专利名称：包含与载体蛋白缀合的肺炎链球菌多糖的免疫原性组合物的制作方法
包含与载体蛋白缀合的肺炎链球菌多糖的免疫原性组合物本发明涉及肺炎球菌缀合物免疫原性组合物或疫苗领域，其中为免疫原性组合物或疫苗的不同组分使用不同的缀合化学法。将还原胺化用于至少ー种血清型的缀合，将除了还原胺化以外的缀合用于不同血清型的缀合。本发明也涉及生产这种疫苗的方法和它们在治疗中的用途。不到2岁的儿童对大多数多糖疫苗不产生免疫应答，所以一直以来必须通过与蛋白载体进行化学缀合使多糖成为免疫原性的。将为非T细胞依赖性抗原的多糖与为T细胞依赖性抗原的蛋白偶联，会赋予所述多糖T细胞依赖性特性，包括同种型转换、亲和力成熟和记忆诱导。肺炎链球菌{Streptococcus为革兰氏阳性细菌,可导致相当高的发 病率和死亡率(尤其是对年纪小的人和上年纪的人)，引起诸如肺炎、菌血症和脑膜炎等侵袭性疾病以及与定植(colonisation)相关的疾病，如急性中耳炎。在美国，60岁以上的人患有肺炎球菌性肺炎的比例估计为十万分之3-8。在20%的病例中，这会引发菌血症和其它表现诸如脑膜炎，即便采用抗生素治疗，死亡率也接近30%。肺炎链球菌被赋予血清型特异性的化学连接的多糖包裏。有90种公知的肺炎链球菌血清型，荚膜是肺炎链球菌毒力的主要决定因素，因为荚膜不但保护细菌内表面不受补体影响，而且其本身是弱免疫原性的。多糖是非T细胞依赖性抗原，不能被加工或呈递到MHC分子上，从而不能与T细胞相互作用。但它们能通过ー种涉及B细胞表面受体交联的替代机制来刺激免疫系统。一些实验表明，对侵袭性肺炎链球菌疾病的防护作用与荚膜特异性抗体最为相关，且该防护作用具有血清型特异性。肺炎链球菌是婴儿和儿童侵袭性细菌疾病和中耳炎的最常见致病因素。同样，老年人对肺炎链球菌疫苗的应答较弱[Roghmann等，(1987)，J. Gerontol. 42:265-270],因此，在该人群中细菌性肺炎的发病率升高[Verghese和Berk, (1983) Medicine(Baltimore) 62:271-285]。已经开发了多价肺炎球菌缀合疫苗。Synflorix由Glaxosmithkline Biologicals. a.销售，且含有肺炎球菌血清型1、4、5、68、7 、抑、14和23 多糖(与来自流感嗜血杆菌的蛋白D缀合)、18C (与破伤风类毒素缀合)和19F (与白喉类毒素缀合)，所述缀合是通过氰基化(CDAP)化学法。Prevenar由Pfizer销售，且含有肺炎球菌血清型4、6B、9V、14、18C、19F和23F,它们都通过还原胺化化学法与无毒的白喉毒素CRM197缀合(Prymula和SchuermanExpert Rev. vaccines 8; 1479-1500 (2009))。因此，本发明的ー个目的是，开发一种改进的多种血清型肺炎链球菌多糖缀合疫苗的制剂。这可以如下实现通过组合来自不同的肺炎球菌血清型的糖，所述糖已经使用不同的缀合方法进行缀合。以此方式，使用允许糖表位的最佳呈现的缀合方法，为不同血清型选择最佳的缀合方法，从而允许每种血清型呈现。尽管使用还原胺化时有些肺炎球菌糖会较好地缀合，对于其它肺炎球菌糖而言，不同的缀合方法会允许环结构保持完整，且可以提供更好的結果。选择出使用还原胺化或其它缀合方法时具有最佳表现的糖，允许开发出更有效的免疫原性组合物。因此，提供了包含至少2种不同的肺炎链球菌荚膜糖的免疫原性组合物，其中一种或多种选自由血清型1、3、19A和19F组成的第一组并且通过除了还原胺化以外的化学法直接地或间接地与蛋白载体相连，以及ー种或多种不同的糖选自由血清型4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C和23F组成的第二组并且通过还原胺化与蛋白载体相连。
图I.多糖-蛋白缀合物的制备。A)在7vCRM中，19F多糖经由还原胺化与无毒的白喉CRM197蛋白缀合。(I)使用高碘酸盐的氧化会导入末端反应性的醛。(2)通过还原胺化与CRM197载体蛋白连接，会破坏和打开己糖环。(3)缀合以后，由于新基团与己糖环的结合，可以生成新的免疫原性的表位。B)在PHiD-CV中，19F多糖经由氰基化化学法与白喉类毒素缀合。化学地活化19F， 以将氰酸酯基团引导至羟基，在添加蛋白组分以后，与氨基或酰肼基团形成共价键。在氰基化缀合以后，己糖环保持完整，且其它化学基团不能結合。图2.在PHiD-CV或7vCRM初次和强化免疫接种以后，实现彡8的针对肺炎球菌血清型19F的OPA滴度的婴儿的比例。浅色条显示了 PHiD-CV的结果，深色条显示了 7vCRM
的結果。误差棒代表95%置信限。图3.在PHiD-CV或7vCRM初次和强化免疫接种以后，实现彡8的针对肺炎球菌血清型19A的OPA滴度的婴儿的比例。浅色条显示了 PHiD-CV的结果，深色条显示了 7vCRM
的結果。误差棒代表95%置信限。图4.在高碘酸盐处理以后，23F和6B多糖的大小。用三角形标记的线显示了在IOmM磷酸盐缓冲液中的6B的大小，用菱形标记的线显示了在IOmM磷酸盐缓冲液中的23F的大小，用正方形标记的线显示了在IOOmM磷酸盐缓冲液中的23F的大小。图5.使用CDAP或还原胺化缀合，23F缀合物的免疫原性的对比。图6.通过还原胺化或CDAP制备的6B缀合物在小鼠中的免疫原性的对比。该图显示了通过还原胺化制备的4种缀合物(PS06B-CRM122-125)和通过CDAP制备的2种缀合物(PS06B-CRM003和PS06B-PD)的ELISA滴度。下面显示了 OPA結果。图7.通过还原胺化或CDAP制备的6B缀合物在豚鼠中的免疫原性的对比。该图显示了通过还原胺化制备的4种缀合物(PS06B-CRM122-125)和通过CDAP制备的2种缀合物(PS06B-CRM003和PS06B-PD)的ELISA滴度。下面显示了 OPA結果。
具体实施例方式本发明提供了ー种免疫原性组合物，其包含至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、
14、15、16、17、18、19或20种不同的肺炎链球菌荚膜糖，其中ー种或多种选自由血清型1、3、19A和19F组成的第一组并且通过除了还原胺化以外的化学法直接地或间接地与蛋白载体相连，以及ー种或多种不同的糖选自由血清型4、5、6ム、68、6(、7 、9￥、14、180和23F组成的第二组并且通过还原胺化与蛋白载体相连。在一个实施方案中，本发明的免疫原性组合物包含，通过除了还原胺化以外的化学法与蛋白载体缀合的肺炎链球菌荚膜糖，所述荚膜糖来自血清型I或3或19A或19F ;I 和 3 ;1 和 19A ；1 和 19F ；3 和 19A ；3 和 19F ；19A 和 19F ;1、3 和 19A ;1、3 和 19F、1、19A 和19F ;3、19A和19F或1、3、19A和19F。在一个实施方案中，19F通过除了还原胺化以外的化
学法与载体蛋白缀合。任选地，使用还原胺化缀合来自血清型1、3、19A或19F的荚膜糖，只要使用除了还原胺化以外的方法缀合该组的其它成员即可。在一个实施方案中，本发明的免疫原性组合物包含，通过氰基化化学法诸如CDAP化学法与蛋白载体缀合的肺炎链球菌荚膜糖，所述荚膜糖来自血清型I或3或19A或19F ；I 和 3 ;1 和 19A ；1 和 19F ；3 和 19A ；3 和 19F ；19A 和 19F ;1、3 和 19A ;1、3 和 19F、1、19A 和19F ;3、19A和19F或1、3、19A和19F。在一个实施方案中，19F通过CDAP化学法与载体蛋
白缀合。
在一个实施方案中，本发明的免疫原性组合物包含，通过碳ニ亚胺(例如EDAC)化学法与蛋白载体缀合的肺炎链球菌荚膜糖，所述荚膜糖来自血清型I或3或19A或19F ;I 和 3 ;1 和 19A;1 和 19F;3 和 19A;3 和 19F ；19A 和 19F;1、3 和 19A;1、3 和 19F、1、19A 和19F ;3、19A 和 19F 或 1、3、19A 和 19F。在本发明的一个实施方案中，下述肺炎链球菌荚膜糖或其基团通过还原胺化与载体蛋白缀合血清型 4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C 或 23F、4 和 5、4 和 6A、4 和 6B、4 和 7F、4 和9V、4 和 14、4 和 18C、4 和 23F、5 和 6A、5 和 6B、5 和 7F、5 和 9V、5 和 14、5 和 18C、5 和 23F、6A 和 6B、6A 和 7F、6A 和 9V、6A 和 14、6A 和 18C、6A 和 23F、6B 和 7F、6B 和 9V、6B 和 14、6B 和18C、6B 和 23F、7F 和 9V、7F 和 14、7F 和 18C、7F 和 23F、9V 和 14、9V 和 18C、9V 和 23F、14 和18C、14和23F或18C和23F。在一个实施方案中，23F通过还原胺化化学法与载体蛋白缀
ム
ロ o在本发明的一个实施方案中，来自血清型19F的肺炎球菌多糖通过氰基化化学法(例如CDAP化学法)与载体蛋白缀合，而来自血清型23的肺炎球菌多糖通过还原胺化化学法与载体蛋白缀合。在本发明的一个实施方案中，来自血清型19F的肺炎球菌多糖通过氰基化化学法(例如CDAP化学法)与载体蛋白缀合，而来自血清型6B的肺炎球菌多糖通过还原胺化化学法与载体蛋白缀合。在本发明的一个实施方案中，来自血清型19F的肺炎球菌多糖通过氰基化化学法(例如CDAP化学法)与载体蛋白缀合，而来自血清型6A的肺炎球菌多糖通过还原胺化化学法与载体蛋白缀合。在本发明的一个实施方案中，来自血清型19F的肺炎球菌多糖通过氰基化化学法(例如CDAP化学法)与载体蛋白缀合，而来自血清型6C的肺炎球菌多糖通过还原胺化化学法与载体蛋白缀合。在本发明的一个实施方案中，使用还原胺化化学法，使1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11
