专利名称：基于地塞米松与紫杉醇的双组分药物小分子水凝胶及其制备方法
基于地塞米松与紫杉醇的双组分药物小分子水凝胶及其制备方法技术领域
本发明的技术方案涉及一类同时含有地塞米松和紫杉醇的小分子水凝胶前体分子和制备方法以及用二硫键还原这种手段促使前体分子形成类似果冻的水凝胶，具体说是同时含有两种药物分子的水凝胶前体分子和其制备方法及其形成水凝胶的方法背景技术
紫杉醇是20世纪90年代应用于临床的新一代广谱抗癌药。由于其水溶性差，目前临床上使用的紫杉醇制剂多以聚氧乙烯蓖麻油(Cremophor EL)和无水乙醇(1 1)混合液作为助溶剂。给药前用生理盐水或者5%葡萄糖稀释到终浓度为0. 4-1. ^imolL—1，这些助溶剂可导致多种不良反应，比较明确的包括过敏反应和神经毒性。另外，聚氧乙烯蓖麻油在血循环中形成的小微粒能将紫杉醇分子包裹，阻碍了药物的作用。为了解决紫杉醇水溶性差和现在临床制剂的毒副作用，许多科学家一直在探索具有毒副作用小，靶向性强且具有缓释作用的药物载体。最近美国FDA批准白蛋白结合紫杉醇纳米粒注射混悬液上市用于转移性乳腺癌联合化疗失败后或辅助化疗6个月内复发的乳腺癌的治疗。虽然国内很多科学家都在紫杉醇方面进行了有益的探索，但是现在很多专利都归国外所有；目前为止，国内还没有自己开发的关于紫杉醇等抗癌药方面的药物，这些技术大多为国外所有。因此研究出一种抗癌药(如紫杉醇)的药物传输系统迫在眉睫。小分子水凝胶是近年来发展起来的一类新的生物材料，它是由小分子水凝胶成胶因子(hydrogelator)通过非共价键力、在一定的外界刺激下自组装形成的一类果冻状的物质。由于小分子水凝胶成胶因子生物相容性好、易于降解、对外界环境改变(PH值、温度等的改变)非常敏感等，小分子水凝胶已经在药物释放、细胞培养、化学传感、无机材料合成模板等方面表现出良好的应用前景。而且基于短肽的小分子水凝胶由于其生物相容性很好，易于合成等优点在近几年的发展中吸引了很多科学家在这一领域从事研究。因此我们相信把疏水性的抗癌药物引进小分子水凝胶体系不仅能提高抗癌药物的溶解性，同时形成的纳米自组装体系通过Era效应，还可以被动靶向/主动靶向到肿瘤组织，增加药物的局部浓度，减少进入正常组织的机会，从而减少副作用(Angew. Chem. Int. Ed. 2003，42，3072-3075 ;J. AM. CHEM. S0C. 2009，131，13576-13577)。 紫杉醇是一种广谱抗癌药物，临床应用时为了防止过敏反应，经常与地塞米松联合使用。因此我们认为把紫杉醇与地塞米松同时引入到一个小分子水凝胶体系中，不仅能降低紫杉醇的毒副作用，而且通过它们的协同作用，可以更好的发挥药效。发明内容
因此本发明的最终目的是发明一类基于地塞米松与紫杉醇的双组分药物小分子水凝胶这一新型药物传输体系及其制备方法。
通过下面的方法可以达到这一目的在该方法中，首先通过化学合成的方法合成丁二酸酐修饰的紫杉醇(见专利，附图1)、丁二酸酐衍生化地塞米松(附图2)以3及含二硫键的化合物5，然后用固相合成以及溶液相合成的方法合成成胶前体分子 Dex-FFFK (taxol-SA)EssEE，Dex-K (taxol-SA) EssEE，随后用 DTT 或者 GSH 还原成胶的方法促使成胶前体分子形成小分子水凝胶。在成功得到成胶前体分子的基础上我们又测试了成胶前体以及小分子水凝胶体外抗肿瘤活性，结果显示修饰后的紫杉醇与紫杉醇在药效上几乎相当。
本发明的有益效果是首先本发明合成简单，合成步骤和提纯方法简单；用到的原料为20种基本的氨基酸，生物相容性很好；所用的成胶方法为谷胱甘肽或二硫苏糖醇还原，生物相容性也很好；紫杉醇在该分子中的含量约为32.6%，所形成三维网状的纳米结构不仅能有效的把紫杉醇被动靶向到肿瘤组织，而且本体系为两种药物共同形成的水凝胶，能提高化疗效果并且降低毒副作用；本体系中所用的药物与多肽的连接方式均为酯键连接，这样在体内能缓慢水解，释放出紫杉醇和地塞米松药物，从而达到更好的治疗效果。 我们同时研究了两种药物在体外的释放速率，研究表明在M小时内，紫杉醇每小时大约释放0. 15%。这一结果说明我们的水凝胶能作为紫杉醇的缓释体系。本发明的目的在于发展一类双药物的缓释体系，在肿瘤手术切除后所形成的空腔中放置小分子水凝胶，防止肿瘤的复发和转移，挽救患者生命。
