专利名称：用作抗有丝分裂以及抗肿瘤药物的紫杉类缀合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及紫杉类缀合物、包含该化合物的药用制剂、所述化合物作为抗有丝分裂以及抗肿瘤药物的使用方法，特别用于治疗肿瘤例如乳腺癌和卵巢癌。
背景技术：
复合物双萜紫杉醇(1)是一种令人激动的新型抗癌药物，目前它以商品名Taxol在临床上用于抗卵巢癌和乳腺癌。主要参见MerckIndex，Monograph No.7117(第12版，1996)。
紫杉醇通过与众不同的机制起作用促进微管装配。自发现紫杉醇为抗有丝分裂的抗肿瘤药物以来，已经广泛研究了它的化学性质与结构活性关系以开发更有效衍生物并克服其低水溶性和耐药性问题。大量研究着重于对C2、C4、C7、C9、C10和C13侧链的修饰，所得结构-活性关系导致出现更有效紫杉醇衍生物。同样，对2’-羟基的选择性修饰使得合成出一系列水溶性衍生物(A.Mathew等，J.Med.Chem.1992，35，145-151)。然而紫杉醇伴有的耐药性仍然是一个主要难题，因此迫切需要新型衍生物。
以前，我们合成并评价了为喜树碱(CPT)衍生物和依托泊苷(5)类似物的缀合物的两种化合物(3和4)(K.Bastow等，Bioorg.Med.Chem.1997，5，1481-1488)。两种化合物都通过浓度依赖性方式诱导药物治疗细胞中的蛋白连接性DNA断裂(PLDB)。药物诱导的PLDB可能是通过DNA拓扑异构酶(topo)I以及II介导。所述两种缀合物抗CPT耐药性细胞的活性比CPT高，抗依托泊苷耐药性细胞的活性比依托泊苷高。多药物抗性蛋白质GP170或MRP的过度表达对细胞毒性几乎没有影响。所述化合物对CPT敏感或依托泊苷耐药性细胞与CPT的细胞毒性作用相同，对CPT耐药性细胞与依托泊苷的细胞毒性作用相同。在裸小鼠体内，一种缀合物(3)的抗人KB和DU-145肿瘤细胞活性比依托泊苷或CPT的活性高。这些CPT-依托泊苷类似物的缀合物的topo I和II双重抑制性质以及独特的抗肿瘤作用说明作为抗癌药物应该进一步探索这样的双分子模型。
发明概述本发明第一方面是一种式I化合物或其药学上可接受的盐T1-L-T2(I)其中T1为紫杉类基团，优选下式II基团 R1为C6H5，R2为O；L为连接基团；T2为选自以下的取代基表鬼臼毒素、安吖啶、椭圆玫瑰树碱、蒽环类抗生素、米托蒽醌、丝裂霉素、喹诺酮和秋水仙碱基团。
本发明第二方面为药用制剂，所述制剂包含式I化合物和药学上可接受的载体。
本发明另一方面是治疗肿瘤、尤其治疗是实体瘤的方法，所述方法包括给予其需要患者治疗有效量的上述式I化合物。可以治疗的肿瘤实例包括但不限于肺癌、结肠癌、中枢神经系统癌、黑素瘤、卵巢癌、前列腺癌以及乳腺癌。
本发明再一方面是治疗其需要患者癌症的方法，所述方法包括给予所述患者癌症治疗有效量的式I化合物。本发明可以治疗的示例性的癌症包括但不限于小细胞肺癌、睾丸癌、淋巴瘤、白血病、食管癌、胃癌、结肠癌、乳腺癌、中枢神经系统癌、肝癌以及前列腺癌。
本发明又一方面是诱导细胞分化的方法，所述方法包括使癌细胞与分化有效量的以上式I化合物接触(体内或体外)。
本发明另一方面是抑制细胞有丝分裂的方法，所述方法包括使细胞与有丝分裂抑制量的以上式I化合物接触(体内或体外)。
本发明上述及其它目的和方面利用本发明附图以及以下说明书详细说明。
附图简要说明
图1图示用来实施本发明的各种前体化合物的结构。
图2图示制备本发明化合物的合成流程1。
优选实施方案的详细说明本文使用的“烷基”是指直链或支链、饱和或不饱和烃基链，通常为C1-C4，包括例如甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基和叔丁基。
本文使用的“烷氧基”是指直链或支链、饱和或不饱和烃氧基链，包括例如甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基、丁氧基和叔丁氧基。
本文使用的“氨基”是指取代基-NR1R2，其中R1和R2各自独立选自H和C1-C4烷基。
本文使用的“卤代”、“卤化物”或“卤素”是指氟、氯、溴和碘。
本文使用的“治疗”是指使患有疾病的患者受益的任何类型的治疗，包括改善患者病情(例如改善一种或多种症状)、延缓疾病发展、预防或延缓疾病发病等。
本文使用的“药学上可接受”是指所述化合物或组合物适合给予患者以实现本文所述治疗，而且根据疾病严重性和治疗需要没有过度的有害副作用。1.活性化合物根据本发明公开内容可以按照已知方法或其本领域熟练技术人员显而易见的各种变化方法合成本发明活性化合物。一般来说，本发明活性化合物具有下式结构T1-L-T2(I)其中T1为紫杉类基团，L为连接基团，T2为选自以下的取代基表鬼臼毒素、安吖啶、椭圆玫瑰树碱、蒽环类抗生素、米托蒽醌、丝裂霉素、喹啉和秋水仙碱基团。本文使用的活性化合物包括其药学上可接受的盐。下面更详细地论述可以用于与上述式I的各种基团。
紫杉类基团。可以用于实施本发明的紫杉类基团用式II表示 其中R1为C6H5，R2为O。本文使用的“Ac”是指式-C(O)CH3取代基。
紫杉醇为已知产品，可以按照已知技术制备。通常参见MerckIndex，Monograph No.7117(第12版，1996)。