或12种来自不同血清型的肺炎链球菌荚膜糖与载体蛋白缀合。在使用还原胺化化学法进行缀合的情况下，任选地，使用0. 1-1. 2,0. 1-0. 5、
0.1-0. 2,0. 5-0. 8,0. 1-0. 8,0. 3-1. 0或0. 4-0. 9摩尔当量的高碘酸盐氧化肺炎链球菌荚膜糖，以形成活化的糖。任选地，所述高碘酸盐处理步骤在缓冲液中进行，所述缓冲液不含有胺基，例如磷酸盐缓冲液、硼酸盐缓冲液、こ酸盐缓冲液、碳酸盐缓冲液和柠檬酸盐缓冲液。在一个实施方案中，所述缓冲液是无机缓冲液。在一个实施方案中，所述缓冲液是磷酸盐缓冲液，例如磷酸钠缓冲液或磷酸钾缓冲液。发明人已经发现，通过控制还原胺化方法的氧化步骤的条件，得到的缀合物可以有利地保留所述糖的大小和/或免疫原性。 在一个实施方案中，所述缓冲液(例如磷酸盐缓冲液)具有l-100mM、5-80mM、l-50mM、l-25mM、10_40mM、l-10mM、5-15mM、8-12mM、10-20mM、5-20mM、10_50mM、约 IOmM 或约20mM的浓度。在一个实施方案中，所述缓冲液的pH是pH 5. 0-7. 0、pH 5. 5-6. 5,pH 5. 8-6. 3或约pH 6. O0术语‘高碘酸盐’包括高碘酸盐和高碘酸。该术语也包括偏高碘酸盐(104_)和正高碘酸盐(IO广)，但是，在ー个具体实施方案中，在本发明的方法中使用的高碘酸盐是偏高碘酸盐。术语‘高碘酸盐’也包括高碘酸盐的各种盐，包括高碘酸钠和高碘酸钾。当抗原与高碘酸盐反应时，高碘酸盐会氧化邻位羟基，以形成羰基或醛基，并造成C-C键的断裂。因为该原因，术语‘使抗原与高碘酸盐反应’包括用高碘酸盐氧化邻位羟基，例如所述反应可 能包括氧化顺式或反式邻位ニ醇。在本发明的一个实施方案中，使用CDAP化学法，使1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或
12种来自不同血清型的肺炎链球菌荚膜糖与载体蛋白缀合。在本发明的一个实施方案中，使用碳ニ亚胺(例如EDAC)化学法，使1、2、3、4、5、6、
7、8、9、10、11或12种来自不同血清型的肺炎链球菌荚膜糖与载体蛋白缀合。在一个实施方案中，本发明的免疫原性组合物含有选自下述的载体蛋白破伤风类毒素、白喉类毒素、CRM197、蛋白D、肺炎链球菌溶血素和PhtD或其片段或融合蛋白。在一个实施方案中，本发明的免疫原性组合物含有2、3、4、5、6或7种不同的载体蛋白，所述载体蛋白分别与至少或准确的2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16种不同肺炎链球菌荚膜糖血清型缀合。任选地，这些载体蛋白选自破伤风类毒素、白喉类毒素、CRM197、蛋白D、肺炎链球菌溶血素和PhtD或其片段或融合蛋白。在一个实施方案中，本发明的免疫原性组合物包含与蛋白D或CRM197缀合的肺炎链球菌荚膜糖I。在一个实施方案中，本发明的免疫原性组合物包含与蛋白D、CRM197、肺炎链球菌溶血素或PhtD或其片段或融合蛋白缀合的肺炎链球菌荚膜糖3。在一个实施方案中，本发明的免疫原性组合物包含与蛋白D或CRM197缀合的肺炎链球菌荚膜糖4。在一个实施方案中，本发明的免疫原性组合物包含与蛋白D或CRM197缀合的肺炎链球菌荚膜糖5。在一个实施方案中，本发明的免疫原性组合物包含与蛋白D或CRM197缀合的肺炎链球菌荚膜糖6B。在一个实施方案中，本发明的免疫原性组合物包含与蛋白D或CRM197缀合的肺炎链球菌荚膜糖7F。在一个实施方案中，本发明的免疫原性组合物包含与蛋白D或CRM197缀合的肺炎链球菌荚膜糖9V。在一个实施方案中，本发明的免疫原性组合物另外包含与蛋白D或CRM197缀合的肺炎链球菌荚膜糖14。
在一个实施方案中，本发明的免疫原性组合物包含与蛋白D或CRM197缀合的肺炎链球菌荚膜糖23F。在一个实施方案中，本发明的免疫原性组合物包含与破伤风类毒素或CRM197缀合的肺炎链球菌荚膜糖18C。在一个实施方案中，本发明的免疫原性组合物包含与肺炎链球菌溶血素或CRM197缀合的肺炎链球菌荚膜糖19A。在一个实施方案中，本发明的免疫原性组合物包含与CRM197或PhtD或其片段或融合蛋白缀合的肺炎链球菌荚膜糖22F。在一个实施方案中，本发明的免疫原性组合物包含，与下述物质缀合的肺炎链球菌荚膜糖6A :肺炎链球菌溶血素或流行性感冒杆菌蛋白，任选地蛋白D或PhtD 或其融合蛋白或 CRM197。在一个实施方案中，本发明的免疫原性组合物包含，与下述物质缀合的肺炎链球菌荚膜糖6C :肺炎链球菌溶血素或流行性感冒杆菌蛋白，任选地蛋白D或PhtD或其融合蛋白或 CRM197。术语“糖”在整个本说明书中可指示多糖或寡糖，并包括这二者。多糖分离自细菌，并可以在某种程度上通过已知方法(參见例如EP497524和EP497525)并任选地通过微流化调整大小。可对多糖调整大小，以便降低多糖样品的粘度和/或改善缀合产物的过滤性。寡糖具有少量重复单元(通常5-30个重复単元)，并通常为水解的多糖。肺炎链球菌的荚膜多糖包含可含有达8个糖残基的重复寡糖単元。关于关键肺炎链球菌血清型的寡糖单兀的综述，參见JONES, Christopher. Vaccine based on thecell surface carbohydrates of pathogenic bacteria. An. Acad. Bras. Lienc., 2005年6月，第77卷，第2册，293-324页，表II ISSN 0001-3765。在一个实施方案中，荚膜糖抗原可为全长多糖，但是在其它实施方案中其可为ー个寡糖単元，或者比重复寡糖単元的天然长度的糖链短。在一个实施方案中，疫苗中存在的所有糖都是多糖。全长多糖可被“调整大小”，即它们的大小可通过多种方法降低，例如酸解处理；过氧化氢处理；通过emulsiflex 调整大小，然后经过氧化氢处理，以产生寡糖片段；或者微流化。本发明人还注意到，本技术的核心是使用易于生产缀合物的寡糖。本发明人已发现，通过使用天然的或稍微调整大小的多糖缀合物，可实现ー个或多个以下优势1)具有高免疫原性的可过滤的缀合物，2)可改变缀合物中多糖对蛋白的比率，使得缀合物中多糖对蛋白的比率(w/w)可被增加(其可对载体抑制作用有影响)，3)倾向于水解的免疫原性缀合物可通过使用较大的糖进行缀合来稳定。使用较大的多糖可导致与缀合物载体更加交联，并可以减少由缀合物释放游离的糖。在先有技术中描述的缀合疫苗倾向于在缀合前解聚多糖，以便改善缀合。本发明人已发现，保留较大尺寸糖的糖缀合疫苗可提供抵御肺炎链球菌疾病的良好免疫应答。本发明的免疫原性组合物因此可以包含一种或多种糖缀合物，其中在缀合前每种糖的平均尺寸(重均分子量；Mw)在 80kDa、100kDa、200kDa、300kDa、400kDa、500kDa 或IOOOkDa以上。在一个实施方案中，缀合后的缀合物应可容易地通过0. 2 y m滤器过滤，使得与过滤前样品相比在过滤后获得50%、60%、70%、80%、90%或95%以上的产量。为了本发明的目的，“天然的多糖”是指未经处理的多糖，处理的目的是减小糖的尺寸。在常规纯化工艺中多糖的尺寸可被轻微減少。这样的糖仍是天然的。只要多糖已经经过调整大小的エ艺，该多糖就不被认为是天然多糖。天然的多糖的尺寸是例如250kDa-2，000kDa、400 - 1，500kDa、750kDa - 1，250kDa、300kDa - 600kDa、500-1，OOOkDa 或I, ooo-l, 500kDa,技术人员会明白具有不同尺寸的天然多糖的不同血清型。为了本发明的目的，“以达到x2的因数调整大小”是指糖经过处理，目的是降低糖大小，但仍保留超过天然多糖大小的一半的大小。x3、x4等等以相同的方式解释，即对糖进行处理，以減少多糖的大小，但仍保留天然多糖大小的1/3、1/4等等以上的大小。在本发明的ー个方面，免疫原性组合物包含至少10种血清型的缀合载体蛋白的肺炎链球菌糖，其中至少1、2、3、4、5、6、7、8、9种或每种肺炎链球菌糖为天然多糖。在本发明的ー个方面，免疫原性组合物包含来自至少10种血清型的缀合载体蛋白的肺炎链球菌糖，其中至少1、2、3、4、5、6、7、8、9种或每种肺炎链球菌糖被达到x2、x3、x4、x5、x6、x7、x8、x9或xlO的因数调整大小。在该方面的一个实施方案中，大部分糖，例 如6、7、8种或更多种的糖被达到x2、x3、x4、x5、x6、x7、x8、x9或xlO的因数调整大小。糖的分子量或平均分子量在本文是指在缀合前检测的糖的重均分子量(Mw)，通过MALLS来检测。MALLS技术在本领域众所周知，通常如实施例2所述进行。就肺炎链球菌糖的MALLS分析而言，可组合使用两种柱子(TSKG6000和5000PWxl )，并用水洗脱糖。用光散射检测器(例如配有10 mff 488 nm気激光器的Wyatt Dawn DSP)和干涉仪折射计(例如装备PlOO光电元件和498 nm红光过滤的Wyatt Otilab DSP)检测糖。在一个实施方案中，肺炎链球菌糖为天然多糖，或者为在常规提取步骤中己经减小了尺寸的天然多糖。在一个实施方案中，通过机械裂解，例如通过微流化或超声，调整肺炎链球菌糖的大小。微流化和超声具有充分减小较大天然多糖大小从而提供可过滤缀合物的优点。调整大小以不超过x20、xlO、x8、x6、x5、x4、x3或x2的因数进行。在一个实施方案中，免疫原性组合物包含肺炎链球菌缀合物，该缀合物由天然多糖和以不超过x20的因数调整大小的糖的混合物制备。