专利名称：一种肿瘤化疗药物的蛋白增敏剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物药物学领域，更具体地讲，本发明涉及一种针对肿瘤化学治疗的新型增效物质。
背景技术：
多年来经过对肿瘤不懈努力的研究，人们发现肿瘤细胞产生的耐药性是治疗肿瘤的主要绊脚石。统计表明，肿瘤年死亡率中，约90%以上的肿瘤患者死因都与耐药有关。化学药物在杀死肿瘤细胞的同时，也存在细胞毒性，损害正常组织器官，降低机体免疫功能等毒副反应，影响化疗效果，甚至被迫放弃化疗。目前，为了改善化疗和放疗效果，研究主要集中在逆转药物或增敏药物上，希望通过耐药的发生机制，寻找可能应用于临床的肿瘤多药耐药逆转药物，以期对肿瘤的有效治疗取得重大突破。现在，人们已经从基因分子水平研究了若干耐药的产生机制，尽管目前发现的癌症治疗的潜在靶标不少，但是我们只知道部分在癌症异常表达的一些分子及其维持癌症的复杂的途径交叉，例如生存素(Survivin)就是目前肿瘤治疗靶标的典型代表，在各种癌症中特异性高表达，而在成人终末分化组织中一般不表达或低表达。Survivin参与细胞凋亡的抑制、细胞周期的调控、血管的再生，同时还参与多个途径中的调节、转录和修饰基因直接或间接相互作用，参与肿瘤细胞的耐药机制，是一个重要的节点蛋白。生物类药物由于其特异性、低毒、以其对肿瘤耐药机制的有效干扰，而成为有效解决肿瘤多药耐药性的新的希望。公开号CN 1710080A利用质粒构建并重组腺病毒，蛋白质序列53位氨基酸D突变为A，证明该发明可以在多个细胞中强烈诱导细胞凋亡；公开号CN 1869042A利用靶向 survivin基因的siRNA阻断肿瘤细胞内正常survivin的表达，产生对肿瘤细胞促凋亡能力。以上专利均属于核酸水平抑制survivin正常功能，在机体内稳定性低，容易被降解，分子水平有可能产生非特异性沉默及脱靶现象，因此我们需要转染率高、易生产、稳定性高、 风险性低，治疗效果强的基因重组药物克服目前肿瘤治疗过程中的瓶颈。作为本发明的前期研究，中国专利200510(^6847. 8 (授权公告号CN 100424096C)公开了生存素Survivin突变体及其制备方法和初步功能，揭示Survivin突变体融合蛋白TmSm对癌细胞有明显的促凋亡作用，但并没有涉及其与肿瘤化疗药物联合使用时的效果。
发明内容
本发明的目的在于提供一种能够有效促进肿瘤化疗药物对肿瘤细胞的杀伤作用、 降低化学药物使用剂量，因此具有化疗增敏效果的基因工程蛋白增敏剂。本发明的第二个目的是提供肿瘤化疗药物的蛋白增敏剂在促进肿瘤化疗药物对肿瘤细胞的杀伤作用中的应用。为实现以上目的，本发明公开以下技术方案一种肿瘤化疗药物的蛋白增敏剂，所
3述蛋白增敏剂包括Survivin突变体蛋白(本发明中简称TmSm)，所述Survivin突变体蛋白通过基因工程制备，与survivin具有90%的同源性，所述Survivin突变体蛋白包括20位、 34位、84位、117位位点单点突变、多点突变、组合突变，以及以上位点同时突变。所述Survivin突变体蛋白优选第34位突变，本发明中第34位突变体代号为 TATm-Survivin(T34A)。所述蛋白增敏剂包括药学允许的载体系统，所述载体系统指TATm、TAT3;3m或者碳纳米管。TATm、TAT3;3m都是指转导蛋白TAT的不同突变形式，他们分别具有与天然TAT有5 倍和33倍的转导效果，碳纳米管是目前用于转导药物的一种常用碳纳米材料。所述肿瘤化疗药物的蛋白增敏剂在促进肿瘤化疗药物对肿瘤细胞的杀伤作用中的应用。所述蛋白增敏剂联合肿瘤化疗药物使用，所述肿瘤化疗药物是指阿霉素、表阿霉素、柔红霉素或者紫杉醇中的一种或几种；所述肿瘤是指乳腺癌、肝癌、肺癌、上皮细胞癌或者白血病。本发明所述Survivin突变体蛋白的制备方法及其基因序列参照中国专利ZL 200510026847. 8。本发明的优点在于重组蛋白TmSm在本实验室前期研究中发现其对癌细胞具有快速、显著的抑生长和促凋亡活性，而不影响正常细胞生长。本发明中根据survivin蛋白在细胞信号通路中的特殊作用以及其对多药耐药逆转的影响，将化疗药物(也称化学药物) 与TmSm联合使用，发现TmSm能有效促进化学药物的杀伤作用，有效降低化学药物的使用量，增加化学药物对细胞的杀伤作用，是一种有效的肿瘤化疗的增敏剂。本发明涉及蛋白质药物TmSm与多种化疗药物的联合应用，TmSm在较低浓度下表现出良好的对癌症细胞的增敏效果，可以明显降低化疗药物的使用浓度；不同的载体系统 TATm, TAT3;3m、碳纳米管等都可以有效的靶向肿瘤细胞，是药学可接受的载体，将药物传送给动物或人。
