专利名称：紫杉醇类药物疗效预测试剂盒及其应用的制作方法
紫杉醇类药物 t效预测试剂盒及其应用
本发明涉及一种检测人e —微管蛋白in在肿瘤组织中的表达水平的试剂盒，以此在临床 上预测对紫杉类治疗疗效好的患者。属于生物技术和临床医学检验领域。
肺癌的发病率及病死率在我国均有逐年上升的趋势，根据病理学的分型，确诊的肺癌中
约有80%为非小细胞肺癌(non-small-cell lung cancer NSCLC)，在每年新诊断的NSCLC中， 大部分患者的病程已到晚期而无法行手术治疗，化疗及放疗是针对这部分患者的主要治疗方 法，而化疗耐药是晚期患者治疗失败和死亡的主要原因。导致临床化疗耐药的原因有药代 动力学因素，肿瘤微环境因素，肿瘤细胞特异性因素等。在化疗方案与给药剂量相同的情况 下，不同个体对化疗的敏感性有很大的差异，这种差异使传统依靠经验进行化疗面临极大的 挑战，因此迫切需要一种能够预测化疗疗效的方法，为对患者进行个体化治疗提供依据。
紫衫醇类药物，是目前临床治疗NSCLC的常用药物。紫杉醇属细胞毒类化合物， 为一抗微管药物。促使微管蛋白二聚体装配成微管，并阻止其解聚而稳定微管,从而抑制了细胞 的有丝分裂起到了抗肿瘤作用,但不影响DNA、 RNA和蛋白质的合成。微管是真核细胞的
一种组成成份，它是由两条类似多肽(a和e)亚单位构成的微管蛋白二聚体形成的。正常情
况下，微管和微管蛋白二聚体之间存在动态平衡，紫杉醇可使两者之间失去动态平衡，诱导 和促进微管蛋白聚合防止解聚，稳定微管，这些作用导致细胞在有丝分裂时不能形成纺锤体 和纺锤丝，抑制了细胞分裂和增殖，从而发挥抗肿瘤作用。体外研究表明，紫杉醇浓度依赖 性地、可逆性地结合到微管上，尤其是结合到N端微管蛋白的13-亚单位上，这一作用降低了 聚合所需要微管蛋白的浓度，使动态平衡向着微管装配的方向移动，增加聚合的速率和产量。 另外紫杉醇抑制有丝分裂所必需的微管网的正常动态再生，会防止正常的有丝分裂纺锤体的 形成，导致染色体断裂并抑制细胞复制和移行。紫杉醇改变了细胞的有丝分裂过程，使有丝 分裂持续时间从0.5h增加到15h，并抑fij细胞质分裂。
目前紫杉醇类药物包括特素,泰素，安泰素，泰索帝,紫杉特尔，艾素等，主要应用于肺癌、 乳腺癌、结直肠癌、胰腺癌、转移性肾癌以及头颈部肿瘤的化疗。
3研究表明e微管蛋白m(e t u b u i i nin)的过表达影响患者对紫杉类药物的敏感
性。编码e t u b u 1 i n的基因定位于.6p21.3,有4个外显子,第4外显子是最重要的,不 仅是主要编码区，而且是e t u b u 1 i n与GTP和紫杉类药物作用的位点，经常发生突 变。0 t u b u 1 i n有7种异构体，V e r d i e r P i n a r d等用等电点聚焦和质谱 仪联合检测发现,在7种异构体中只有e t u b u 1 i nIII才是微管作用药物耐药的惟一标 志物。H a r i等将e t u b u 1 i nlllc D N A转染至哺乳动物细胞系，表达有P t u b u 1 i nIII蛋白的细胞显示出对紫杉醇耐药。R o s e 1 1等甩定量P C R法检测75例N S C L C石蜡组织中e t u b u I i nIIImR N A的表达，研究发现低e t u b u 1 i n III
表达的患者对紫杉醇敏感性高，疗效好，同时，e t u b u 1 i nIII表达与病情进展密切相
关。因此，肺癌患者治疗前通过检测p t u b u 1 i nffl等相关基因有助于指导化疗方案的 选择及预测疗效。0 t u b u 1 i nIII的低表达是晚期N S C L C接受紫衫醇类化疗的一个 预见性指标。这一结果告诉我们可通过检测P t u b u 1 i nIII的表达水平，指导选择是否 含紫衫醇类的方案治疗以及预测紫衫醇类药物的疗效，从而使病人真正接受个体化治疗，这 也将为术前术后化疗方案的选择提供有利的依据。
荧光定量PCR技术是当前检测基因表达水平的较精确的方法之一，技术成熟规范适合于 临床标准化的检测，对于活组织切除，纤支镜检查及手术中取得的肿瘤组织标本均可进行检 测。其检测结果将有益地指导晚期及术后的非小细胞肺癌患者的治疗。
本发明的目的在于应用Rea1-TimePCR技术，设计出一种检测人在肿瘤组织中P—微管蛋白III 的表达水平的试剂盒。该试剂盒包括Trizol、 RT-PCR逆转录试剂、T-载体连接试剂、荧光 定量PCR试剂、引物、TAQ酶、标准品。其中RT-PCR检测试剂特征是oligo(dT)2() ， dNTPmix， DEPC-treated water, 10XRT buffer, MgCl2， DTT， RNASEOUT ， Superscript III RT。 T-载体连接试剂特征是2X Rapid Ligation Buffer, pGEM-T Vector, T4DNA连接酶。荧光 实时定量RT-PCR检测人肿瘤组织ERCC1试剂特征是SYBRPremix ExTaq(2X)， Rox reference dye。
目标基因P t u b u 1 i nIII上下游引物分别是 forward: 5，- GCGAGATGTACGAAGACGAC -3' reverse: 5，- TTTAGACACTGCTGGCTTCG -3，；