可以用于实施本发明的紫杉类基团实例包括但不限于以下美国专利中的化合物Kingston等的5,614,645；Chattopadhyay等的6,028,206；Kingston等的5,411,984；Magnus的5,508,447。(申请人明确用意在于本发明引用的所有美国专利文献通过引用将其全部内容结合到本发明)。这些文献公开的化合物与连接基L的共价键可以在相同位置以上式II化合物给出的相同方式形成。
表鬼臼毒素基团。可以用于实施本发明的表鬼臼毒素基团实例包括式III-A化合物 其中R10、R11、R12、R13、R15和R16各自独立选自以下基团H、烷基、羟基、烷氧基、烷基羟基和卤代；R14选自以下基团H、烷基、羟基、烷氧基、烷基羟基、卤代和磷酸盐；R17为NH或不存在。
可以用于实施本发明的表鬼臼毒素基团实例包括但不限于以下美国专利介绍的化合物Saulnier等的Re 35,524；Terada等的5,571,914；Ohnuma等的5,066,645。这些文献公开的化合物与连接基L的共价键可以在相同位置以上式III-A化合物给出的相同方式形成。
安吖啶基团。可以用于实施本发明的安吖啶基团实例包括式III-B化合物 其中R20和R21各自独立选自以下基团H、烷基、羟基、烷氧基和烷基羟基；R22和R23各自独立选自以下基团H、烷基、羟基、烷氧基、烷基羟基和卤代；R24为NH或不存在。
可以用于实施本发明的安吖啶基团实例包括但不限于以下美国专利介绍的化合物Watanabe等的5,358,864；Su等的5,939,428(参见例如C.Bostock-Smith，Biochemistry 38，6723-6731(1999)，关于m-AMSA)。这些文献公开的化合物与连接基L的共价键可以在相同位置以上式III-B化合物给出的相同方式形成。
椭圆玫瑰树碱基团。可以用于实施本发明的椭圆玫瑰树碱基团实例包括但不限于式III-C化合物 其中R30为H或烷基、或者不存在；
R31为H、烷基、羟基、烷氧基、烷基羟基(alkyhyroxy)、卤代或-C(O)-N(R36)-(CH2)n-N(R37)(R38)，其中R36、R37和R38各自独立选自H和烷基，n为1-6的整数；R32和R33各自独立选自以下基团H、烷基、羟基、烷氧基、烷基羟基和卤代；R34为H或烷基；R35为O或不存在。
可以用于实施本发明的椭圆玫瑰树碱基团实例包括但不限于以下美国专利公开的化合物Bisagni等的5,407,940；Bisagni等的5,498,611；Honda等的4,698,423；LePecq等的4,045,565，这些文献公开的化合物至连接基L的共价键可以在相同位置以上式III-C化合物给出的相同方式形成。
蒽环类抗生素基团。可以用于实施本发明的蒽环类抗生素基团实例包括但不限于式III-D化合物 其中R40为H、烷基、羟基、烷氧基、烷基羟基或卤代；R41为羟基O-或共价键；R42为烷基、烷基羟基、CH2O-或CH2-；R43和R44各自独立选自H和羟基；R45为羟基或NH2；
R46为H或卤代；条件是如果R41不为O-或共价键，则R42为CH2O-或CH2-；如果R42不为CH2O-或CH2-，则R41为O-或共价键。
可以用于实施本发明的蒽环类抗生素基团实例包括但不限于以下美国专利公开的化合物Takeuchi等的5,958,889；Rahman等的5,560,923；Suarato等的5,744,454。这些文献公开的化合物至连接基L的共价键可以在相同位置以上式III-D化合物给出的相同方式形成。
米托蒽醌基团。可以用于实施本发明的米托蒽醌基团实例包括式III-E化合物 其中R50、R51、R52和R53各自独立选自OH或O-；条件是R50、R51、R52和R53其中之一为O-。
可以用于实施本发明的米托蒽醌化合物在Tsou的5,378,456和Lim等的5,858,397的美国专利中有介绍。这些文献公开的化合物至连接基L的共价键可以在相同位置以上式III-E化合物给出的相同方式形成。
丝裂霉素基团。可以用于实施本发明的丝裂霉素基团实例包括式III-F化合物 其中
X为NH2、NH-或脂肪族胺；R71为烷基或卤代；R72为羟基或烷氧基；R73为H或不存在；Y为H或烷基。
秋水仙碱基团。可以用于实施本发明的秋水仙碱基团实例包括式III-G化合物 其中R60和R61各自独立为H、烷基、羟基、O-或烷氧基；R62为H、NH2、NH-、OH、O-、＝O或NHCOCH3，X为S或O，条件是R60或R61其中一个为O-，或者R62为NH-或O-，(为缀合物提供一个连接基团)。
可以用于实施本发明的秋水仙碱基团实例包括但不限于以下美国专利介绍的化合物Bombardelli等的5,880,160、Bombardelli的5,973,204和Bombardelli等的5,843,910。这些文献公开的化合物至连接基L的共价键可以在相同位置以上式III-G化合物给出的相同方式形成。
喹诺酮基团。可以用于实施本发明的喹诺酮基团实例包括但不限于式III-H化合物 其中R81选自以下基团H、羟基、低级烷基、低级烷氧基、羟基、卤代和氨基(优选H或低级烷基；最优选H)；R82选自以下基团H、羟基、低级烷基、低级烷氧基、羟基、卤代和氨基(优选H或低级烷基；最优选H)；R83选自以下基团H、羟基、低级烷基、低级烷氧基、羟基、卤代和氨基(优选H或低级烷基；最优选H)；R84选自以下基团H、羟基、低级烷基、低级烷氧基、羟基、卤代和氨基(优选H或低级烷基；最优选H)；R85各自独立选自以下基团H，羟基，低级烷基，低级烷氧基，羟基，卤代和氨基(优选H或低级烷基；最优选H)；n为0、1、2、3或4(应当理解的是当n为0时，则所有位置被H取代)(在一个优选实施方案中，至少存在一个R85并且为F)。