图1为T47-D对阿霉素和阿霉素与TmSm联合使用的增敏效果研究。图2为Bcap-37对阿霉素和阿霉素与TmSm联合使用的增敏效果研究。图3为MCF-7对阿霉素和阿霉素与TmSm联合使用的增敏效果研究。图4为不同乳腺癌细胞在阿霉素单独作用和阿霉素与TmSm联合使用下的IC50。图5为不同时间、不同TmSm加入剂量对增敏效果影响研究。图 6 为阿霉素(DOX)单独处理 KB-3-1 30h 时，DOX 的 IC50=0. 537 士0. 66。图 7 为 TAT-survivin(T34A)处理KB-3-1 30h 时，目标蛋白的 IC50=34. 74士 1. 05。图 8 为 5ug/ml TAT-survivin (T34A)与 DOX 共同处理 KB-3-1 细胞 30h 时，DOX 的 IC50=0. 24士 1. 91。图9为不同乳腺癌细胞株在阿霉素单独作用、TmSm单独作用、阿霉素与TmSm联合使用细胞形态变化。
具体实施例方式下面结合附图对本发明做详细说明，实施例的作用仅是解释而非限定本发明。
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实施例一比较阿霉素(ADM)对三株乳腺癌细胞MCF-7，T47-D，Bcap-37的细胞毒性作用。MCF-7，T47-D，Bcap-37由本实验室保存，该三株细胞皆属于乳腺癌研究中常用细胞株，均能通过市场购买获得。将阿霉素用高糖DMEM培养基等比例稀释成适当浓度，采用噻唑蓝(MTT)快速比色法测定阿霉素对MCF-7，T47-D，Bcap-37的细胞毒性作用。将对数生长期的MCF-7，T47-D，Bcap-37细胞以广5*104个/孔加入九十六孔板中， 过夜培养至贴壁，然后分别用含有相应浓度的阿霉素高糖DMEM培养基培养48h，在各个梯度的ADM加入量基础上再加入无细胞毒性剂量的TmSm培养4 观察结果。4 后，每孔加入20ulMTT (5mg/ml)，37°C，5%C02及饱和湿度的培养箱中孵育4h，吸出培养基，加入150ul 的DMSO，IOmin后490nm酶标仪检测。从图1、图2、图3中可以看到阳性化学药物阿霉素对细胞的明显杀伤作用，伴随着加入无细胞毒性剂量的TATm-Survivin (T34A)，各个梯度的ADM对各株乳腺癌细胞抑制率都有显著的增加，证明TmSm能有效增加肿瘤细胞对化药的敏感性。实施例二 =TATm-Survivin(T34A)与阿霉素联合作用，以及阿霉素单独作用IC50 的比较。 采用MTT法(具体实验步骤参照实施例一)测得阿霉素4 对乳腺癌细胞株MCF-7， T47-D，Bcap-37的细胞毒性作用，以及联合用药的细胞毒性作用，利用SPSS18. 0确定细胞的半数抑制浓度(IC50)，每次试验重复三次以上(P<0. 05)，以Survivin突变体蛋白(TmSm) 34位突变体(TATm-Survivin (T34A))为例，计算结果见图4。从图4中可以清晰的看到，TATm-Survivin(T34A)的加入降低了阿霉素化学药物的使用剂量，进而可以降低癌症患者对阿霉素等化学药物的耐受性以及相应产生的毒副作用，明显增加了乳腺癌细胞对阿霉素等化学药物的敏感性。实施例三乳腺癌MCF-7细胞对TATm-Survivin (T34A)的增敏作用有时间和剂量依赖性。将对数生长期的MCF-7细胞分别以广5*104个/孔接种于96孔培养板板中， 每孔加入低剂量的阿霉素，还需加入无细胞抑制率的三个梯度(0.05-15ug/ml)的 TATm-Survivin (T34A)，每组设置五个平行孔，37°C，5%C02及饱和湿度的培养箱中培箱Mh， 48h，72h，实验终止后，加入20ulMTT(5mg/ml)，37°C，5%C02及饱和湿度的培养箱中孵育4h， 吸出培养基，加入150ul的DMSO，IOmin后490nm酶标仪检测。