在该实施方案的ー个方面，大部分糖，例如6、7、8种或更多种糖以达到x2、x3、x4、x5_x6的因数调整大小。在一个实施方案中，本发明的免疫原性组合物包含平均大小在100 kDa以上的19A 糖，例如，110-700 kDa、110-300、120-200、130-180 或 140-160 kDa。在一个实施方案中，通过微流化将19A轻微调整大小，例如达到x2、x3、x4或x5的因数。在一个实施方案中，19A缀合物的糖剂量是1-10 ugU-5 Ug或1-3 Ug的糖，任选地，3 Ug糖。在一个实施方案中，本发明的免疫原性组合物包含22F糖缀合物，其中所述22F糖的平均大小大于 100 kDa，任选地，110-700 kDa、110-300、120-200、130-180 或 150-170kDa。在一个实施方案中，通过微流化对22F糖调整大小，例如达到x2、x3、x4或x5的因数。在一个实施方案中，the of the 19A缀合物的糖剂量是1_10 iig、l_5 ii g或1_3 ii g的糖，任选地，3 Ug糖。在一个实施方案中，本发明的免疫原性组合物包含多种糖缀合物，其中所述糖的平均大小大于50 kDa。在一个实施方案中，血清型I糖的平均大小是300-400 kDa。在一个实施方案中，血清型4糖的平均大小是75-125 kDa。在一个实施方案中，血清型5糖的平均大小是350-450 kDa。在一个实施方案中，血清型6B糖的平均大小是1000-1400 kDa。在一个实施方案中，血清型7F糖的平均大小是200-300 kDa。在一个实施方案中，血清型9V糖的平均大小是250-300 kDa。在一个实施方案中，血清型14糖的平均大小是200-250kDa。在一个实施方案中，血清型23F糖的平均大小是900-1000 kDa。在一个实施方案中，血清型 5 ;6A、6B ；23F ；5 和 6A ；5 和 6B、5 和 23F、6A 和 6B、6A 和 23F ；6B 和 23F ;5、6A 和 6B ；
5、6A和23F ;5、6B和23F或5、6A、6B和23F作为天然的调整过尺寸的糖进行缀合，即在所述エ艺中不包括指定的调整大小的步骤。在本发明的免疫原性组合物的一个实施方案中，荚膜糖缀合物的糖剂量是1-10y g、1-5 y g或1-3 y g糖/缀合物。例如，所述组合物包含剂量为3 ii g糖/缀合物的血清型4、18C、19F和22F(和任选地，19A)的缀合物。例如，本发明的免疫原性组合物包含剂量为I 1^糖/缀合物的血清型1、5、68、7 、抑、14和23 (和任选地，6A和/或3)的缀合物。在一个实施方案中，肺炎链球菌糖通过接头如双功能接头与载体蛋白缀合。任选地，接头为异双功能或同双功能接头，具有例如I个反应性氨基和I个反应性羧基、2个反应性氨基或者2个反应性羧基。例如，接头具有4-20、4-12、5-10个碳原子。可能的接头是ADH。其它接头包括B-丙酰胺基(W0 00/10599)、硝基苯-こ胺(Gever等，(1979)Med. Microbiol. Immunol. 165 ;171_288)、卤代烷基卤(US4057685)、糖苷键(US4673574、US4808700 )、己烷ニ胺和6-氨基己酸(US4459286 )。在一个实施方案中，ADH用作缀合血清型18C的糖的接头。在本发明的免疫原性组合物中存在的糖缀合物可用任何己知的偶联技术制备。缀合方法可依赖于用四氟硼酸I-氰基-4-ニ甲基氨基吡啶鎗(CDAP)活化糖而形成氰酸酷。由此，活化的糖可直接或经由间隔臂(接头)基团偶联至载体蛋白上的氨基。例如，间隔臂可以是胱胺或半胱胺，以得到硫醇化多糖，硫醇化多糖可经由与马来酰亚胺活化的载体蛋白(例如使用GMBS)或卤こ酰载体蛋白(例如使用碘こ酰亚胺[例如こ基碘こ酰亚胺HCl]或N-琥珀酰亚胺基溴こ酸盐或SIAB、或SIA、或SBAP)反应后所获得的硫醚键与载体偶联。任选地，氰酸酯(任选地以CDAP化学法制备)可与己ニ胺或ADH偶联，并采用碳ニ亚胺(例如EDAC或EDC)化学法经蛋白载体上的羧基使氨基衍生化的糖与载体蛋白缀合。这样的缀合物描述于PCT 公开申请WO 93/15760(Uniformed Services University)以及 WO 95/08348和 TO 96/29094。其它的合适技术使用碳ニ亚胺、碳亚胺、酰肼、活化酷、降冰片烷、对硝基苯甲酸、N-羟基琥珀酰亚胺、S-NHS、EDC、TSTU。许多都描述于WO 98/42721。缀合可涉及羰基接头，其可如下形成糖的游离羟基先与CDI反应(Bethell等，J. Biol. Chem. 1979，254 ；2572-4, Hearn 等，J. Chromatogr. 1981. 218 ;509_18),再与蛋白反应，形成氨基甲酸酯键。该过程可涉及异头末端还原成伯羟基，任选地，涉及伯羟基与CDI反应的伯羟基的保护/去保护，以形成CDI氨基甲酸酯中间体，并将CDI氨基甲酸酯中间体与蛋白的氨基偶联。缀合物也可通过如US 4365170 (Jennings)和 US 4673574 (Anderson)所述的直接还原胺化法制备。其它方法描述于EP-0-161-188、EP-208375和EP-0-477508。进一步的方法涉及通过碳ニ亚胺缩合(Chu C.等，Infect. Immunity, 1983 245256),例如使用EDAC，将溴化氰(或CDAP)活化的、被己ニ酰肼(ADH)衍生化的糖与蛋白载体偶联。在一个实施方案中，糖上的羟基(任选活化的羟基，例如被活化以制备氰酸酯的羟基(例如使用CDAP))直接或间接(通过接头)与蛋白的氨基或羧基连接。当存在接头时，糖上的羟基任选地与接头上的氨基连接，例如通过使用CDAP缀合。接头如ADH中的其余氨基可缀合蛋白上的羧酸基团，例如通过使用碳ニ亚胺化学，例如通过使用EDAC。在一个实施方案中，肺炎链球菌荚膜糖在接头与载体蛋白缀合之前先与接头缀合。或者，接头可在与糖缀合之前与载体缀合。还可以使用技术组合，ー些糖-蛋白缀合物通过CDAP制备，一些通过还原胺化法制备。通常，蛋白载体上可用于偶联/缀合的化学基团的类型如下
A)羧基(例如经天冬氨酸或谷氨酸)。在一个实施方案中，该基团直接与糖上的氨基连 接，或者用碳ニ亚胺化学(例如用EDAC)与接头上的氨基连接。B)氨基(例如经由赖氨酸)。在一个实施方案中，该基团直接与糖上的羧基连接，或者用碳ニ亚胺化学(例如用EDAC)与接头上的羧基连接。在另ー个实施方案中，该基团直接与糖上用CDAP或CNBr活化的羟基连接，或者与接头上的这些基团连接；与具有醛基的糖或接头连接；与具有琥珀酰亚胺酯基团的糖或接头连接。C)巯基(例如经由半胱氨酸)。在一个实施方案中，该基团与溴こ酰糖或氯こ酰糖连接，或者用马来酰亚胺化学与接头连接。在一个实施方案中，该基团用双二重氮联苯胺活化/改性。D)羟基(例如经由酪氨酸)。在一个实施方案中，该基团用双二重氮联苯胺活化/改性。E)咪唑基(例如经由组氨酸)。在一个实施方案中，该基团用双二重氮联苯胺活化/改性。F)胍基(例如经由精氨酸)。G)吲哚基(例如经由色氨酸)。在糖上，能够用于偶联的通常是以下基团0H、COOH或NH2。醛基能够在本领域已知的不同处理后产生，所述处理例如高碘酸盐、酸解、过氧化氢等。直接偶联法
糖-OH + CNBr或CDAP----->氰酸酷+ NH2-Prot——> 缀合物
糖-醛+ NH2-Prot——> 席夫碱+ NaCNBH3——> 缀合物 糖-COOH + NH2-Prot + EDAC ——> 缀合物 糖-NH2 + COOH-Prot + EDAC ——> 缀合物。通过间隔臂(接头)间接偶联的方法
糖-OH + CNBr 或 CDAP —> 氰酸酷+ NH2——NH2 ——> 糖——NH2 + COOH-Prot +EDAC----->缀合物
糖-OH + CNBr 或 CDAP ——> 氰酸酷 + NH2-----SH-----> 糖——SH + SH-Prot
(具有暴露的半胱氨酸的天然蛋白，或是通过例如SPDP将蛋白的氨基改性后获得)——>糖-S-S-Prot
糖-OH + CNBr或CDAP >氰酸酯+NH2——SH------->糖——SH+马来酰亚胺-Prot (氨基的改性物)——> 缀合物
糖-OH + CNBr 或 CDAP > 氰酸酷+ NH2-----SH > 糖-SH + 卤代こ酰胺-Prot
——> 缀合物
糖-COOH + EDAC + NH2-----NH2 —> 糖------NH2 + EDAC + COOH-Prot ——> 缀合
物
糖-COOH + EDAC + NH2——SH----->糖——SH + SH-Prot (具有暴露的半胱氨酸的
天然蛋白，或是通过例如SPDP将蛋白的氨基改性后获得)-----> 糖-S-S-Prot
糖-COOH + EDAC + NH2——SH----->糖——SH +马来酰亚胺-Prot (氨基的改性
物)——> 缀合物
糖-COOH + EDAC + NH2——SH>糖-SH +卤代こ酰胺-Prot——> 缀合物
糖-醛+ NH2-----NH2 > 糖------NH2 + EDAC + COOH-Prot ——> 缀合物
注意可以使用任何合适的碳ニ亚胺替代以上的EDAC。总之，通常可以用于与糖偶合的蛋白载体化学基团的类型是氨基(例如赖氨酸残基上的)、COOH基团(例如天冬氨酸和谷氨酸残基上的)和SH基团(如果能够获得的话)(例如半胱氨酸残基上的)。 任选地,载体蛋白对肺炎链球菌糖的比率在1:5至5:1 (w/w)之间；1:2至2. 5:1(w/w)之间；I: I至2:1 (w/w)之间。在一个实施方案中，大部分缀合物,例如6、7、8、9种或更多种缀合物，具有大于1:1的载体蛋白与糖的比率，例如I. 1:1、1.2:1、1.3:1、1.4:1、