附图1 丁二酸酐衍生化的紫杉醇结构式及合成步骤(化合物3)
附图2 丁二酸酐衍生化的地塞米松(化合物4)结构及合成步骤
附图3 成胶前体分子1与2的结构式以及合成步骤
附图4 二硫键化合物Fmoc-CS (化合物5)的合成步骤
附图5 成胶前体分子在还原剂(DTT或者GSH)条件下形成水凝胶的宏观图片(A 为成胶前体1形成的水凝胶，B为成胶前体2形成的水凝胶)
附图6:基于地塞米松-紫杉醇的小分子水凝胶系列化合物体外活性它们的 IC50 分别为紫杉醇 47. 3nM, taxol-SA 188. 8nM,成胶前体 1 (Dex-FFFK (taxol-SA) ESSEE) 75. 8nM,胶体 1 是 96. 4nM,成胶前体 2 (Dex-K(taxol-SA)ESSEE) 96. 3nM,胶体 2 是 87. 38nM.具体实施方式
实施例1
(1) Taxol-SA及Taxol-SA-NHS的合成(化合物3与化合物3a)的合成，合成步骤见说明书附图1
0. 50g(0. 59mmol)紫杉醇溶于 12mL吡啶中，随后加入 0. 90g(0. 76mmol) 丁二酸酐， 室温搅拌3小时。旋转蒸发仪除去溶液，然后加入20mL双蒸水，室温搅拌20分钟，然后过滤，沉淀溶于丙酮，之后加入水进行结晶，放置4度过夜，收集晶体，即得产物(产率90% )。 (2) Dex-SA (化合物4)的合成
同上面的反应，称取Ig的地塞米松溶于20mL吡啶中，同时加入3当量的丁二酸酐，0. 1当量的4-二甲氨基吡啶随后加入，室温搅拌M小时，用旋转蒸发仪除去溶液，加入 40mL水室温搅拌20分钟，除去溶液，沉淀过滤，冻干即得产物(产率87%)。咕NMR(300MHz, DMS0-d6) δ 7. 27 (d, J = 10. 11，1H) ,6. 19-6. 24(q, 1H) ,5. 99 (m, 1H) , 5. 42 (d, 1H)，5. 17 (s，1H)，4. 99-5. 06 (m, 1H)，4. 75-4. 82 (m, 1H)，4. 10-4. 15 (m, 1H)，2. 82-2. 91 (m, 1H)， 2. 58-2. 61 (m, 3H)，2. 26-2. 40 (m, 3H)，2. 09-2. 18 (m, 2H)，1. 53-1. 79 (m, 6H)，1. 05-1. 096 (m, 1H) · MS :calc. M+ = 492. 22，obsvd. (M+l) + = 492. 05.
(3) 二硫键化合物Fmoc-CS (化合物5)的合成
参照文献(Chem. Commun.，2011，47，1619-1621)的合成方法，具体的来说如下2.25g(IOmmol)胱胺二盐酸盐和2. 25g(30mmol)的碳酸氢钠溶于90mL的水，同时加入 35mL的1，4_ 二氧六环，冰浴10分钟后，加入1. Og的丁二酸酐。室温搅拌24小时候，3.373g(IOmmol)芴甲氧羰酰琥珀酰亚胺与0. 84g碳酸氢钠同时加入到反应液中，室温搅拌4小时后，过滤，滤液加入0. IM盐酸，调节溶液pH在3左右，4度冰箱放置12小时，收集沉淀，即得产物(产率 48. 0% ) ο 1H NMR(300MHz, DMS0_d6) δ 7. 85-7. 88 (d, J = 7. 38Hz, 2H) ；7. 65-7. 68 (d, J = 7. 22Hz，2H) ；7. 39-7. 42 (t，Jl = 7. 383Hz, J2 = 6. 84Hz，2H)； 7. 34-7. 28(m，2H) ；4. 29-4. 32 (d, J = 6. 762Hz，2H) ；4. 19-4. 23 (m, 1H) ；2. 78-3. 34(m，4H)； 2. 73-2. 78(m，4H) ；2. 40—2. 44 (m，2H) ；2. 28—2. 33 (m，2H). MS :calc. M+ = 474. 1, obsvd. (M+H) +475. 5.
