 用Tat_NR2B9c对外周神经损伤后疼痛超敏件的剂量依赖件逆转这一实施例证实了静脉内施用Tat_NR2B9c如何逆转成年雄性斯普拉格-道利大鼠在外周神经损伤后的疼痛超敏性，其中以低剂量静脉内施用Tat-NR2B9c(约IOOpmol/大鼠)。出人意料地，更高剂量静脉内施用Tat-NR2B9c (约10mg/kg)没有产生疼痛超敏性的任何明显逆转。在这些实验中，应用聚乙烯套管方法(Mosconi T，Kruger L.，Pain 1996,64 37-57)诱导坐骨神经的慢性缩窄性损伤。在氟烷麻醉下，以中至高水平暴露成年雄性斯普拉格-道利大鼠的左坐骨神经。纵向分开聚乙烯套管(PE90管，2mm长)，并将其植入坐骨神经周围，并允许动物恢复适当的时间，例如10-14天。将含有溶解的Tat-NR2B9c的无菌等渗盐水、或仅有盐水的对照注射至尾静脉中，其中使动物处于短暂的氟烷麻醉下。通过测试动物的缩爪阈值测量对疼痛的敏感性。应用Von-Frey细丝(Stoelting Co.，Wood Dale, IL, USA)评估对机械刺激的缩爪阈值。将动物置于具有塑料底板的塑料笼中。为测试引起所刺激的爪收缩所需的触觉阈值，以递升次序、与后爪跖面垂直地应用von Frey细丝(0. 008-15. 18g)。每一细丝应用5次，并且当在5次施用细丝中有3次阳性反应则确定为缩爪阈值。为避免组织损伤，将截止阈值指定为15. ISgo如图3A所示，静脉内施用Tat_NR2B9c看上去逆转了外周神经损伤后的疼痛超敏性。在用于产生外周神经的手术操作之前(术前)测试缩爪阈值。在手术后10-14天(术后)，以及在即将施用Tat-NR2B9c或盐水溶媒对照之前，所有动物均显示出缩爪阈值的显著降低，这是由外周神经损伤引起的疼痛超敏性的特征。用Tat-NR2B9C(100pmol/动物； η = 15只动物；实心柱)或用盐水溶媒(n = 9只动物；空心柱)。女与溶媒对照相比较ρ < 0. 05。所述柱是平均值士 SEM。图:3Β公开了通过Tat_NR2B9c逆转疼痛超敏性的时间进程。该图显示了施用 Tat-NR2B9c后2小时内用Tat_NR2B9c (IOOpmol/动物，i. v.)治疗的动物的平均缩爪阈值 (士SEM)。在即将施用Tat-NR2B9c之前(时间=0)，以及在60,90和120分钟后测量缩爪阈值。* -与t = 0相比较ρ < 0. 05。如图3C所示，静脉内施用高剂量的Tat_NR2B9c(10mg/kg i. v.)对外周神经损伤后的疼痛超敏性没有作用。在用于产生外周神经的手术操作之前(术前)测试缩爪阈值。 在手术后10-14天，以及在即将施用Tat-NR2B9c之前，所有动物(n = 4)均显示出缩爪阈值的显著降低(右图中t = 0)，这是由外周神经损伤引起的疼痛超敏性的特征。与未治疗的动物相比，经治疗的动物在施用Tat-NR2B9c后60、90或120分钟后，没有显示出缩爪阈值的变化。数据为平均值士SEM。实施例4 :Tat-NR2B9c对N型Ca2i通道介导的离子电流的抑制进一步表征了 Tat_NR2B9c对N型Ca2+通道介导的离子电流的抑制。图4表征了 Tat-NR2B9c (YGRKKRRQRRRKLSSIESDV，SEQ ID 1)对 Ca2+电流抑制的程度，并与其他变体1990 TAT (YGRKKRRQRRR,SEQ ID NO 2) ； 1992 Tat_NR2B9c AA(YGRKKRRQRRRKLSSIEADA,
20SEQ ID NO 4) ；1994Tat-NR2B9c K 至 A(YGRKKRRQRRRALSSIESDV, SEQ ID NO: 6) ;1987D-Tat-NR2B9c(YGRKKRRQRRRKLSSIESDV(都为 D-氨基酸)，SEQ ID NO 8) ； 1976 (YGRKKRRQRRRKLSSIESDX,其中 X =正缬氨酸，SEQ ID NO 9)； 1977(YGRKKRRQRRRKLSSIESDX，其中 X = L-叔丁基甘氨酸，SEQ ID NO 10)进行比较。组织培养背根神经节(DRG)的培养物从妊娠13-14天的Swiss小鼠制备。