连接基团。可以用来形成两个官能团的共价缀合物的连接基团(接头、连接桥等)是本领域已知的。用以实现本发明的具体连接基团并非决定性的，可以使用的连接基团包括但不限于以下美国专利公开的基团Rokita等的5,650,399和Greenfield等的5,122,368。通常，所述连接基团可以包括脂肪族、芳族或者脂肪族与芳族的混合基团(例如烷基、芳基、烷基芳基等)并且包含一个或多个杂原子例如N、O、S等。例如，连接基团L可以为式-La-Lb-化合物，其中Lb存在或不存在，La和Lb各自独立选自以下基团 和 其中a为0-3，b为0-3；R70选自亚烷基、链烯基和亚芳基。
可以由使用的具体连接基化学性质确定本发明化合物合成。例如，流程1中给出了2’-(4”-O-脱甲基表鬼臼毒素)紫杉类系列的合成。合成化学的许多变化对本领域熟练技术人员来讲是显而易见的。
本发明公开的活性化合物可以如上所述制备成它们的药学上可接受的盐。药学上可接受的盐保持所需要的母体化合物的生物学活性并且不会产生不需要的毒性作用。这样的盐的实例有(a)与以下无机酸生成的酸加成盐例如盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸、硝酸等；以及与以下有机酸生成的盐例如乙酸、乙二酸、酒石酸、琥珀酸、马来酸、富马酸、葡萄糖酸、柠檬酸、苹果酸、抗坏血酸、苯甲酸、鞣酸、棕榈酸、藻酸、多聚谷氨酸、萘磺酸、甲磺酸、对甲苯磺酸、萘二磺酸、聚半乳糖醛酸等；(b)与元素阴离子(例如氯、溴和碘)形成的盐；(c)由碱获得的盐，例如铵盐、碱金属盐(例如钠盐和钾盐)、碱土金属盐(例如钙盐和镁盐)以及与有机碱(例如二环己胺和N-甲基-D-葡糖胺)形成的盐。2.药用制剂上述活性化合物可以按照已知技术以药用载体配制用于给药。参见例如Remington，The Science And Practice of Pharmacy(第9版，1995)。在制造根据本发明药用制剂时，所述活性化合物(包括其生理学可接受的盐)通常还特别与可接受的载体混合。所述载体当然必须为可接受的，也就是与制剂任何其它成分相容，并且必须对患者无害。所述载体可以为固体或液体，或者固体和液体两种状态，并且优选用所述化合物配制为单位剂量制剂(例如片剂)，它可以包含从0.01％或0.5％至95％或99％(重量)的所述活性化合物。一种或多种活性化合物可以加入本发明制剂中，它可以通过药学上已知的任何技术制备，基本包括混合各种组分，任选包含一种或多种辅助成分。
本发明制剂包括适合以下给药途径的制剂口服、直肠、局部、口腔(例如舌下)、阴道、胃肠外(例如皮下、肌内、真皮内或静脉内)、局部(即皮肤以及粘膜表面，包括气道表面)以及透皮，但是在任何特定情况下最适合的给药途径取决于所治疗病症的性质和严重性以及所用具体活性化合物的性质。
适合口服给药的制剂可以为独立单位，例如胶囊剂、扁囊剂、锭剂或片剂，每个单位包含预定量的活性化合物；粉剂或颗粒剂；水性或非水性液体的溶液剂或混悬剂；或者水包油或油包水乳剂。所述制剂可以用任何药学上适当的方法制备，包括使活性化合物与适当载体(可以包括一种或多种上述辅助成分)混合的步骤。通常，本发明制剂的制备是将活性化合物与液体或微细固体载体或这两类载体均匀、紧密地混合，如果需要，然后将所得混合物成型。例如可以通过压制或模塑包含所述活性化合物以及任选与一种或多种辅助成分的粉末或颗粒制备片剂。压缩片剂的制备是可以用合适的机器压制自由流动形式的所述化合物(例如粉末或颗粒)，任选混合粘合剂、润滑剂、惰性稀释剂和/或表面活性/分散剂。模塑片剂的制备可以用合适的机器模塑经惰性液体粘合剂润湿的粉状化合物。
适合口腔(舌下)给药的制剂包括所述活性化合物包含在调味基质(通常为蔗糖和阿拉伯胶或黄芪胶)中的锭剂以及所述活性化合物包含在惰性基质(例如明胶和甘油或者蔗糖和阿拉伯胶)中的锭剂。
适合胃肠外给药的本发明制剂包括所述活性化合物的无菌水性和非水性注射溶液，优选与预定接受者血液等渗的制剂。这些制剂可以包含抗氧剂、缓冲剂、制菌剂以及使所述制剂与预定接受者血液等渗的溶质。水性或非水性无菌混悬剂可以包括混悬剂以及增稠剂。所述制剂可以装在单位剂量或多剂量容器中，例如密封的安瓿以及小瓶，可以贮存在冷冻干燥环境下，在临用前只需要直接加入无菌液体载体，例如盐水或注射用水。临时配制的注射溶液剂和混悬剂可以用前述类型的无菌粉剂、颗粒剂及以及片剂制备。例如本发明一个方面提供包含式(I)化合物或其盐的可注射的稳定无菌组合物，该组合物以单位剂型包装于密封容器中。所述化合物或盐以冻干品的形式提供，冻于制品能够用适当的药学上可接受载体复原以形成适合注射到患者的液体组合物。单位剂型通常包含约10mg～约10g所述化合物或盐。当所述化合物或盐基本不溶于水时，可以用足以使所述化合物或盐在水性载体中乳化的足够量生理学上可接受的乳化剂。一种这样的有效乳化剂为磷脂酰胆碱。
适合直肠给药的制剂优选为单位剂量的栓剂。它们的制备可以是将所述活性化合物与一种或多种常规固体载体(例如可可脂)混合，然后将所得混合物成型。
适合皮肤局部给药的制剂优选采用以下形式软膏、乳膏、洗剂、糊剂、凝胶、喷雾剂、烟雾剂或油。可以使用的载体包括凡士林、羊毛脂、聚乙二醇、醇类、透皮增强剂以及两种或多种所述载体的组合物。
适合透皮给药的制剂可以为离散型贴剂，贴剂适合与接受者表皮保持长时间紧密接触。适合透皮给药的制剂还可以通过离子电渗疗法给药(参见例如Pharmaceutical Research 3(6)318(1986))，典型采用所述活性化合物的任选缓冲的水溶液形式。合适的制剂包含柠檬酸盐或双\三缓冲剂(pH6)或乙醇/水并且包含0.1～0.2M活性成分。