实施例2 :化合物 Dex-FFFKESSEE 与 Dex-KESSEE 的合成
用标准的Fmoc固相合成方法合成，所使用的氨基酸均为氨基端被Fmoc保护的氨基酸，其中最后所加的化合物4可以看成一个氨基酸，连上肽链的方式同氨基酸。具体合成步骤如下(以Dex-FFFKESSEE为例)
①称量Immol树脂，加入固相合成器中，加入适量DCM浸没树脂，在氮气的鼓吹作用下膨胀5min ；除去溶剂，加入Immol第一个氨基酸(本实验中为Fmoc保护的谷氨酸，同时侧链也被OtBu保护)的DCM溶液，加入2mmol DIEA，反应浊；
②洗涤用DCM洗涤，洗5次，每次Imin ；
③封闭用体积比DCM 甲醇DIEA为17 2 1的溶液反应lOmin，将树脂上未反应的活性基团封闭；
④洗涤用DCM洗涤，洗5次，每次Imin ；洗涤用DMF洗涤，洗5次，每次Imin ；脱 Fmoc保护基团加入20%哌啶溶液，反应30min ；
⑤洗涤用DMF洗涤，洗5次，每次Imin ；加入2mmol第二个氨基酸(本实验中为 Fmoc保护的谷氨酸，同时侧链也被OtBu保护)的DMF溶液，加入4mmol DIEA, 2mmol缩合剂 HBTU，反应 2h ；
重复操作步骤④，⑤，将氨基酸依次连接在树脂上；
⑥切割加入如下比例体积的溶液10mL，三氟乙酸三甲基溴硅烷水= 95 2.5 2. 5 (体积比)，反应1小时，收集液体，再用此溶液洗两遍，每遍1分钟。用旋转蒸发仪除去溶液，用高效液相分离提纯，即得化合物Dex-FFFKESSEE。1H NMR(400MHz, DMS0-d6) δ 8. 02-8. 17 (m, 9H)，7. 15-7. 31 (m, 15H)，6. 21-6. 25 (m, 1H) ,6. 01 (s, 1H), 5. 40-5. 42 (m, 1H)，5. 16 (s, 1H)，4. 98-5. 03 (m, 1H)，4. 72-4. 77 (m, 1H)，4. 56-4. 59 (m, 1H)，4.45-4. 49 (m, 3H)，4. 24-4. 29 (m, 4H)，4. 13-4. 15 (m, 2H)，2. 95-3. 06 (m, 3H)，2. 84-2. 88 (m, 3H)，2. 72-2. 76 (m, 6H)，2. 62-2. 68 (m, 3H)，2. 41-2. 44 (m, 2H)，2. 22-2. 34 (m, 12H)， 2. 12-2. 19 (m, 3H)，1. 88-1. 93 (m, 3H)，1. 73-1. 81 (m, 3H)，1. 61-1. 68 (m, 3H)，1. 48-1. 56 (m, 7H)，1. 30-1. 34 (m, 3H)，1. 03-1. 09 (m, 1H)，0. 87 (s, 3H)，0. 78 (d, J = 7. 18，3H) · MS :calc. M+5=1682. 69，obsvd. (M+l)+ = 1684. 55.
用同样的方法可以得到化合物Dex-KESSEE。
实施例3 成胶前体分子 Dex-FFFK (taxol-SA) ESSEE 与 Dex-K (taxol-SA) ESSEE 的合成(以 Dex-FFFK (taxol-SA) ES SEE 为例)
把60mg(0. 06mmol)3a溶解在3mL 二甲基甲酰胺溶剂中，同时加入50μ 1 DIEA， 随后加入121mg(0. 07mmol)Dex-FFFKE-ss-EE室温反应过夜，用高效液相提纯化合物，得到 Dex-FFFK(taxol-SA)ESSEE，产率为 87. 0%。1H NMR(400MHz, DMS0_d6) δ 8. 12-8. 19 (m, 4H)，8. 02-8. 09 (m, 4H)，7. 97-7. 99 (m, 3H)，7. 86 (d, J = 7. 13，1H)，7. 72-7. 76 (m, 1H)， 7. 64-7. 67 (m, 2H)，7. 54-7. 58 (m, 1H)，7. 48-7. 50 (m, 2H)，7. 44-7. 47 (m, 4H)，7. 28-7. 31 (m, 1H) ,7. 24-7. 26(m，4H)，7. 16-7. 20 (m, 12H) ,6. 30 (s，1H)，6· 21-6. 24 (m, 1H)，6· 01 (s, 1H)， 5. 80-5. 85 (m, 1H)，5. 51-5. 55 (m, 1H)，5. 40-5. 42 (m, 2H)，5. 33-5. 35 (m, 1H)，5. 17 (s, 1H)， 4. 99-5. 04 (m, 1H)，4. 90-4. 95 (m, 2H)，4. 73-4. 78 (m, 1H)，4. 64 (s, 1H)，4. 59-4. 61 (m, 1H)， 4. 44-4. 50 (m, 2H)，4. 23-4. 28 (m, 3H)，4. 09-4. 17 (m, 4H)，3. 98-4. 03 (m, 2H)，3. 55-3. 58 (m, 2H)，3. 17 (s，1H)，2. 82-3. 07 (m, 8H)，2. 72-2. 78 (m, 6H)，2. 59-2. 66 (m, 5H)，2. 41-2. 44 (m, 3H)，2. 29-2. 39 (m, 13H)，2. 23-2. 25 (m, 7H)，2. 10 (s, 3H)，1. 88-1. 99 (m, 4H)，1. 72-1. 83 (m, 7H) , 1. 57-1. 74(m，5H) , 1. 49-1. 50 (m, 8H) , 1. 32-1. 36 (m, 3H) , 1. 24-1. 28 (m, 2H)， 0. 99-1. 10 (m, 8H)，0. 88 (s, 3H)，0. 78 (d, J = 7. 10，3H) · HR-MS :calc. M+ = 2619. 03，obsvd. (M+l)+ = 2620. 04.