I.5:1 或 I. 6:1 (w/w)。在一个实施方案中，使用CDAP和EDAC使至少ー种肺炎链球菌糖经接头与载体蛋白缀合。例如，可使用如上所述的CDAP和EDAC使18C经接头(例如在其末端具有两个酰肼基团的那些接头，例如ADH)与蛋白缀合。在使用接头时，CDAP可用于使糖与接头缀合，然后可使用EDAC使接头与蛋白缀合,或者可首先使用EDAC使接头与蛋白缀合,此后可使用CDAP使接头与糖缀合。通常，本发明的免疫原性组合物可含有在0. l-20ii g、l_10ii g或l_3ii g糖之间的每种糖缀合物的剂量。在一个实施方案中，本发明的免疫原性组合物含有剂量为0. 1-20 iig、0. 5-10iig、0. 5-5 Ug或1-3 Ug糖的每种肺炎链球菌荚膜糖。在一个实施方案中，荚膜糖可以不同剂量存在，例如某些荚膜糖可以以约或恰好I U g的剂量存在，或者某些荚膜糖可以以约或恰好3 Ug的剂量存在。在一个实施方案中，来自血清型3、18C和19F(或者4、18C和19F)的糖以高于其它糖的剂量存在。在该实施方案的ー个方面，血清型3、18C和19F (或
4、18C和19F)以约或恰好g的剂量存在，而免疫原性组合物中的其它糖以约或恰好I ii g的剂量存在。“约”或“近似”为了本发明的目的被定义为在给定值的10%左右以内。在一个实施方案中，至少ー种肺炎链球菌荚膜糖与载体蛋白直接缀合。任选地，至少ー种肺炎链球菌荚膜糖通过CDAP直接缀合。在一个实施方案中，大部分荚膜糖，例如5、
6、7、8、9种或更多种，通过CDAP与载体蛋白连接(參见WO 95/08348和WO 96/29094)。在一个实施方案中，本发明的免疫原性组合物包含一种或多种未缀合的或缀合的肺炎链球菌蛋白。在一个实施方案中，所述肺炎链球菌蛋白以未缀合的形式添加，例如，它作为游离蛋白存在于所述组合物中。在一个实施方案中，本发明的免疫原性组合物包含至少或准确的1、2、3或4种肺炎链球菌蛋白，所述蛋白选自聚组氨酸三联体家族(PhtX)、胆碱结合蛋白家族(CbpX)、CbpX截短物、LytX家族、LytX截短物、CbpX截短物-LytX截短物嵌合蛋白、去毒的肺炎链球菌溶血素(Ply)、PspA、PsaA, Spl28、SplOl、Spl30、Spl25 和 Spl33。例如，所述组合物含有去毒的肺炎链球菌溶血素和/或PhtD。例如，所述组合物含有去毒的肺炎链球菌溶血素和PhtD和Sp128。例如，所述组合物含有去毒的肺炎链球菌溶血素和PhtD和Sp130。Pht (聚组氨酸三联体)家族包括蛋白PhtA、PhtB、PhtD和PhtE。该家族具有以下特征脂质化序列；由脯氨酸富集区和几个组氨酸三联体分隔开的两个结构域，可能涉及金属或核苷的结合或酶活性；(3-5)卷曲螺旋区；保守的N-末端和异源的C末端。它存在于已检验的所有肺炎链球菌菌株中。同源蛋白已在其它链球菌和奈瑟氏球菌属中发现。在本发明的一个实施方案中，本发明的Pht蛋白为PhtD。然而，要理解的是，术语Pht A、B、D和E是指具有在以下引用文献中公开的序列的蛋白，以及其天然(和人工制备的)变体，所述 变体与參比蛋白具有至少90%的序列同源性。任选地为至少95%相同或至少97%相同。对于PhtX蛋白而言，PhtA在WO 98/18930中公开，也称作Sp36。如上所述，其是聚组氨酸三联体家族蛋白，并具有II型信号基序LXXC。PhtD在WO 00/37105中公开，也称为Sp036D。如上所述，它也是聚组氨酸三联体家族蛋白，并具有II型LXXC信号基序。PhtB在WO 00/37105中公开，也称为Sp036B。PhtB家族的另一成员是C3-降解多肽，在WO00/17370中公开。该蛋白也来自聚组氨酸三联体家族(triad family)，并具有II型LXXC信号基序。例如，免疫功能等效物为在WO 98/18930中公开的蛋白Sp42。PhtB截短物(约79 kD)在WO 99/15675中公开，它也被认为是PhtX家族成员。PhtE在WO 00/30299中公开，称作BVH-3。当本文提到任何Pht蛋白时，意味着可使用Pht蛋白的免疫原性片段或其融合体。例如，提到的PhtX包括来自任何Pht蛋白的免疫原性片段或其融合体。提到PhtD或PhtB也就提到了可见于例如WO 0198334的PhtDE或PhtBE。肺炎链球菌溶血素是ー种具有独特的溶细胞(溶血)作用和补体活化活性的多功能毒素(Rubins 等，Am. Respi. Cit Care Med, 153: 1339-1346 (1996))。该毒素不由肺炎链球菌分泌，而是在肺炎链球菌于自溶素影响下裂解时释放。其作用包括例如刺激人体单核细胞产生炎性细胞因子，抑制人体呼吸上皮纤毛颤动，降低嗜中性粒细胞的杀菌活性和迁移性。肺炎链球菌溶血素最明显的作用在于红细胞裂解方面，该作用涉及与胆固醇结合。因为肺炎链球菌溶血素是ー种毒素，因此在其可以体内给药前必须脱毒(即以适于保护的剂量提供时对人无毒)。在本领域已知野生型或天然肺炎链球菌溶血素的表达和克隆。參见例如 Walker 等(Infect Immun, 55:1184-1189 (1987)), Mitchell 等(BiochimBiophys Acta, 1007:67-72 (1989)和 Mitchell 等(NAR, 18:4010 (1990))。Ply 的脱毒可以用化学方法进行，例如进行福尔马林或戊ニ醛处理或二者的组合(W0 04081515，PCT/EP2005/010258)。这些方法在本领域众所周知用于多种毒素。或者，ply可以用基因方法脱毒。因此，本发明包括肺炎链球菌蛋白衍生物，该衍生物可为例如突变蛋白。术语“突变的”在本文用于指已使用公知的定点诱变技术或任何其它常规方法缺失、増加或取代一个或多个氨基酸的分子。例如如上所述，突变型Ply蛋白可以被改变，以使其生物失活，但仍保持其致免疫表位，參见，例如，W090/06951, Berry等人(Infect Immun, 67:981-985(1999))，W099/03884和WO 10/71986。遗传地去毒的肺炎链球菌溶血素可以含有如在WO 10/71986中描述的在氨基酸65 (苏氨酸)、293 (甘氨酸)和/或428 (半胱氨酸)处的点突变。要理解的是，本文所用的术语“Ply”是指适于医用的突变或脱毒的(即无毒的)肺炎链球菌溶血素。关于胆碱结合蛋白家族(CbpX),该家族的成员最初被鉴定为能用胆碱亲和层析纯化的肺炎链球菌蛋白。所有胆碱结合蛋白都非共价结合于细胞壁磷壁酸和膜结合脂磷壁酸的磷酸胆碱部分。虽然该蛋白质的确切性质(氨基酸序列、长度等)可以不同，但整个家族具有数个在结构上相同的区域。一般来说，胆碱结合蛋白包含N末端区(N)、保守重复区(Rl和/或R2)、脯氨酸富集区(P)和保守的胆碱结合区(C)，该胆碱结合区由多个重复序列組成，约占该蛋白的一半。本申请中所用的术语“胆碱结合蛋白家族(CbpX)”选自W097/41151中所鉴定的胆碱结合蛋白、PbcA、SpsA、PspC、CbpA> CbpD 和 CbpG。CbpA 公开于 W097/41151,CbpD 和 CbpG 公开于 W000/29434，PspC 公开于 W097/09994，PbcA 公开于 W098/21337。SpsA 为WO 98/39450中公开的胆碱结合蛋白。该胆碱结合蛋白任选地选自CbpA、PbcA、SpsA和PspC0本发明的一个实施方案包括CbpX截短物，其中“CbpX”在上文定义，“截短物”指缺少50%或更多的胆碱结合区(C)的CbpX蛋白。任选地，这样的蛋白质没有整个胆碱结合区。任选地，这样的蛋白截短物没有(i)胆碱结合区和(ii)该蛋白质的N末端一半的一部分，但至少保留一个重复区(Rl或R2)。任选地，该截短物具有两个重复区(Rl和R2)。这些实施方案的实例是在W099/51266或W099/51188中举例说明的NRlxR2和RlxR2，但是，其它没有相似的胆碱结合区的胆碱结合蛋白也包含在本发明的范围内。LytX家族是与细胞裂解有关的膜结合蛋白。N末端结构域包含胆碱结合域，但是，LytX家族并不具有在上述CbpA家族中发现的所有特征，因此，对于本发明来说，LytX家族被认为不同于CbpX家族。与CbpX家族相比，LytX的C末端结构域包含LytX蛋白家族的催化域。该家族包含LytA、B和C。对于LytX家族而言，LytA公开于Ronda等，Eur JBiochem, 164:621-624 (1987)。LytB 公开于 WO 98/18930，也被称为 Sp46。LytC 也公开于TO 98/18930，也被称为Sp91。本发明的实施方案包含LytC。另ー个实施方案包含LytX截短物，其中“LytX”在上文定义，“截短物”指没有50%或更多胆碱结合区的LytX蛋白。任选地，这样的蛋白质没有整个胆碱结合区。本发明的又一个实施方案包含CbpX截短物-LytX截短物嵌合蛋白(或融合体)。任选地，该蛋白包含CbpX的NRlxR2 (或RlxR2)和LytX的C末端部分(Cterm，即没有胆碱结合域)(例如LytCCterm 或 Sp9 ICterm)。任选地,CbpX 选自 CbpA、PbcA、SpsA 和 PspC。任选地其为 CbpA。任选地Lytx为LytC (也被称为Sp91)。本发明的另ー个实施方案为PspA或PsaA截短物，其没有胆碱结合域(C)，并与LytX—起表达为融合蛋白。任选地，LytX为LytC。PsaA和PspA这二者在本领域都是已知的。例如,Berry和Paton, Infect Immun1996年12月；64 (12) :5255-62已描述了 PsaA和其跨膜缺失变体。例如US5804193、WO92/14488和WO 99/53940公开了 PspA和其跨膜缺失变体。Spl28和Spl30公开于W000/76540。