进一步，本发明提供本文公开的化合物及其盐的脂质体制剂。形成脂质体混悬剂的技术在本领域众所周知。当所述化合物或其盐为水溶性盐时，用常规脂质体技术可以将前述化合物掺入到脂质囊中。在这种情况下，由于所述化合物或盐的水溶性，所述化合物或盐基本上被带入亲水中心或脂质体核。使用的脂质层可以为任何常规组合物，可以包含胆固醇也可以不包含胆固醇。当目标化合物或盐不溶于水时，再使用常规脂质体形成技术，则所述盐可能基本上被带入形成脂质体结构的疏水性脂质双分子层。在任一情况下，所制备的脂质体可以通过使用标准超声处理或者均化技术减小粒径。
当然，可以冷冻干燥包含本文公开的化合物或其盐的脂质体制剂制备冻干制品，该制品可以用药学上可接受载体(例如水)复原再生脂质体混悬剂。
其它药用组合物可以用本文公开的不溶于水的化合物或其盐制备，例如水性基质乳剂。在这样的情况下，所述组合物包含足够量的药学上可接受的乳化剂以乳化需要量的所述化合物或其盐。特别有效的乳化剂包括磷脂酰胆碱以及卵磷脂。
除了式(I)化合物或它们的盐外，药用组合物还可以包含其它添加剂，例如pH-调节添加剂。具体地讲，有效的pH-调节剂包括酸(例如盐酸)、碱或缓冲剂(例如乳酸钠、乙酸钠、磷酸钠、柠檬酸钠、硼酸钠或葡萄糖酸钠)。进一步，所述组合物可以包含微生物防腐剂。有效的微生物防腐剂包括对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯以及苄醇。通常在所述制剂置于多剂量使用的小瓶时使用微生物防腐剂。当然，如上所述，本发明药用制剂可以用本领域熟知的技术冷冻干燥。3.给药剂量和给药途径本文介绍的活性化合物抑制微管蛋白聚合和/或具有抗有丝分裂活性。这样的化合物用于治疗的病症包括牛皮癣、痛风、乳头状瘤(papiloma)、疣以及各种肿瘤，特别是实体瘤，包括但不限于肺癌(例如非小细胞肺癌)、结肠癌、中枢神经系统癌、黑素瘤、卵巢癌、前列腺癌以及乳腺癌。
用本发明方法治疗的患者通常为人类患者，但是本发明方法可以用于任何本领域熟练技术人员已知的合适患者，特别是哺乳动物患者，除人外还包括马、牛、狗、兔、鸡、绵羊等。如上所述，本发明提供药用制剂，所述制剂包含式I化合物或其药学上可接受的盐和药学上可接受的以下给药途径的载体口服、直肠、局部、口腔、胃肠外、真皮内或静脉内以及透皮。
任何具体化合物(其用途属于本发明范围)的治疗有效剂量在化合物与化合物之间、患者与患者之间略有不同并且取决于患者的病症以及给药途径。一般建议是，剂量约0.1～约50mg/kg具有治疗作用，但是口服和/或烟雾剂给药时可能使用更高剂量。在更高水平涉及的毒性可能限制静脉内剂量至更低的水平，例如至多约10mg/kg，所有重量计算基于活性基质的重量，包括使用盐的情况。静脉内或肌内给药可以使用的典型剂量为约0.5mg/kg～约5mg/kg。口服给药可以使用的剂量为约10mg/kg约50mg/kg。
本发明用以下的非限制性实施例作更详细的说明。
实施例A.原料和方法紫杉酚和cephalomannine由Yung-Shin Pharm.Co.，Taiwan惠赠。质子核磁共振(1H-NMR)谱用Bruker AC-300分光计或Varian Inova 600测定，用Me4Si(TMS)作内标，CDCl3作溶剂。大气压化学电离(APCI)质谱通过PE Sciex API 150质谱仪测定。薄层色谱法(TLC)硅胶板购自Alltech，Inc。
合成(4-甲酰基)苯甲酰紫杉类的常规方法。
紫杉类的无水二氯甲烷溶液中加入等摩尔比例的4-羧基苯甲醛(除了在10中用2当量外)和4-二甲基氨基吡啶(4-DMAP)。然后在混合物中加入等摩尔量的1，3-二环己基碳二亚胺(DCC)。将混合物在室温下氮气氛中搅拌24小时，同时用TLC监测。滤出二环己基脲沉淀，用二氯甲烷洗涤。浓缩滤液获得白色固体，将其进一步用硅胶色谱法(Elutflash快速硅胶柱，洗提液CH2Cl2∶MeOH-10∶0至20∶1)处理获得所需白色粉末产物9。
2’-(4-甲酰基)苯甲酰紫杉酚(9)。
收率92％(开始用11.7g紫杉酚)；无定形；1H NMRθ(CDCl3)参见表1；APCI-MSm/z986.6(M+H+)。
2’，7-双(4-甲酰基)-苯甲酰紫杉酚(10)。
与常规方法相同，除了使用1mmol紫杉酚和2mmol 4-羧基苯甲醛以及DCC。收率95％(开始用19.7mg.紫杉酚)。1H NMRθ(CDCl3)参见表1；APCI-MSm/z1118.8(M+H+)。
2’-(4-甲酰基)苯甲酰cephalomannine(11)。
收率95％(开始用205mg cephalomannine)；无定形；1H NMRθ(CDCl3)参见表1；APCI-MSm/z964.6(M+H+)。
合成目的化合物12-16的常规方法。
单或双2’-(4-甲酰基)苯甲酰紫杉类(9-11)的无水苯溶液中加入适当的表鬼臼毒素衍生物(1当量或2当量的6或8)。将混合物用DeanStark捕集器加热回流24小时。蒸去溶剂，将残余物用硅胶柱色谱法(用CH2Cl2∶MeOH＝20∶1洗提)提纯获得所需化合物。
缀合物12。
黄色粉末，92％收率[开始用22.5mg(0.023mmol)9和10.0mg(0.025mmol)4’-O-脱甲基-4β-氨基-4-脱氧鬼臼毒素(6)]；无定形；1HNMRθ(CDCl3)参见表1；APCI-MSm/z 1367.7(M+H+)。
缀合物13.