从图5中可以看到随着TATm-Survivin (T34A)剂量的增力卩(局限在 TATm-Survivin (T34A)的无细胞毒性范围内)，增敏作用显著的提升，由此可以得知这种作用不仅是因为TATm-Survivin(T34A)量的增加而增加增敏效果；并且随着时间的延长，化学药物阿霉素和TATm-Survivin (T34A)对乳腺癌细胞MCF-7联合抑制作用也随之增加，我们可以得出结论TmSm在化学药物疗效方面有显著的促进作用。实施例四TATm-Survivin (T34A)与阿霉素(DOX)对人上皮细胞癌KB-3-1的联合用药和增敏作用。研究结果显示，当DOX单独处理KB-3-1 30h时，IC50=0. 537士0. 66(见图6)，而采用非常低、甚至是多细胞单独作用无活性的目标蛋白浓度5ug/ml条件下TAT-survivin (T34A)处理 KB-3-1 30h, IC50=34. 74士 1· 05 (见图 7)，与 DOX 共同处理 KB—3—1 细胞，DOX的IC50=0. M士 1. 91 (见图8)，使DOX的剂量减少一倍以上，可见，目标TATm-Survivin (T34A)不仅对乳腺癌，而且在人上皮细胞癌KB-3-1对DOX也同样以极低的剂量便具有较强的增敏效果，这将具有重要的应用价值。实施例五不同乳腺癌细胞株在阿霉素单独作用、TmSm单独作用、阿霉素与TmSm 联合使用细胞形态变化。将对数期的MCF-7，T47-D, Bcap-37细胞接种于六孔板，贴壁后加入实施例一中有效剂量，370C，5%C02及饱和湿度的培养箱中孵育48h，在倒置显微镜下观察细胞形态变化。如图9所示，ADM单独作用组和联合TmSm处理组均出现明显细胞脱落，拉丝，皱缩现象，而经PBS处理的正常细胞组、TmSm单独作用组均未出现脱落、拉丝、皱缩等病变。以上结果表明ADM对肿瘤细胞有明显的杀伤作用，联合使用TmSm及低剂量的化学药物ADM对乳腺癌细胞株MCF-7，T47-D，Bcap-37有比ADM单独作用的更明显细胞毒性。综上所述联合用药效果最为显著，所以联合增敏剂的使用具有令人鼓舞的发展前景。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
权利要求
1.一种肿瘤化疗药物的蛋白增敏剂，其特征在于，所述蛋白增敏剂包括Survivin突变体蛋白，所述Survivin突变体蛋白通过基因工程制备，与survivin具有90%的同源性，所述Surv i ν in突变体蛋白包括20位、34位、84位、117位位点单点突变、多点突变、组合突变， 以及以上位点同时突变。
2.根据权利要求1所述的一种肿瘤化疗药物的蛋白增敏剂，其特征在于，所述 Survivin突变体蛋白优选第34位突变。
3.根据权利要求1所述的一种肿瘤化疗药物的蛋白增敏剂，其特征在于，所述蛋白增敏剂包括药学允许的载体系统，所述载体系统指TATm、TAT33m或者碳纳米管。
4.权利要求1一3任一所述的肿瘤化疗药物的蛋白增敏剂在促进肿瘤化疗药物对肿瘤细胞的杀伤作用中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述蛋白增敏剂联合肿瘤化疗药物使用， 所述肿瘤化疗药物是指阿霉素、表阿霉素、柔红霉素或者紫杉醇中的一种或几种。
6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述肿瘤是指乳腺癌、肝癌、肺癌、上皮细胞癌或者白血病。
全文摘要
本发明公开一种肿瘤化疗药物的蛋白增敏剂及其应用，所述蛋白增敏剂包括Survivin突变体蛋白，通过基因工程制备，与survivin具有90%的同源性，包括20位、34位、84位、117位位点单点突变、多点突变、组合突变，以及以上位点同时突变。蛋白增敏剂联合肿瘤化疗药物使用，肿瘤化疗药物指阿霉素、表阿霉素、柔红霉素或者紫杉醇中的一种或几种。本发明根据survivin蛋白在细胞信号通路中的作用以及其对多药耐药逆转的影响，将化疗药物与TmSm联合使用，发现TmSm能有效促进化学药物的杀伤作用，有效降低化学药物的使用量，增加化学药物对细胞的杀伤作用，是一种有效的肿瘤化疗的增敏剂。
文档编号A61K38/17GK102366627SQ201010608978
公开日2012年3月7日 申请日期2010年12月28日 优先权日2010年12月28日
发明者朱玲, 许玉馨, 郑文云, 马兴元 申请人:华东理工大学