简言之，将DRG切片并在37°C下进行20分钟胰蛋白酶消化，将其机械解离并接种在用聚-D-赖氨酸涂覆的盖玻片上。将它们在无血清的MEM(NeurcAasal MEM，B-27-Gibco Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA)中培养。3-5天后，添加10 μ M FUDR溶液来抑制神经胶质增殖。在潮湿的5% CO2空气中于37°C下维持培养物，并且一周换液两次。接种10-14天后在室温下进行全细胞记录。电生理学记录用 Axopatch-IB 放大器(Axon Instruments, Foster City, CA)以电压钳模式进行全细胞记录。使用两阶段钳(PP83 ；Narishige，东京，日本)，从薄壁的硼硅玻璃(直径 1. 5mm ；World Precision Instruments, Sarasota, FL)构建电阻为 3-5ΜΩ 的记录电极。使用pClamp9 (Axon Instruments)程序在线将数据数字化、过滤QkHz)以及获取。向移液管中填充含有(mM) :CsCl 110、MgCl2 3、EGTA 10、HEPES 10、MgATP 3、 GTP0. 6的溶液。用CsOH将pH调节至7. 2。浸浴溶液在pH(NaOH) 7. 4下含有(mM) =CaCl2 1、BaCl2 10、HEPES 10、TEA-Cl 160、葡萄糖 10、TTX 0.0002。使用 40ms 去极化脉冲，将全细胞电流从_60mV的保持电位激发至+20mV，每1 应用一次。为了测试使用依赖性的抑制，使用IOms去极化脉冲，将电流从_60mV的保持电位激发至+20mV，分别每0. 02s (50Hz)、 0. 05s (20Hz)、0. Is (IOHz)或 15s (0. 07Hz)应用一次。数据分析数据被表示为平均值+/_标准误差。图4证明了在背根神经节神经元(其主要表达N型Ca2+通道)中，浓度递增的含完整Tat序列(YGRKKRRQRRR(SEQ ID NO :2))的所有肽都显著地抑制Ca2+电流。这表明I^at 序列中的残基抑制N型Ca2+通道电流的特性。图5A和B证明了 N型Ca2+通道的Tat_NR2B9c与ω芋螺毒素(1 μ Μ，一种选择性 N型Ca2+通道阻断剂)或硝苯地平(选择性L-型Ca2+通道阻断剂)的组合对DRG电流的抑制。ω芋螺毒素抑制Ca2+电流，并且一旦N-通道被阻断，Tat_NR2B9c (100 μ Μ)不能提供额外的抑制(图5Α，左侧)。类似地，在Tat-NR2B9c抑制离子电流后添加芋螺毒素时，未观察到额外的电流抑制(图5A，右侧)。另外，选择性L型Ca2+通道阻断剂硝苯地平显著地影响了存在(100 μ M，细胞内)或不存在Tat_NR2B9c时记录的Ca2+电流的大小，如图5B中所示。图5B的左侧部分显示钙电流的平均值+/_标准误，而右侧是来自单个实验的全细胞电流的代表性示踪。图6证明Tat_NR2B9c对Ca2+电流的阻断不是频率依赖性的。使用100 μ M Tat-NR2B9c测试其使用依赖效应。+20mV去极化脉冲激发的电流显示强的频率依赖性衰减。然而，频率的升高(0.07，10，20，50Hz)未提高Tat_NR2B9c对该电流的抑制作用。该图显示在不同频率下的一个代表性DRG神经元中记录的Ca2+电流。这些电流具有在数分钟后衰减的自然趋势，并且频率的升高未影响Tat-NR2B9c对电流的抑制(代表性的η = 4)。图7证明在DRG神经元中Tat_NR2B9c以不依赖于电压的方式抑制Ca2+电流，并且该抑制涉及N型Ca2+通道。从-60mV的保持电位起，使用50ms电压钳从-40到+50mV的步进来引发电流。总之，图4-7显示Tat_NR2B9c能够抑制DRG中的电流，例如由N型Ca2+通道介导的钙电流。此外，包含Tat序列的其他肽也能够抑制电流。这些数据还显示该抑制涉及N 型Ca2+通道，并且不依赖于频率和电压。虽然为了清晰理解的目的详述了上面的发明，但是，很明显可以在所附权利要求的范围内实施某些修改。