黄色粉末，89％收率[开始用7.0mg(0.006mmol)2’，7-双(4-甲酰基)苯甲酰紫杉酚(10)和5.1mg(0.013mmol)6]；无定形；1H NMRθ(CDCl3)参见表1；APCI-MSm/z 1864.7(M+H+)。
缀合物14.
微黄色粉末，89％收率[开始用39mg(0.040mmol)2’-(4-甲酰基)苯甲酰Cephalomannine(11)和16mg(0.040mmol)6]；无定形；1H NMRθ(CDCl3)参见表1；APCI-MSm/z 1345.8(M+H+)。
缀合物15.
黄色固体，70％收率[开始用20.0mg(0.023mmol)化合物9和10.6mg(0.025mmol)8]；无定形；1H NMRθ(CDCl3)参见表1；APCI-MSAm/z 1458.8(M+H+)。
缀合物16.
黄色固体，85％收率开始用39mg(0.040mmol)化合物11和20mg(0.040mmol)8]；无定形，1H NMRθ(CDCl3)参见表1；APCI-MSm/z 1437.9(M+H+)。
生物学分析体外细胞毒性分析按照Rubinstein等(P.Ferguson等，Cancer Res.1988，48，5956-5964)介绍的方法进行。药物原液用DMSO制备，最终溶剂浓度为对细胞复制没有影响的浓度，即≤2％ DMSO(v/v)。人肿瘤细胞包括鼻咽上皮类癌(KB)、肺癌(A-549)、回盲肠癌(HCT-8)、肾癌(CAKI-1)、乳腺癌(MCF-7)、黑素瘤癌(SKMEL-2)以及卵巢癌(1A9)。耐药细胞系包括三种KB-衍生细胞，即KB-7d、KB-CPT和KB-VCR。这些细胞的性质在别处有介绍(P.Ferguson等，Cancer Res.1988，48，5956-5964；D.Beidler等，Cancer Res.1996，56，345-353)。1A9细胞的PAX-10和PAX-22亚系衍生细胞对紫杉醇具有耐药性并且其β-微管蛋白存在突变。它们由Dr.P.Giannakakou(P.Giannakakou等，J.Biol.Chem.1997，27，17118-17125)慷慨赠予。细胞在含5％二氧化碳的潮湿空气中用含100ug/mL卡拉霉素和10％(v/v)胎牛血清的RPMI-1640于37℃培养。最初接种密度根据细胞系不同以保证最终吸光度为1-2.5 A562单位。药物暴露3天，根据剂量反应数据内推减少50％吸光度的药物浓度即ED50值。各测试一式三份进行测试并且吸光度读数变化不超过5％。
蛋白结合性DNA断裂和拓扑异构酶II活性分析按照详细公开的方法完成各步骤(K.Bastow等，Bioorg.Med.Chem.1997，5，1481-1488)。B.结果和讨论紫杉醇的2’-羟基比空间位阻7-羟基反应性高(J.Deutsch等，JMed.Chem.1989，32，788-792；N.Magri等，J Org.Chem.1986，51，797-802)。因此，可以通过苯甲醛桥将4’-O-脱甲基表鬼臼毒素类似物选择性引入紫杉醇的2’-位。分别在1，3-二环己基碳二亚胺(DCC)和4-二甲基氨基吡啶(4-DMAP)存在下使紫杉醇(1)或cephalomannine(2)与4-羧基苯甲醛反应(流程1)合成三种单-和双-(4-甲酰基)苯甲酰紫杉类(9-11)(流程1)。按照文献方法合成4’-O-脱甲基-4β-氨基-4-脱氧鬼臼毒素6(X.Zhou等，J.Med.Chem.1991，34，3346-3350)。4-O-脱甲基-4β-(对氨基苯氨基)-4-脱氧鬼臼毒素8的合成是用三甲基甲硅烷碘(TMSI)的二氯甲烷溶液处理鬼臼毒素，接着在碳酸钡存在下用对硝基苯胺取代(L.Daley等，Terahedron Lett.1997，38，2673-2676)，最后氢化所得硝基化合物。使9-11与6或8在回流苯中反应形成亚胺键完成所需缀合物(12-16)的合成(流程1)。这些缀合物的结构由NMR和质谱数据得到明确确认。NMR信号的详细分配列于表1中。
本实验室按照标准细胞毒性分析人肿瘤(HTCL)细胞系和耐药(DRCL)细胞系对新合成的紫杉类-4’-O-脱甲基表鬼臼毒素缀合物进行了评价。对照化合物为紫杉醇(1)、cephalomannine(2)以及表鬼臼毒素[依托泊苷(5)和GL-331(7)，参见图1]。HTCL包括KB、A549、HCT-8、CAKI-1、MCF-7、SK-MEL-2以及1A9细胞系。称为PAX-10和PAX-22的两种紫杉酚耐药性1A9亚系也作为DRCL一部分进行了测试。其它耐药性细胞系为在别处有介绍的表现出不同机制或多种药物耐药性的KB衍生细胞(P.Ferguson等，Cancer Res.1988，48，5956-5964；D.Beidler等，Cancer Res.1996，56，345-353)。
除13以外的所有缀合物具有显著的细胞毒性(表2数据)。尽管它们的活性不如紫杉醇和cephalomanine，但是对大多数肿瘤细胞系12和14-16具有与表鬼臼毒素衍生物相当或更好的活性。有趣的是紫杉醇和8的缀合物15与其两种前体具有不同的细胞毒素活性，这说明杀死细胞的新机制是通过缀合作用实现。在紫杉类的2’-和7-羟基基团都结合表鬼臼毒素(epipodothyllotoxin)的化合物13活性较低。因此，紫杉类7-羟基基团对细胞毒素活性可能是决定性的；以前Mathew等(A.Mathew等，J.Med.Chem.1992，35，145-151)也发现了类似的结果。与非结合组分相比，12、15和16对抗紫杉酚耐药性细胞具有更高活性(表3)。选择化合物12、13和15用NCI的大约60种肿瘤细胞系进一步评价细胞毒性。各种肿瘤类型的所有细胞系的logGI50平均值在表4中列出。化合物12对多种肿瘤细胞系、尤其是白血病、结肠癌以及前列腺癌细胞系具有最强的抑制效果。