Spl25是带有细胞壁锚定基序LPXTG (其中X为任何氨基酸)的肺炎链球菌表面蛋白的实例。具有此基序的这类肺炎链球菌表面蛋白中的任何蛋白在本发明范围内都已被发现是有用的，因此将其视为本发明的另ー种蛋白。Spl25本身公开于WO 98/18930，也称为ZmpB-锌金属蛋白酶。SplOl公开于WO 98/06734(其中它的索引为# y85993)。其特征为I型信号序列。Spl33公开于WO 98/06734 (其中它的索引为# y85992)。其也以I型信号序列为特征。可包含在联合疫苗(尤其是用于预防中耳炎的联合疫苗)中的粘膜炎莫拉菌(.Moraxella catarrhal Is^)蛋白抗原的实例为0MP106 [W0 97/41731 (Antex)和 WO96/34960 (PMC) ] ；0MP21 或其片段(W0 0018910) ；LbpA 和/或 LbpB [W0 98/55606(PMC)] ;TbpA 和/或 TbpB [W0 97/13785 和 WO 97/32980 (PMC)] ；CopB [Helminen ME,等 A (1993) Infect。 Immun。 61:2003-2010] ；UspAl 和/或 UspA2 [WO 93/03761(University of Texas)] ;0mpCD ;HasR (PCT/EP99/03824) ；PilQ (PCT/EP99/03823)；0MP85 (PCT/EP00/01468) ；lipo06 (GB 9917977. 2) ；lipol0 (GB 9918208. I) ；lipoll (GB9918302.2) ；lipol8 (GB 9918038.2) ；P6 (PCT/EP99/03038) ；D15 (PCT/EP99/03822)；OmplAl (PCT/EP99/06781) ；Hly3 (PCT/EP99/03257);和 OmpE。可包含在联合疫苗(尤其是用于预防中耳炎的联合疫苗)中的不可分型流感嗜血杆菌抗原或其片段的实例包括丝束蛋白[(US 5766608 - Ohio State Research Foundation)]和含有来自它的妝的融合 体[例如 LBl (f)肽融合体；US 5843464 (OSU)或 WO 99/64067] ；0MP26 [W0 97/01638(Cortecs)] ；P6 [EP 281673 (State University of New York)] ；TbpA 和/或 TbpB ;Hia ；Hsf ；Hin47 ；Hif ；Hmwl ；Hmw2 ；Hmw3 ；Hmw4 ；Hap ；D15 (WO 94/12641) ；P2 ；和 P5 (WO94/26304)。本发明的蛋白也可以进行有益的组合。所述组合的是指免疫原性组合物包含来自以下组合中的所有蛋白，其或者为载体蛋白，或者为游离蛋白，或者为二者的混合物。例如，在后文陈述的两种蛋白的组合中，两种蛋白都可以用作载体蛋白，或者两种蛋白都可以作为游离蛋白存在，或者两种蛋白都可以作为载体蛋白和游离蛋白存在，或者ー个可作为载体蛋白和游离蛋白存在，而另ー个仅作为载体蛋白或仅作为游离蛋白存在。当给出3种蛋白的组合时，存在类似的可能性。组合包括但不限于PhtD + NRlxR2、PhtD +NRlxR2-Sp9ICterm 嵌合蛋白或融合蛋白、PhtD + Ply,PhtD + Sp128,PhtD + PsaA,PhtD +PspA、PhtA + NRlxR2、PhtA + NRlxR2_Sp91Cterm 嵌合蛋白或融合蛋白、PhtA + Ply、PhtA +Spl28、PhtA + PsaA, PhtA + PspA、NRlxR2 + LytC、NRlxR2 + PspA、NRlxR2 + PsaA,NRlxR2 + Spl28、RlxR2 + LytC、RlxR2 + PspA、RlxR2 + PsaA, RlxR2 + Spl28、RlxR2 +PhtD、RlxR2 + PhtA。任选地，NRlxR2(或 RlxR2)来自 CbpA 或 PspC。任选地，其来自 CbpA。其它组合包括3种蛋白组合，例如PhtD + NRlxR2 + Ply以及PhtA + NRlxR2 + PhtD。在一个实施方案中，疫苗组合物包含解毒的肺炎链球菌溶血素以及PhtD或PhtDE作为载体蛋白。在又一个实施方案中，疫苗组合物包含解毒的肺炎链球菌溶血素以及PhtD或PhtDE作为游离蛋白。本发明还提供含有本发明的免疫原性组合物和药学上可接受的赋形剂的疫苗。本发明的疫苗可被佐剂化，尤其是在计划用于老年人群而且用于婴儿人群吋。适宜的佐剂包括铝盐，例如氢氧化铝凝胶或磷酸铝或明矾，而且可以为其它金属盐，例如钙盐、镁盐、铁盐或锌盐，或者可为酰化酪氨酸或酰化糖、阳离子或阴离子衍生化糖或聚磷腈的不溶性混悬液。任选地选择为THl型应答的优先诱导物的佐剂。这些高水平的Thl型细胞因子倾向于支持诱导针对给定抗原的细胞介导的免疫应答，而高水平的Th2型细胞因子倾向于支持诱导针对抗原的体液免疫应答。Thl和Th2型免疫应答的区别不是绝对的。实际上，个体将支持被描述为以Thl为主或以Th2为主的免疫应答。然而，经常便利地根据Mosmann和Coffman在鼠⑶4 +veT 细胞克隆中所描述的(Mosmann, T. R.和 Coffman, R. L. (1989) THl and Th2 cells:different patterns of lymphokine secretion lead to different functionalproperties. (Annual Review of Immunology, 7, 145-173 页)考虑细胞因子家族。传统上，Thl型应答与T淋巴细胞生产INF-γ和IL-2细胞因子有关。经常与Thl型免疫应答的诱导直接相关的其它细胞因子不由T细胞产生，例如IL-12。相比之下，Th2型应答与11-4、IL-5、IL-6、IL-IO的分泌有关。主要促进Thl应答的适宜佐剂系统包括单磷酰脂质A或其衍生物(或通常为解毒的脂质A -参见例如W02005107798)，尤其是3-脱-O-酰化单磷酰脂质A (3D-MPL)(关于其制备参见GB 2220211 A);以及单磷酰脂质A、任选的3-脱-O-酰化单磷酰脂质A连同铝盐(例如磷酸铝或氢氧化铝)或水包油乳剂的组合。在这些组合中， 抗原和3D-MPL包含在相同的颗粒结构中，允许更有效地传递抗原性和免疫刺激性信号。研究表明，3D-MPL能够进一步增强明矾吸附抗原的免疫原性[Thoelen等，Vaccine (1998)16:708-14 ；EP 689454-B1]。增强的系统包括单磷酰脂质A和皂苷衍生物的组合，尤其是如在WO 94/00153中公开的QS21和3D-MPL的组合，或者如在WO 96/33739中公开的较少反应原性的组合物，其中QS21用胆固醇猝灭。在WO 95/17210中描述了一种特别有效的佐剂制剂，其包含在水包油乳剂中的QS21、3D-MPL和生育酚。在一个实施方案中，免疫原性组合物另外含有皂苷，其可为QS21。制剂还可以包含水包油乳剂和生育酚(W0 95/17210)。含有寡核苷酸的未甲基化CpG (W0 96/02555)和其它免疫调节性寡核苷酸(W00226757和W003507822)也是THl应答的优先诱导物，适用于本发明。通过将含有本发明的免疫原性组合物的疫苗制备物经全身或粘膜途径给药，所述疫苗制备物可用于保护或治疗易于感染的哺乳动物。这些给药可包括经肌肉内(頂)、腹膜内(IP)、真皮内(ID)或皮下(SC)途径注射；或经粘膜施用至口 /消化道、呼吸道、泌尿生殖道。疫苗的鼻内(IN)施用可能用于治疗肺炎或中耳炎(由于能更有效地阻止肺炎链球菌的鼻咽携带，因此能在其最早期减弱感染)。尽管本发明的疫苗可作为单次剂量施用，但其组分也可以同时或在不同时间一起共施用(例如肺炎链球菌糖缀合物可单独施用、同时施用，或在施用疫苗的任何细菌蛋白组分之后1-2周施用，用于彼此之间免疫应答的最佳协调)。对于共施用，任选的Thl佐剂可存在于任意的或全部的不同给药中。除了单一给药途径之夕卜，还可使用2种不同的给药途径。例如，可頂(或ID)施用糖或糖缀合物，可IN (或ID)施用细菌蛋白。另外，本发明的疫苗可頂施用初次剂量，IN施用加强剂量。疫苗中的蛋白抗原的含量通常在1-100 μ g的范围内，任选地5-50 μ g，例如在5-25 μ g的范围内。在初始接种后，受试者可接受I次或数次足够间隔的加强免疫。疫苗制剂一般描述于Vaccine Design (“The subunit and adjuvant approach”(Powell M. F.和 Newman M. J.编辑)(1995) Plenum Press New York)。在脂质体中的囊化描述于Fullerton,美国专利4，235，877。本发明的疫苗或免疫原性组合物可储存在溶液中，或低压冻干。在一个实施方案中，溶液在用作无定形冻干保护剂的糖存在下冻干，所述糖例如为蔗糖、海藻糖、葡萄糖、甘露糖、麦芽糖或乳糖。在一个实施方案中，溶液在用作无定形冻干保护剂的糖和提供改善的块状结构的填充剂(例如甘氨酸或甘露醇)存在下冻干。晶体填充剂的存在允许在高盐浓度存在下缩短冻干周期。用于冻干本发明的免疫原性组合物或疫苗的这些混合物的实例包括蔗糖/甘氨酸、海藻糖/甘氨酸、葡萄糖/甘氨酸、甘露糖/甘氨酸、麦芽糖/甘氨酸、蔗糖/甘露醇/海藻糖/甘露醇、葡萄糖/甘露醇、甘露糖/甘露醇和麦芽糖/甘露醇。典型地，两种成分的摩尔比率任选地为1:1、1:2、1:3、1:4、1:5或1:6。本发明的免疫原性组合物任选地含有上述冻干试剂。