用同样的方法得到化合物Dex-K (taxol-SA) ESSEE
实施例4:小分子水凝胶的形成与通过透射电镜观察其三维形貌(以化合物 Dex-FFFK (taxol-SA) ESSEE 为例)
(1)小分子水凝胶的形成称取10. Omg Dex-FFFK (taxol-SA) ESSEE,加入2当量的碳酸钠，随后补加适当的PBS (pH = 7. 4)缓冲液，使化合物的最终浓度为2.0% (7. 34umol) (pH = 7. 4)，取此溶液IOOuL,加入已经配好的谷胱甘肽的PBS溶液49umol, pH = 7. 4) lOOuL，室温静置，大约7分钟左右，用倒置观察法即可见到如果冻一样的胶体；
(2)透射电镜样品的制作与观察用铜网垂直深入到胶体中，然后取出，用醋酸双氧铀染色，放置于干燥器中过夜，然后用透射电镜观察。
实施例5 基于地塞米松-紫杉醇的小分子水凝胶系列化合物体外活性测试
取生长状态良好的宫颈癌细胞H印G2作为体外活性测试的细胞，加药物前细胞先种植在96孔板，密度为3000CellS/孔，24小时后加入稀释好的药物(共五个梯度)，每个浓度做五个孔，48小时后用MTT发测定。实验重复三遍。
权利要求
1.基于地塞米松-紫杉醇的小分子水凝胶其特征在于该水凝胶前体分子有如下结构，通过小分子短肽FFFKESSEE或者KESSEE把紫杉醇衍生物(在紫杉醇2'位引入1，4_ 丁二酸)和地塞米松衍生物(21位羟基处引入丁二酸酐)连接起来；同时在成胶前体分子中引入二硫键化合物，从而使成胶前体分子在谷胱甘肽，二硫苏糖醇等还原剂作用下形成小分子水凝胶。该药物传输体系不仅解决了紫杉醇溶解度差的问题而且两种协同药物的联合使用可以减少毒副作用，以及达到缓释的目的。
2.根据权利要求书1所述本发明所形成的地塞米松-紫杉醇小分子水凝胶，其特征在于使用小分子短肽FFFKESSEE或者itKfiSSEEw (或者类似结构的短脱)连接紫杉醇衍生物和地塞米松衍生物。
3.根据权利要求1所述本发明所涉及的地塞米松衍生物是在地塞米松的21位羟基引入的丁二酸酐。其反应条件为吡啶作为溶剂，1 5倍的丁二酸酐，催化量的DMAP作为催化剂。
4.根据权利要求书1所述本发明引入了二硫键化合物，其结构如下
5.根据权利要求书1所述基于地塞米松-紫杉醇的小分子水凝胶，其成胶方法是用谷胱甘肽或者二硫酸糖醇等还原剂条件下成胶。
全文摘要
本发明涉及一类双组分药物的小分子水凝胶前体的合成及成胶方法。即通过短肽把抗炎药地塞米松和紫杉醇连接起来形成小分子水凝胶前体分子，前体分子的PBS溶液(pH＝7.4)在谷胱甘肽或者二硫苏糖醇等作用下切断二硫键，从而形成含有两种药物组分的水凝胶。这种药物传输体系不仅有效解决了紫杉醇水溶性差的缺点，而且地塞米松作为紫杉醇的协同药物可以有效降低紫杉醇的毒副作用。
文档编号A61K47/48GK102532263SQ20111025031
公开日2012年7月4日 申请日期2011年8月29日 优先权日2011年8月29日
发明者孔德领, 杨志谋, 毛丽娜, 王怀民, 王玲 申请人:南开大学