在拓扑异构酶分析中，所有三种缀合物在体内都抑制topo II，但是只有12和15为细胞内毒物(表5)。包含两个表鬼臼毒素部分的化合物13没有在细胞内刺激蛋白-DNA断裂。但是在topo II抑制分析中，13的活性是12和15的两倍，并且与GL-331相当，这说明游离羟基有可能在将药物转运入肿瘤细胞中起作用。
表1.紫杉类和它们的缀合物的1H NMR测定结果质子编号 9 10 11 12 13 14 15 16属于紫杉类部分的信号2 5.68(d，7) 5.80(d，7) 5,68(d，7) 5.68(d，7) 5.69(d，7) 5.68(d，7) 5.68(d，7)5.68(d，7)3 4.20(d，8) 4.06(d，8) 3.81(d，7) 3.81(d，7) 4.04(dd，7，3.81(d，7) 3.82(d，7)3.81(d，7)2)5 4.98(d，9) 5.02(d，9) 4.97(d，9) 4.97(d，10) 5.04(br.d， 4.96(d，9) 4.97(dd，8，2)4.96(d，9)9)6α，β1.90(tt，13，3) 1.92(m) 1.87(m) 1.88(br.t，13) 1.92(m) 1.88(m) 1.88(ddd，16，11，1.88(br.t，13)2)7 4.45(m) 5.81(dd，10，4) 4.46(m) 4.44(dd，10， 5.82(m) 4.44(m) 4.45(dd，11，7) 4.45(m)7)10 6.30(s) 6.38(s) 6.30(s) 6.30(s) 6.38(s) 6.30(s) 6.30(s) 6.30(s)13 6.27(t，9) 6.25(t，9) 6.26(br.t，9) 6.26(t，9) 6.24(t，9) 6.26(br.t，9) 6.27(t，9)6.26(br.t，9)14α，β 2.14(dd，15，9) 2.17(dd，15，9) 2.55(m) 2.14(dd，15， 2.18(m) 2.55(m) 2.14(dd，15，9) 2.55(m)0)2.34(dd，15，9) 2.38(dd，15，9) 2.33(dd，15， 2.36(m) 2.33(dd，15，9)9)16-CH31.23(s) 1.21(m) 1.26(s) 1.23(m) 1.26(s) 1.25(s) 1.24(s) 1.26(s)17-CH31.14(s) 1.18(s) 1.15(s) 1.14(s) 1.19(s) 1.14(s) 1.14(s) 1.15(s)18-CH31.97(s) 1.97(s) 1.82(s) 1.96(s) 1.97(s) 1.82(s) 1.96(s) 1.83(s)19-CH31.68(s) 1.95(s) 1.68(s) 1.68(s) 1.96(s) 1.68(s) 1.68(s) 1.68(s)20α 4.32(d，84) 4.37(d，8) 4.30(d，8) 4.31(d，9) 4.37(d，8) 4.30(d，8) 4.31(d，9)4.29(d，8)质子编号 9 10 1112 13 14 151620β4.20(d，8) 4.25(d，8) 4.20(d，8) 4.19(d，9) 4.27(d，8) 4.19(d，8) 4.20(d，9) 4.19(d，8)2’ 5,72(d，4) 5.75(d，4) 5.64(d，3) 5.70(d，4) 5.70(d，4) 5.62(br.s) 5.71(d，4) 5.65(br.s)3’ 6.08(dd，10，4)6.09(dd，9，4) 5.94(dd，9，3) 6.04(dd，9，4) 6.08(dd，9， 5.92(br.s) 6.05(dd，9，4) 5.92(br.dd，4) 9，3)3’-NH 6.97(d，9.6) 7.07(d，8) 6.55(d，9) 7.02(d，9) *6.56(d，9) 7.06(d，9) 6.61(d，8)2-OBz(o)8.13(d，7)8.13(d，8) 8.12(d，8) 8.13(d，7) 8.14(d，7)8.12(d，8) 8.11(d，7.5) 8.11(d，8)2-OBz(m)7.52(t，7)7.53(d，8) 7.51(t，8) 7.52(d，7) 7.52(d，7)7.52(t，8) 7.52(d，75)7.51(t，8)2-OBz(p)7.62(m) 7.64(t，8) 7.62(t，8) 7.62(t，8) 7.64(t，7)7.62(t，8) 7.61(t，75)7.61(t，8)7-OBz(o)- 7.93(d，8) - - 7.97(d，8)- - -7-OBz(m)- 8.07(d，8) - - 7.81(d，8)- - -2’-OBz(o) 8.14(d，8)8.15(d，8) 8.12(d，8) 8.04(dd，7，2) 8.08(d，8)7.85(d，8) 8.15(d，8) 8.11(br.d，8)2’OBz(m) 7.98(d，8)7.97(d，8) 7.97(d，8) 7.85(dd，7，2) 7.86(d，8)8.01(d，8) 7.76(d，8) 7.52(br.d，8)3’-Ph(o) 7.45(d，8)7.48(m)7.40(br.s) 7.44(t，8) 7.43(d，7)7.40(m)7.43(d，8) 7.40(m)3’-Ph(m) 