上述稳定剂和稳定剂的混合物还可以包括能够增加制剂的玻璃化温度(Tg’ )的聚合物，例如聚(乙烯吡咯烷酮)(PVP)、羟乙基淀粉或葡聚糖，或者用作晶体填充剂的聚合物，例如聚乙二醇(PEG)，例如具有1500-6000分子量的聚乙二醇，和葡聚糖。本发明的免疫原性组合物任选地被冻干，并在使用前临时重配。冻干可产生更稳 定的组合物(疫苗)，并在存在3D-MPL和没有基于铝的佐剂的情况下可能产生更高的抗体效价。在本发明的一个方面，提供一种疫苗试剂盒，其包括含有本发明的免疫原性组合物(任选地为冻干形式)的小瓶，并还包括含有本文所述佐剂的小瓶。可预见的是，在本发明的该方面，佐剂将用于重配冻干的免疫原性组合物。本发明还通过加入缀合形式的流感嗜血杆菌蛋白(例如蛋白D)来提供用于预防或减轻流感嗜血杆菌所致中耳炎的改良疫苗。另外，本发明还通过依靠向本发明的肺炎链球菌缀合组合物加入为游离或缀合蛋白的一种或两种肺炎链球菌蛋白提供在婴儿中预防或减轻肺炎链球菌感染(例如中耳炎)的改良疫苗。所述肺炎链球菌游离蛋白可与用作载体蛋白的任何肺炎链球菌蛋白相同或不同。一种或多种粘膜炎莫拉菌(Moraxellacatarrhal I s)蛋白抗原也可以游离或缀合形式包含在联合疫苗中。因此，本发明为在婴儿中激发抵御中耳炎的(保护性)免疫应答的改良方法。在另一个实施方案中，本发明为通过施用安全有效量的本发明疫苗[儿科疫苗]在婴儿(在本发明背景下定义为0-2岁)中激发(保护性)免疫应答的改良方法。此外，本发明的实施方案包括提供用于药物的本发明的抗原性肺炎链球菌缀合组合物以及本发明的肺炎链球菌缀合物在制造用于预防(或治疗)肺炎链球菌疾病的药物中的用途。在又一个实施方案中，本发明为通过施用安全有效量的本发明疫苗，任选地连同一种或两种作为游离或缀合蛋白存在的肺炎链球菌蛋白，在老年人群(在本发明背景下患者如果为50岁或以上、通常超过55岁以及更通常超过60岁，则被视为老年人)中激发(保护性)免疫应答的改良方法，所述游离的肺炎链球菌蛋白可与用作载体蛋白的任何肺炎链球菌蛋白相同或不同。本发明的又一方面是免疫人类宿主抵御肺炎链球菌和任选的流感嗜血杆菌感染所致疾病的方法，所述方法包括给所述宿主施用免疫保护剂量的本发明的免疫原性组合物或疫苗或试剂盒。本发明的又一方面是用于治疗或预防肺炎链球菌和任选的流感嗜血杆菌感染所致疾病的免疫原性组合物。本发明的又一方面是本发明的免疫原性组合物或疫苗或试剂盒在制造药物中的用途，所述药物用于治疗或预防肺炎链球菌和任选的流感嗜血杆菌感染所致疾病。在所有情况下，本发明人都意欲用术语“由……组成”分别任选地取代本文的术语“包含”、“含有”和“包括”。本文的涉及本发明的“疫苗组合物”的实施方案也适用于与本发明的“免疫原性组合物”相关的实施方案，反之亦然。在本专利说明书中提及的所有参考文献或专利申请都通过引用结合到本文中。为了可更好地理解本发明，提供以下实施例。这些实施例仅是为了例证目的，不应解释为以任何方式限制本发明的范围。
实施例·实施例1.缀合方法
通过与在WO 06/110381中公开的方法类似的还原胺化方法，使每种血清型多糖与CRM197载体蛋白缀合，制备出构成7价Prevnar疫苗的肺炎球菌缀合物。都与CRM197缀合的肺炎球菌血清型4、6B、9V、14、18C、19F和23F存在于7vCRM疫苗中。Synflorix含有与7vCRM相同的血清型以及额外的血清型1、5和7F。血清型1、4、
5、6B、7F、9V、14和23F多糖与来自无法分型的流感嗜血杆菌的蛋白D缀合，18C多糖与破伤风类毒素缀合，19F多糖与白喉类毒素缀合。所述缀合反应使用氰基化试剂CDAP，且基本上如 TO 09/00824 所述。如下经由ADH接头缀合血清型18C :使用碳二亚胺化学法(EDAC)，用ADH活化破伤风类毒素，并使用CDAP化学法，使多糖18C与TT-ADH偶联。所述反应基本上如WO 09/00824所述。实施例Ia通讨CDAP来缀合肺炎链球菌血清型23
将200mg微流化的PS23F溶解于水中，直到得到10mg/ml的浓度。以2M的终浓度，将NaCl加入该溶液中。加入足够的CDAP溶液(100mg/ml，在5/50 v/v乙腈/WFI中新制备)，以达到
0.75mg/mg PS 的 CDAP: PS 比。90秒以后，通过加入O. IM NaOH，使pH升高至pH 9.5。3分钟以后，加入足够的CRM197 (10mg/ml，在O. 15M NaCL中)，以达到I. 5的比例(CRM197:PS (w/w))，使pH维持在pH 9.5。在pH 9. 5，温育该溶液I小时。在该偶联步骤以后，将IOml 2M甘氨酸溶液加入混合物中，并将pH调至pH9. O(猝灭pH)。将所述溶液在室温搅拌30分钟。使用5 μ m过滤器纯化缀合物，随后使用S^hacrylS400HR (XK50/100)去除小分子和未缀合的多糖和蛋白。流速固定在150ml/小时。使用150mM NaCl进行洗脱。合并目标级分，并使用Milipack 20进行过滤。得到的缀合物具有
1.35/1 (w/w)的最终 CRM197/PS 比例(w/w)。实施例2.对比7vCRM197 (Prevnar)和PHiD-CV (SvnfIorix)疫苗的临床试验数&
对比了由7vCRM197和PHiD-CV引起的针对肺炎链球菌19F和19A的免疫应答。两种疫苗都含有19F缀合物，在7vCRM197中，其通过还原胺化与无毒的白喉毒素CRM197缀合，在PHiD-CV中，其使用氰基化试剂CDAP与白喉类毒素缀合。任一种疫苗都不含有19A缀合物，但是，19A和19F之间的结构相似性允许在用19F免疫以后产生一些针对19A的交叉反应性的抗体。血清样品
评论了来自3个激发免疫接种研究(001、011和012) 8,的数据，所述研究对比了在3剂量激发系列(激发研究细节参见表I)中施用给婴儿的7vCRM和PHiD-CV。还分析了与每个激发研究有关的强化研究数据(0078、0179和018)(强化研究细节参见表2)。在所有研究中，在第3剂以后I个月(激发研究)和强化剂量以后I个月(强化研究),收集血液样品。免疫学试验
使用由GSK Biologicals开发的包括22F-预温育步骤的ELISA (GSK-22F-ELISA)，评价了针对血清型19F和有关的血清型19A的抗体应答，其中加入异源的血清型22F多糖，以去除非血清型特异性的和非调理素的抗体6，7。 22F-抑制 ELISA 的试验灵敏度是 0.05Pg/mL IgG。 使用GSK和THL OPA试验，评价了功能性抗体应答，所述试验使用改进的HL-60细胞WHO参照方法2Λ将OPA滴度定义为，与对照孔相比，诱导> 50%细菌细胞死亡的最低血清稀释度的倒数，并使用> 8的滴度(1:8的血清稀释度)作为该试验的阈值2，4。另外，将具有彡2.(^g/mL的针对血清型19F (来自David Goldblatt博士，Institute of Child Health, UK)的抗体浓度且来自未免疫的健康成年人(来自国立卫生研究院(National Institutes of Health)血库，Bethesda, Maryland)的血清用于不同形式的血清型19F抗原(未缀合的天然多糖，和使用还原胺化和氰基化缀合的19F)的结合和抑制。统计分析
以95%置信区间，计算具有彡O. 2Pg/mL的ELISA IgG抗体浓度的血清样品的百分比，和具有> 8的OPA滴度的血清样品的百分比。计算几何平均OPA滴度(GMT)和几何平均0PA/ELISA比(GMR)，以便评价与单独的抗体滴度相对比的功能活性。桥连GSK和THL OPA试验，以评估在不同实验室中的OPA应答的变异性水平。结果
对于共709个用PHiD-CV激发的婴儿和331个用7vCRM激发的婴儿(表1)，和对于共690个用PHiD-CV强化的婴儿和292个用7vCRM强化的婴儿(表2)，可得到至少一种血清型(19A或19F)的数据。免疫原性
血清型19F -激发免疫接种
在3个激发研究中，87. 7-99. 3%的接受PHiD-CV的婴儿实现了彡8的针对血清型19F的OPA滴度，与此相比的是，91. 3-92. 1%的接受7vCRM的婴儿(图2)。在接受PHiD-CV的婴儿中，血清型19F的OPA GMT和OPA/ELISA GMR更高(表I)。血清型19F -强化疫苗接种
在强化研究中，在94. 9-100. 0%的接受PHiD-CV的婴儿中实现了彡8的针对血清型19F的OPA滴度，与此相比的是，92. 5-98. 5%的接受7vCRM的婴儿(图2)。在接受PHiD-CV的婴儿中，血清型19F的OPA GMT更高，且就两种疫苗而言，OPA/ELISA GMR是在相同范围内(表2)。血清型19A -激发免疫接种
在19. 6-28. 7%的接受PHiD-CV的婴儿中实现了彡8的针对交叉反应性血清型19A的OPA滴度，与此相比的是，O. 0-3. 4%的接受7vCRM的婴儿(图3)。在接受PHiD-CV的婴儿中，血清型19A的OPA GMT更高(表I)。血清型19A -强化疫苗接种
在37. 7-69. 2%的接受PHiD-CV的婴儿中实现了彡8的针对交叉反应性血清型19A的 OPA滴度，与此相比的是，24. 0-37. 5%的接受7vCRM的婴儿(图3)。在接受PHiD-CV的婴儿中，血清型19A的OPA GMT通常更高(表2)。桥连OPA试验
当在桥连研究中评估时，GSK和THL之间的19F OPA结果是相当的，而在GSK处的19AOPA试验似乎会低估应答。在THL，高比例的19F-缀合物免疫的儿童被证实是19A OPA血清阳性的，而在GSK处是血清阴性的。结论
通过OPA试验测得，与含有通过还原胺化制备的19F-CRM197的7vCRM疫苗接种相比，PHiD-CV(含有经由氰基化缀合化学法制备的19F-DT)会诱导更高水平的针对血清型19F的功能抗体。使用氰基化缀合实现的针对血清型19F的更高OPA应答，也导致PHiD-CV与7vCRM相比提高的针对交叉反应性血清型19A的OPA应答。桥连数据提示，GSK 19A OPA试验会低估血清型19A OPA应答。