上文引用的所有出版物、文件、登录号等在此为了所有目的以其整体引入作为参考，其程度就如同单独地指明这样引用每一出版物、文件、登录号等一样。如果在不同时间有一种以上的序列版本与同一登录号相关，则提及该登录号时指的是在提交本申请时与其相关的版本，也溯及包含该登录号的任何在先申请时与其相关的版本。除非上下文中明显不同，否则任何方面均可与任何其他方面组合起来要求保护， 或如同不与另一方面组合的那样要求保护。所述方面可以例如是步骤、特征、性质、要素、 模式、变量、测量、量或实施方案。除非上下文中明显不同，否则任何表明某方面是非必须的、或任选的、或示例性的语言旨在提供对权利要求的充分说明支持(例如，35U. S. C. 112 或EPC的Art. 83和84)，其包括“排他性”或“排除性”语言。排他性语言包括将权利要求具体且明确地限定为所讨论方面的任意术语。“排除性”语言例如明确地将所讨论的方面从权利要求的范围中排除。“排他性”或“排除性”术语的非限制性实例包括“仅”、“只”、
“由......组成”、“单独”、“无”、“没有”、“不”、“不能”、“不存在”或“排除”或其变体。表明
某方面是非必须的、或任选的、或示例性的语言的非限制性实例包括诸如以下的术语“变通方案”、“任选地”、“包括”、“能”、“可以”、“例如”、“实施方案”、“方面”、“如果”或其变体。
权利要求
1.具有包含YGRKKRRQRRR(SEQID NO 2)的氨基酸序列的tat肽或其具有少于4个氨基酸缺失、替换或插入的变体或所述tat肽的拟肽用于治疗或有效预防疼痛的用途。
2.权利要求1的用途，其中所述的tat肽具有包含YGRKKRRQRRRKLSSIESDV(SEQID NO: 1)的氨基酸序列，或所述序列的具有少于10个缺失、替换或插入的变体，或其拟肽。
3.上述权利要求任一项的用途，其以低于lmg/kg的剂量施用。
4.上述权利要求任一项的用途，其以10_5至lO—mg/kg的剂量施用。
5.上述权利要求任一项的用途，其中所述tat肽不与NMDAR2B 9C连接。
6.上述权利要求任一项的用途，其中所述tat肽没有与PSD95-NMDAR相互作用的抑制剂连接。
7.上述权利要求任一项的用途，其中所述tat肽与NMDAR2B 9C连接。
8.上述权利要求任一项的用途，其中外周地施用所述肽。
9.上述权利要求任一项的用途，其中鞘内地施用所述肽。
10.上述权利要求任一项的用途，其中所施用的肽不以可检测的量进入CNS中。
11.上述权利要求任一项的用途，其中以主要导致N型钙通道的抑制、而非PSD-95与 NMDAR或NOS相互作用的抑制的方案施用所述肽。
12.上述权利要求任一项的用途，其中所述剂量低于lmg/kg。
13.上述权利要求任一项的用途，其中所述剂量是10_5至lO—mg/kg。
14.上述权利要求任一项的用途，其中所述患者没有经历中风、癫痫、缺氧、CNS的外伤、阿尔茨海默病以及帕金森病。
15.上述权利要求任一项的用途，其中所述疼痛位于外周部位。
16.上述权利要求任一项的用途，其中所述疼痛位于CNS。
17.上述权利要求任一项的用途，其中外周地施用所述肽或拟肽。
18.上述权利要求任一项的用途，其中鞘内地施用所述肽或拟肽。
19.上述权利要求任一项的用途，其中通过所述肽或拟肽与N型钙通道的结合来实现疼痛的治疗或预防。
全文摘要
本发明提供了用于治疗疼痛的活性剂。示例性的活性剂包含逆转录病毒Tat蛋白的一部分，或由其组成。一个此类活性剂是肽Tat-NR2B9c。该肽以前已经作为通过抑制PSD95与NMDA受体和/或NOS的相互作用来抑制中风及类似病症的损伤效应的活性剂而被描述。本申请提供了数据显示Tat-NR2B9c肽可有效地缓解疼痛。可在低于抑制PSD95与NMDAR或NOS的相互作用所需剂量的肽剂量下获得疼痛的缓解。
文档编号A61K38/00GK102202677SQ200980143194
公开日2011年9月28日 申请日期2009年9月2日 优先权日2008年9月3日
发明者J·D·加尔曼, M·P·贝尔马里斯, M·W·萨尔特, M·蒂米安斯基, P·S·卢 申请人:诺诺公司, 阿尔伯维塔公司