7.41(t，8)7.42(m)7.40(br.s) 7.41(t，8) 7.47(d，7)7.40(m)7.41(t，8) 7.40(m)3’-Ph(p) 7.44(t，8)7.35(dd，7，2) 7.33(t，7) 7.43(d，8) 7.33(br.t，7) 7.32(m)7.42(d，8) 7.32(m)NBz(o) 7.76(d，8)7.77(br.d，8) - 7.75(d，8) 7.75(d，7)- 7.76(d，8)-NBz(m) 7.52(br，t，7)7.45(m)- 7.51(t，7) 7.47(t，7)- 7.51(t，7) -NBz(p) 7.52(br，t，7)7.46(m)- 7.52(t，7) 7.53(t，7)- 7.52(t，7) -1-OH1.89(br.t，11，2) 1.92(br.s) - 1.97(s)1.97(s) - 1.96(s)-7-OH2.54(br.s)- - 2.49(br.s) - - 2.50(br.s) -2’OH - - - - - - - -4-OAc 2.46(s) 2.49(s)2.43(s)2.44(s)2.49(s) 2.41(s)2.43(s)2.41(s)10-OAc 2.23(s) 2.06(s)2.23(s)2.23(s)2.07(s) 2.23(s)2.22(s)2.23(s)2”-CH3- - 1.97(s) - -1.96(br.s) - 1.96(s)质子编号 9 10 11 12 13 14 15163”- -6.43(br.q，7) - - 6.43(br.q， - 6.45(br.q，7)7)4”-CH3-- 1.72(d，7)- - 1.72(d，7) - 1.73(d，7)CHO 10.13(s) 10.10(s)，10.12 10.11(s) -- - - -(s)属于表鬼臼毒素部分的信号1 4.61(br.d，4)4.71(2H，d，5) 4.67(br，s) 4.62(d，5)4.61(br.d，4)2 3.13(m) 3.12(2H，m)3.13(m) 3.14(dd，15，5) 3.14(dd，14，4)3 3.11(m) 3.05(2H，m)3.12(m) 3.02(tdd，15，7， 3.04(m)4)4 4.71(d，5) 4.68(2H，t，4) 4.71(d，5) 4.73(dd，5，5)4.73(br.s)5 6.58(s) 6.39(2H，s)6.59(s) 6.80(s) 6.80(s)8 6.39(s) 6.60(2H，s)6.39(s) 6.55(s) 6.54(s)114.00，4.27(t，9) 4.26(2H，m)4.20，4.27(t，9) 4.22(td，11，5) 4.01，4.40(t，9)4.00(2H，m) 4.00(td，11，5)OCH2O 5.92，5.98(br.s) 5.98，5.92 5.98(br.s) 5.92，5.99(d，1) 5.96，5.98(均为2H，分别为 (br.s)br.s)2””，6”” 6.39(s) 6.38(4H，s) 6.39(s) 6.34(s) 6.34(s)OCH3X23.81(s) 3.81(6H，s) 3.81(s) 3.80(s) 3.80(s)CH＝N 8.51(s) 8.51(s)，8.53 8.51(s) 8.57(s) 8.57(s)质子编号 9 10 11 12 13 14 15 16(s)NHC6H4-N＝ - - - 7.97，8.07(d，9) 7.97，8.04(d，8)*由于谱图复杂不能确定质子表2.12-16对所选人肿瘤细胞系的细胞毒性(ED50)(μM)化合物 KBA549HCT-8CAKI-1MCF-7SK-MEL-21A9(OVCAR)12 0.003 0.210.54 ＞0.250.33 ＞0.40 0.0313 16.5 NA1NA ＞4 ＞4 NA ND14 0.03 0.702.78 ＞5 1.23 8.900.1415 0.23 2.80＞0.1＞4 1.86 ＞400.3016 1.40 3.55＞40 ＞10 ＞5 ＞401.12GL-331 1.86 0.483.38 1.80 9.29 5.950.20依托泊苷 0.20 1.95＞5 2.2 ＞5 ND 0.60Cephalomannine 0.002 0.009 0.047＞0.3 0.1670.134 0.003紫杉醇 0.016 0.006 0.013ND2ND ND 0.0021NA＝没有活性2ND＝未测定表3.12-16对耐药性细胞系的细胞毒性(耐药性倍数)化合物 KB-7D KB-VCR KB-CPT PAX-10 PAX-2212 1 17 1 7 1713 0.6 -1- - -14 - - - ＞36 -15 1 8 1 ＞17 816 - - - 7.5-GL-331 2 3 1 13 8依托泊苷 119 1531 ＞16 ＞16Cephalomannine - - - 40 -紫杉醇 1 15 1 24 241ND＝未测定表4.12-16对NCI人肿瘤细胞系的细胞毒性(log GI50)1化合物 白血病 NSCL2结肠癌 CNS3黑素瘤 卵巢癌 肾癌 前列腺癌 乳腺癌12 -7.60-6.58 -7.20-6.93 -6.29-6.55- -7.22 -6.56.1313 -4.95-5.78 -4.90-5.20 -5.16-5.03- -5.06 -4.95.0815 -6.02-5.50 -5.12-5.54 -5.01-4.95- -5.06 -4/95/881数据由NCI提供。GI50为使肿瘤生长抑制50％的浓度。2非小细胞肺癌。3中枢神经系统癌。