权利要求
1.ー种包含至少2种不同肺炎链球菌荚膜糖的免疫原性组合物，其中一种或多种选自由血清型1、3、19A和19F组成的第一组并且通过除了还原胺化以外的化学法直接地或间接地与蛋白载体相连，以及ー种或多种不同的糖选自由血清型4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C和23F组成的第二组并且通过还原胺化与蛋白载体相连。
2.根据权利要求I所述的免疫原性组合物，其包含通过除了还原胺化以外的化学法与蛋白载体缀合的血清型I肺炎链球菌荚膜糖。
3.根据权利要求2所述的免疫原性组合物，其中所述血清型I肺炎链球菌荚膜糖通过氰基化化学法诸如CDAP化学法与蛋白载体缀合。
4.根据权利要求2所述的免疫原性组合物，其中所述血清型I肺炎链球菌荚膜糖通过碳ニ亚胺化学法与蛋白载体缀合。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的免疫原性组合物，其包含通过除了还原胺化以外的化学法与蛋白载体缀合的血清型3肺炎链球菌荚膜糖。
6.根据权利要求5所述的免疫原性组合物，其中所述血清型3肺炎链球菌荚膜糖通过氰基化化学法诸如CDAP化学法与蛋白载体缀合。
7.根据权利要求5所述的免疫原性组合物，其中所述血清型3肺炎链球菌荚膜糖通过碳ニ亚胺化学法与蛋白载体缀合。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的免疫原性组合物，其包含通过除了还原胺化以外的化学法与蛋白载体缀合的血清型19A肺炎链球菌荚膜糖。
9.根据权利要求8所述的免疫原性组合物，其中所述血清型19A肺炎链球菌荚膜糖通过氰基化化学法诸如CDAP化学法与蛋白载体缀合。
10.根据权利要求8所述的免疫原性组合物，其中所述血清型19A肺炎链球菌荚膜糖通过碳ニ亚胺化学法与蛋白载体缀合。
11.根据权利要求1-10中任一项所述的免疫原性组合物，其包含通过除了还原胺化以外的化学法与蛋白载体缀合的血清型19F肺炎链球菌荚膜糖。
12.根据权利要求11所述的免疫原性组合物，其中所述血清型19F肺炎链球菌荚膜糖通过氰基化化学法诸如CDAP化学法与蛋白载体缀合。
13.根据权利要求11所述的免疫原性组合物，其中所述血清型19F肺炎链球菌荚膜糖通过碳ニ亚胺化学法与蛋白载体缀合。
14.根据权利要求1-13中任一项所述的免疫原性组合物，其包含通过还原胺化与蛋白载体缀合的血清型4肺炎链球菌荚膜糖。
15.根据权利要求1-14中任一项所述的免疫原性组合物，其包含通过还原胺化与蛋白载体缀合的血清型5肺炎链球菌荚膜糖。
16.根据权利要求1-15中任一项所述的免疫原性组合物，其包含通过还原胺化与蛋白载体缀合的血清型6A肺炎链球菌荚膜糖。
17.根据权利要求1-16中任一项所述的免疫原性组合物，其包含通过还原胺化与蛋白载体缀合的血清型6B肺炎链球菌荚膜糖。
18.根据权利要求1-17中任一项所述的免疫原性组合物，其包含通过还原胺化与蛋白载体缀合的血清型7F肺炎链球菌荚膜糖。
19.根据权利要求1-18中任一项所述的免疫原性组合物，其包含通过还原胺化与蛋白载体缀合的血清型9V肺炎链球菌荚膜糖。
20.根据权利要求1-19中任一项所述的免疫原性组合物，其包含通过还原胺化与蛋白载体缀合的血清型14肺炎链球菌荚膜糖。
21.根据权利要求1-20中任一项所述的免疫原性组合物，其包含通过还原胺化与蛋白载体缀合的血清型18C肺炎链球菌荚膜糖。
22.根据权利要求1-21中任一项所述的免疫原性组合物，其包含通过还原胺化与蛋白载体缀合的血清型23F肺炎链球菌荚膜糖。
23.任ー项前述权利要求所述的免疫原性组合物，其包含通过除了还原胺化以外的缀合方法与载体蛋白缀合的血清型19F肺炎链球菌荚膜糖和通过还原胺化与载体蛋白缀合 的血清型23F肺炎链球菌荚膜糖。
24.任ー项前述权利要求所述的免疫原性组合物，其包含通过除了还原胺化以外的缀合方法与载体蛋白缀合的血清型19A肺炎链球菌荚膜糖和通过还原胺化与载体蛋白缀合的血清型23F肺炎链球菌荚膜糖。
25.任ー项前述权利要求所述的免疫原性组合物，其包含通过除了还原胺化以外的缀合方法与载体蛋白缀合的血清型19F肺炎链球菌荚膜糖和通过还原胺化与载体蛋白缀合的血清型6B和23F肺炎链球菌荚膜糖。
26.任ー项前述权利要求所述的免疫原性组合物，其包含通过除了还原胺化以外的缀合方法与载体蛋白缀合的血清型19A肺炎链球菌荚膜糖和通过还原胺化与载体蛋白缀合的血清型6B和23F肺炎链球菌荚膜糖。
27.根据权利要求23-26中任一项所述的免疫原性组合物，其中所述除了还原胺化以外的缀合方法是氰基化反应例如CDAP化学法。
28.任ー项前述权利要求所述的免疫原性组合物，其中所述载体蛋白选自破伤风类毒素、白喉类毒素、CRM197、蛋白D、肺炎链球菌溶血素和PhtD或其片段或融合蛋白。
29.任ー项前述权利要求所述的免疫原性组合物，其中2种不同的载体蛋白分别与至少2种不同肺炎链球菌荚膜糖血清型缀合。
30.根据权利要求1-28中任一项所述的免疫原性组合物，其中3种不同的载体蛋白分别与至少3种不同肺炎链球菌荚膜糖血清型缀合。
31.根据权利要求1-28中任一项所述的免疫原性组合物，其中4种不同的载体蛋白分别与至少4种不同肺炎链球菌荚膜糖血清型缀合。
32.根据权利要求1-28中任一项所述的免疫原性组合物，其中5种不同的载体蛋白分别与至少5种不同肺炎链球菌荚膜糖血清型缀合。
33.根据权利要求1-32中任一项所述的免疫原性组合物，其包含与蛋白D或CRM197缀合的肺炎链球菌荚膜糖I。
34.根据权利要求1-33中任一项所述的免疫原性组合物，其包含与蛋白D、CRM197、肺炎链球菌溶血素或PhtD或其片段或融合蛋白缀合的肺炎链球菌荚膜糖3。
35.根据权利要求1-34中任一项所述的免疫原性组合物，其包含与蛋白D或CRM197缀合的肺炎链球菌荚膜糖4。
36.根据权利要求1-35中任一项所述的免疫原性组合物，其包含与蛋白D或CRM197缀合的肺炎链球菌荚膜糖5。
37.根据权利要求1-36中任一项所述的免疫原性组合物，其包含与蛋白D或CRM197缀合的肺炎链球菌荚膜糖6B。
38.根据权利要求中任一项所述的免疫原性组合物1-37，其包含与蛋白D或CRM197缀合的肺炎链球菌荚膜糖7F。
39.根据权利要求1-38中任一项所述的免疫原性组合物，其包含与蛋白D或CRM197缀合的肺炎链球菌荚膜糖9V。
40.根据权利要求1-39中任一项所述的免疫原性组合物，其另外包含与蛋白D或CRM197缀合的肺炎链球菌荚膜糖14。
41.根据权利要求1-40中任一项所述的免疫原性组合物，其包含与蛋白D或CRM197缀合的肺炎链球菌荚膜糖23F。
42.根据权利要求1-41中任一项所述的免疫原性组合物，其包含与破伤风类毒素或CRM197缀合的肺炎链球菌荚膜糖18C。
43.根据权利要求1-42中任一项所述的免疫原性组合物，其包含与肺炎链球菌溶血素或CRM197缀合的肺炎链球菌荚膜糖19A。
44.根据权利要求1-43中任一项所述的免疫原性组合物，其包含与CRM197或PhtD或其片段或融合蛋白缀合的肺炎链球菌荚膜糖22F。
45.根据权利要求1-44中任一项所述的免疫原性组合物，其包含与肺炎链球菌溶血素或流行性感冒杆菌蛋白、任选的蛋白D或PhtD或其融合蛋白或CRM197缀合的肺炎链球菌荚膜糖6A。
46.根据任ー项前述权利要求所述的免疫原性组合物，其中所述血清型I荚膜糖与载体蛋白直接缀合。
47.根据权利要求1-46中任一项所述的免疫原性组合物，其中血清型I荚膜糖经由接头与载体蛋白缀合。
48.根据权利要求47所述的免疫原性组合物，其中所述接头包含马来酰亚胺。
49.根据权利要求47或48所述的免疫原性组合物，其中所述接头通过碳ニ亚胺化学法、任选地使用EDAC与所述糖相连。
50.根据权利要求47-49中任一项所述的免疫原性组合物，其中所述血清型I糖使用马来酰亚胺化学法与载体蛋白缀合或与接头缀合。
51.根据权利要求1-50中任一项所述的免疫原性组合物，其中载体蛋白与血清型I糖的比例是在5:1至1:5、4:1至I: I、或3. 5:1至2. 5:1 (w/w)之间。
52.根据任ー项前述权利要求所述的免疫原性组合物，其中所述血清型3荚膜糖与载体蛋白直接缀合。
53.根据权利要求1-51中任一项所述的免疫原性组合物，其中血清型3荚膜糖经由接头与载体蛋白缀合。
54.根据权利要求53所述的免疫原性组合物，其中所述接头是ADH。
55.根据权利要求53或54所述的免疫原性组合物，其中所述接头通过碳ニ亚胺化学法、任选地使用EDAC与载体蛋白相连。
56.根据权利要求53-55中任一项所述的免疫原性组合物，其中所述血清型3糖使用EDAC化学法与载体蛋白缀合或与接头缀合。
57.根据权利要求1-56中任一项所述的免疫原性组合物，其中载体蛋白与血清型3糖的比例是在5:1至1:5、4:1至I: I、或2:1至I: I (w/w)之间。
58.根据权利要求1-57中任一项所述的免疫原性组合物，其中所述血清型6B糖与蛋白载体缀合，其中载体蛋白与血清型6B糖的比例是在5:1至1:5、4:1至1:1、3. 5:1至2: I、或2:1至1:1之间。
59.任ー项前述权利要求所述的免疫原性组合物，其中所述19A糖的平均大小大于IOOkDa,或在 110-700 kDa、110-300、120-200、130-180、或 140-160 kDa 之间。
60.根据权利要求59所述的免疫原性组合物，其中所述19A糖是天然多糖，或被调整大小不超过x5的因数。