表5.12-16的拓扑异构酶II抑制活性化合物 抑制Topo II细胞蛋白质-DNAIC100(μM) 复合物形成(％)12 100 8+/-213 50 NA114 NA2NA215 100 25+/-1116 NA2NA2GL-331 50 134+/-7依托泊苷 100 100Cephalomannine NA2NA2紫杉醇 NA1NA11在50μM没有活性；2在100μM没有活性。
前面为本发明的示例性说明，不能解释为对本发明的限制。本发明通过以下权利要求限定，与权利要求等同的实施方案也包括在本发明。
权利要求
1.一种式I化合物或其药学上可接受的盐T1-L-T2(I)其中T1为式II的紫杉类基团 其中R1为C6H5，R2为O；L为连接基团；T2为选自以下的取代基表鬼臼毒素、安吖啶、椭圆玫瑰树碱、蒽环类抗生素、米托蒽醌、丝裂霉素、喹诺酮和秋水仙碱基团。
2.权利要求1的化合物，其中T2为式III-A表鬼臼毒素基团 其中R10、R11、R12、R13、R15和R16各自独立选自以下基团H、烷基、羟基、烷氧基、烷基羟基和卤代；R14选自以下基团H、烷基、羟基、烷氧基、烷基羟基、卤代和磷酸盐；R17为NH或不存在。
3.权利要求1的化合物，其中T2为式III-B安吖啶基团 其中R20和R21各自独立选自以下基团H、烷基、羟基、烷氧基和烷基羟基；R22和R23各自独立选自以下基团H、烷基、羟基、烷氧基、烷基羟基和卤代；R24为NH或不存在。
4.权利要求1的化合物，其中T2为式III-C椭圆玫瑰树碱基团 其中R30为H或烷基、或者不存在；R31为H、烷基、羟基、烷氧基、烷基羟基(alkyhyroxy)、卤代或-C(O)-N(R36)-(CH2)n-N(R37)(R38)，其中R36、R37和R38各自独立选自H和烷基，n为1-6的整数；R32和R33各自独立选自以下基团H、烷基、羟基、烷氧基、烷基羟基和卤代；R34为H或烷基；R35为O或不存在。
5.权利要求1的化合物，其中T2为式III-D蒽环类抗生素基团 其中R40为H、烷基、羟基、烷氧基、烷基羟基或卤代；R41为羟基O-或共价键；R42为烷基、烷基羟基、CH2O-或CH2-；R43和R44各自独立选自H和羟基；R45为羟基或NH2；R46为H或卤代；条件是如果R41不为O-或共价键，则R42为CH2O-或CH2-；如果R42不为CH2O-或CH2-，则R41为O-或共价键。
6.权利要求1的化合物，其中T2为式III-E米托蒽醌基团 其中R50、R51、R52和R53各自独立选自OH或O-；条件是R50、R51、R52和R53其中之一为O-。
7.权利要求1的化合物，其中T2为式III-F丝裂霉素基团 其中X为NH2、NH-或脂肪族胺；R71为烷基或卤代；R72为羟基或烷氧基；R73为H或不存在；Y为H或烷基。
8.权利要求1的化合物，其中T2为式III-G秋水仙碱基团 其中R60和R61各自独立为H、烷基、羟基、O-或烷氧基；R62为H、NH2、NH-、OH、O-、＝O或NHCOCH3，X为S或O，条件是R60或R61其中一个为O-，或者R62为NH-或O-。
9.权利要求1的化合物，其中T2为式III-H喹诺酮基团 其中R81选自以下基团H、羟基、低级烷基、低级烷氧基、羟基、卤代和氨基；R82选自以下基团H、羟基、低级烷基、低级烷氧基、羟基、卤代和氨基；R83选自以下基团H、羟基、低级烷基、低级烷氧基、羟基、卤代和氨基；R84选自以下基团H、羟基、低级烷基、低级烷氧基、羟基、卤代和氨基；R85各自独立选自以下基团H、羟基、低级烷基、低级烷氧基、羟基、卤代和氨基；n为0-4。
10.权利要求1的化合物，其中L为式-La-Lb-的共价连接基团，其中Lb存在或不存在，La和Lb各自独立选自以下基团 和 其中a为0-3，b为0-3；R70选自亚烷基、链烯基和亚芳基。
11.一种药用制剂，所述制剂包含根据权利要求1的化合物和药学上可接受的载体。
12.权利要求11的药用制剂，其中所述载体为水性载体。
13.一种治疗肿瘤的方法，所述方法包括给予其需要患者治疗有效量的权利要求1化合物。
14.权利要求13的方法，其中所述肿瘤为实体瘤。
15.权利要求13的方法，其中所述肿瘤选自肺癌、结肠癌、中枢神经系统癌、黑素瘤、卵巢癌、前列腺癌和乳腺癌。
16.权利要求13的方法，其中所述肿瘤为乳腺癌。
17.权利要求13的方法，其中所述肿瘤为前列腺癌。
18.一种治疗其需要患者癌症的方法，所述方法包括给予所述患者癌症治疗有效量的权利要求1化合物。
19.权利要求18的方法，其中所述癌症选自小细胞肺癌、睾丸癌、淋巴瘤、白血病、食管癌、胃癌、结肠癌、乳腺癌、中枢神经系统癌、肝癌和前列腺癌。
20.一种诱导细胞分化的方法，所述方法包括使癌细胞与分化有效量的权利要求1化合物接触。
21.权利要求20的方法，其中所述接触步骤在体内进行。
22.权利要求20的方法，其中所述接触步骤在体外进行。
23.一种抑制细胞有丝分裂的方法，所述方法包括使细胞与有丝分裂抑制量的权利要求1化合物接触。
24.权利要求23的方法，其中所述接触步骤在体内进行。
25.权利要求23的方法，其中所述接触步骤在体外进行。
全文摘要
本发明提供根据式(I)的化合物及其药学上可接受的盐T
文档编号C07H15/26GK1474703SQ01819203
公开日2004年2月11日 申请日期2001年9月25日 优先权日2000年9月25日
发明者K·-H·李, Q·施, K·巴斯托, H·-K·王, K -H 李, ね, 雇 申请人:北卡罗来纳查佩尔山大学