61.根据权利要求59或60所述的免疫原性组合物，其中所述19A糖已经通过微流化来调整大小。
62.任ー项前述权利要求所述的免疫原性组合物，其中所述19A糖缀合物的剂量是在1-10 u g>l-5 y g 或 1-3 iig 糖之间。
63.根据权利要求62所述的免疫原性组合物，其中所述19A糖缀合物的剂量是3Ug糖。
64.任ー项前述权利要求所述的免疫原性组合物，其中所述糖的平均大小大于50kDa。
65.根据权利要求64所述的免疫原性组合物，其包含具有在300-400kDa之间的平均糖大小的血清型I。
66.根据权利要求64或65所述的免疫原性组合物，其包含具有在75-125kDa之间的平均糖大小的血清型4。
67.根据权利要求64、65或66所述的免疫原性组合物，其包含具有在350-450kDa之间的平均糖大小的血清型5。
68.根据权利要求64-67中任一项所述的免疫原性组合物，其包含具有在1000-1400kDa或500-50kDa或400_200kDa或400_300kDa或50_100kDa之间的平均糖大小的血清型6B。
69.根据权利要求64-68中任一项所述的免疫原性组合物，其包含具有在200-300kDa之间的平均糖大小的血清型7F。
70.根据权利要求64-69中任一项所述的免疫原性组合物，其包含具有在250-300kDa之间的平均糖大小的血清型9V。
71.根据权利要求64-70中任一项所述的免疫原性组合物，其包含具有在200-250kDa之间的平均糖大小的血清型14。
72.根据权利要求64-71中任一项所述的免疫原性组合物，其包含具有在900-1000kDa之间的平均糖大小的血清型23F。
73.任ー项前述权利要求所述的免疫原性组合物，其包含血清型5、6B和23F(和任选地，6A)作为天然糖。
74.任ー项前述权利要求所述的免疫原性组合物，其中所述荚膜糖缀合物的剂量是在1-10 yg、l_5 Ug或1-3 Ug糖/缀合物之间。
75.任ー项前述权利要求所述的免疫原性组合物，其包含剂量为3Ug糖/綴合物的血清型4、18C、19F和22F (和任选地，19A)的缀合物。
76.任ー项前述权利要求所述的免疫原性组合物，其包含剂量为IUg糖/綴合物的血清型1、5、6B、7F、9V、14和23F (和任选地，6A和/或3)的缀合物。
77.任ー项前述权利要求所述的免疫原性组合物，其另外包含未缀合的肺炎链球菌糖，所述未缀合的肺炎链球菌糖的血清型不同于缀合的那些，使得缀合的和未缀合的糖血清型的数目小于或等于23。
78.任ー项前述权利要求所述的免疫原性组合物，其另外包含一种或多种未缀合的或缀合的肺炎链球菌蛋白。
79.根据权利要求78所述的免疫原性组合物，其包含一种或多种未缀合的肺炎链球菌蛋白。
80.根据权利要求78或79所述的免疫原性组合物，其中所述ー种或多种肺炎链球菌蛋白选自聚组氨酸三联体家族(PhtX)、胆碱结合蛋白家族(CbpX)、CbpX截短物、LytX家族、LytX截短物、CbpX截短物-LytX截短物嵌合蛋白、去毒的肺炎链球菌溶血素(Ply)、PspA,PsaA, Spl28、SplOU Spl30、Spl25 和 Spl33。
81.根据权利要求78、79或80所述的免疫原性组合物，其包含肺炎链球菌溶血素。
82.根据权利要求78-81中的任一项所述的免疫原性组合物，其包含PhtX蛋白。
83.根据任ー项前述权利要求所述的免疫原性组合物，其包含肺炎链球菌溶血素作为游离蛋白或载体蛋白。
84.根据任ー项前述权利要求所述的免疫原性组合物，其包含PhtX蛋白作为游离蛋白或载体蛋白。
85.根据权利要求84所述的免疫原性组合物，其中所述PhtX蛋白是PhtD或PhtBD或PhtDE融合蛋白。
86.根据任ー项前述权利要求所述的免疫原性组合物，其另外包含佐剂。
87.根据权利要求1-86中任一项所述的免疫原性组合物，其包含至少或准确的10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20种肺炎链球菌荚膜糖。
88.ー种疫苗，其包含根据权利要求1-87中任一项所述的免疫原性组合物和药学上可接受的赋形剂。
89.一种制备根据权利要求88所述的疫苗的方法，所述方法包括下述步骤将根据权利要求1-87中任一项所述的免疫原性组合物与药学上可接受的赋形剂相混合。
90.ー种免疫人宿主免于由肺炎链球菌感染造成的疾病的方法，所述方法包括给所述宿主施用免疫保护剂量的根据权利要求1-87中任一项所述的免疫原性组合物或根据权利要求88所述的疫苗。
91.根据权利要求90所述的方法，其中所述人宿主是老年人，所述疾病是肺炎或侵袭性肺炎球菌疾病(iro)中的任ー种或两种。
92.根据权利要求90或91所述的方法，其中所述人宿主是老年人，所述疾病是慢性阻塞性肺疾病(COPD)的恶化。
93.根据权利要求90所述的方法，其中所述人宿主是婴儿，所述疾病是中耳炎。
94.根据权利要求90或93所述的方法，其中所述人宿主是婴儿，所述疾病是脑膜炎和/或菌血症。
95.根据权利要求90、93或94所述的方法，其中所述人宿主是婴儿，所述疾病是肺炎和/或結膜炎。
96.根据权利要求1-87所述的免疫原性组合物或根据权利要求88所述的疫苗，其用于治疗或预防由肺炎链球菌感染造成的疾病。
97.根据权利要求1-87所述的免疫原性组合物或疫苗或根据权利要求88所述的疫苗在药物生产中的用途，所述药物用于治疗或预防由肺炎链球菌感染造成的疾病。
98.根据权利要求97所述的用途，其中所述疾病是老年人的肺炎或侵袭性肺炎球菌疾病(IF1D)中的任一种或两种。
99.根据权利要求97或98所述的用途，其中所述疾病是老年人的慢性阻塞性肺疾病(COPD)的恶化。
100.根据权利要求97所述的用途，其中所述疾病是人类婴儿的中耳炎。
101.根据权利要求97或100所述的用途，其中所述疾病是人类婴儿的脑膜炎和/或菌血症。
102.根据权利要求97、100或101所述的用途，其中所述疾病是人类婴儿的肺炎和/或結膜炎。
103.一种在婴儿中引发针对中耳炎的保护性免疫应答的方法，所述方法包括，顺序地或伴随地以作为分开的或组合的组分施用下述物质(i)根据权利要求1-103中任ー项所述的免疫原性组合物或疫苗，和(ii)来自流感嗜血杆菌的蛋白D，所述蛋白D可以是游离的和/或缀合的。
104.一种在婴儿中引发针对肺炎链球菌的保护性免疫应答的方法，其中施用任ー项前述权利要求所述的免疫原性组合物或疫苗。
105.ー种在老年人中引发针对肺炎链球菌的保护性免疫应答的方法，其中以组合的形式、顺序地或伴随地施用(i)任ー项前述权利要求所述的免疫原性组合物或疫苗，(ii) 一种或多种肺炎链球菌表面蛋白，其选自PhtX家族和肺炎链球菌溶血素。
106.根据权利要求1-87所述的免疫原性组合物或根据权利要求88所述的疫苗，其包含从至少所有下述血清型衍生出的糖缀合物4、6B、9V、14、18C、19F、23F、1、5、7F，其中针对疫苗组分4、6B、9V、14、18C、19F和23F中的一种或多种诱导的GMC抗体滴度不显著低于Prevnar 疫苗在人疫苗接种者中诱导的滴度。
107.根据权利要求106所述的免疫原性组合物，其中针对血清型4诱导的GMC抗体滴度不显著低于Prevnar 疫苗在人疫苗接种者中诱导的滴度。
108.根据权利要求106或107所述的免疫原性组合物，其中针对血清型6B诱导的GMC抗体滴度不显著低于Prevnar 疫苗在人疫苗接种者中诱导的滴度。
109.根据权利要求106-108所述的免疫原性组合物，其中针对血清型9V诱导的GMC抗体滴度不显著低于Prevnar 疫苗在人疫苗接种者中诱导的滴度。
110.根据权利要求106-109所述的免疫原性组合物，其中针对血清型14诱导的GMC抗体滴度不显著低于Prevnar 疫苗在人疫苗接种者中诱导的滴度。
111.根据权利要求106-110所述的免疫原性组合物，其中针对血清型18C诱导的GMC抗体滴度不显著低于Prevnar 疫苗在人疫苗接种者中诱导的滴度。
112.根据权利要求106-111所述的免疫原性组合物，其中针对血清型19F诱导的GMC抗体滴度不显著低于Prevnar 疫苗在人疫苗接种者中诱导的滴度。
113.根据权利要求106-112所述的免疫原性组合物，其中针对血清型23F诱导的GMC抗体滴度不显著低于Prevnar 疫苗在人疫苗接种者中诱导的滴度。
114.根据权利要求106-113所述的免疫原性组合物，其包含血清型3糖缀合物。
115.根据权利要求106-114所述的免疫原性组合物，其包含血清型6A糖缀合物。
116.根据权利要求106-115所述的免疫原性组合物，其包含血清型19A糖缀合物。
117.根据权利要求106-116所述的免疫原性组合物，其包含血清型22F糖缀合物。
118.根据权利要求1-117中任一项所述的免疫原性组合物，其包含结晶性填充剂，任选地，甘露醇。
119.根据权利要求118所述的免疫原性组合物，其包含糖，任选地蔗糖。
全文摘要
本发明涉及一种包含至少2种不同肺炎链球菌荚膜糖的免疫原性组合物，其中一种或多种选自由血清型1、3、19A和19F组成的第一组并且通过除了还原胺化以外的化学法直接地或间接地与蛋白载体相连，以及一种或多种不同的糖选自由血清型4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C和23F组成的第二组并且通过还原胺化与蛋白载体相连。还公开了这样的组合物在治疗或预防由肺炎链球菌感染造成的疾病中的用途。
文档编号A61K39/385GK102869375SQ201080066663
公开日2013年1月9日 申请日期2010年8月17日 优先权日2010年3月9日
发明者R.L.比曼斯, P.杜维维尔, O.F.N.加弗德, J.普尔曼 申请人:葛兰素史密丝克莱恩生物有限公司