校正基因Beta-Actin上下游引物分别是 forward: 5，-GCCAACCGCGAGAAGATGA-3' reverse: 5，-CATCACGATGCCAGTGGTA-3';
目标基因ERCC1标准品序列为校正基因Beta-Actin标准品序列为
GTCCCTGTACACCTCTGGCCGTACCACTGGCATCGTGATG。
该试剂盒采用SYBR Green嵌合荧光法进行Real-Time PCR对临床能取得肿瘤组织的患者 进行检测；检测方法筒单可行，检测结果稳定可靠，.具有髙特异性、高灵敏度的特点，而且 非常适于批量样本检测，可以用来筛选对紫杉类治疗有效的晚期或术后非小细胞肺癌患者。
图1是e-actin标准曲线； 图2是e-actin标准品扩增曲线； 图3是P-tubulin标准曲线; 图4是P -tubulin标准品扩增曲线。 实施例1、
一组织RNA的提取
1. 新鲜组织取下后，立即置于液氮中，然后存于一8(T C冰箱中保存待检测。
2. 取适当大小组织标本(约100毫克)用研铂在液氮中磨碎，移入装有1000ulTrizo1的 预冷的1. 5毫升离心管中，冰上放置10分钟。
3. 加入200ul的氯仿。
4. 用镊子取子弹头，盖上盖子，上下颠倒混匀，15S左右。
5. 静置5miru
6. 离心，12000RPM/min, 4°C， 15min。
7. 取上层。(中下层为蛋白质和DNA的混合物)
8. 加入异丙醇:1000ml Trizol加入500ul异丙醇.
9. 混匀，静置10min。离心，12000RPM/min， 4°C， 15min。
10. 直接将上清液弃掉，可以看见壁上有少许白色沉淀黏附。
11. 75%酒精洗涤加入量与Trizol—样。混匀。离心，8000g/min, 4。C, 15min。
12. 弃上清。
13. 真空干燥，约10min。
14. 用20ul DEPC-水溶解RNA (用Tip头反复吹打)。
15. 55°C-60'C水浴5min。
16. 1%琼脂糖凝胶电泳检测RNA的提取情况完整的RNA在紫外分析仪下可见三条带，分 别为28S, 18S, 5S。 28S的亮度应该为18S的两倍，5S带一般较弱，如有降解可见5S带增 强。
17. 测定所提RNA的OD260和0D280值，计算总RNA的浓度以及纯度0D260/0D280应在 1.8 — 2. 1之间:RT-PCR合成cDNA
1. 将试剂盒中的所有试剂混匀并快速离心收集;
2. 在0.2ml PCR反应管中加入以下反应物
lug总腿 nul 50uM oIigo(dT)20 lul 10mM dNTP mix lul DEPC—treatedwater 补足至lj lOyl
3. 65° C孵育5分钟，立即置于冰上至少1分钟。
4. 再在此管中加入以下反应物，混匀。
10XRT buffer 2ul 25 mM MgC12 4ul 0. 1 M DTT 2ul RNASE0UTTM(40U/ul) lul S叩erScriptTM III RT(200U/ul) lul
5. 50° C孵育50分钟，然后85° C反应5分钟。立即置于冰上。
6. 离心收集产物。加入lul RNase H，37° C孵育20分钟。
7. cDNA合成以后置于一20。 C保存待下游工作。
三标准品的构建
1. 快速离心PGEM-T Vector,收集反应物于管低。
2. 建立连接体系在0.2mlL离心管中以下反应物 2X Rapid Ligation Buffer 5ul -
pGEM-T Vector lul
PCR Product 2ul
T4 ■连接酶(3U/ul) lul
无菌水 lul
3. 混匀，室温1小时或4° C孵育过夜。
4. 准备两个AMP LB平板，室温放置备用。
5. 将连接体系中的反应物取2ul于7ml的离心管中。
6. 取50ul感受态细胞于7ml管中，轻弹混匀，冰浴30分钟。 7.42° C水浴热休克90秒。立即置于冰中2分钟。
8. 加950ul soc培养基于管中。37° C， 150rpm培养1个半小时。
9. 离心，1000g /min， 10min后弃上清收集细胞。
10. 加入100ul或200ul的SOC培养基，重新悬浮细胞，轻弹混合。
11. 于每个平板中加入100ul混合细胞液，用接种环铺丌反应液。 12.37° C孵育过夜。
13. 观察菌的生长情况，将单个菌落用枪头挑出后放进含100ulS,OC培养液的0. 5 ml的离心管 中反复吹打，将菌落洗脱。 .
14. PCR进行菌落的挑选，挑选目标菌落。
15. 取PCR结果合适的SOC培养基加入(5ml + 50ulA叩)的LB培养肉汤中，150rpm培养过夜。
16. 提取质粒，测0D值，计算此标准品的拷贝数。
17. 按照所需浓度稀释成工作液。
18. 测定标准品的序列，验证转入序列的正确性。
四荧光定量检测包括标准曲线的制作和未知样品的检测
1.确定未知样品的位置和重复数，最好每个样品重复三次。2. 将质粒标准品ERCC1和看家基因标准品日-actin倍比稀释成5个浓度108， 107， 106, 105， 104, 103，确定每个标准品的位置和重复数。
3. 在反应板的每个反应孔中加入以下体积的液体
SYBR P讓ix Ex 12.5 ul Taq(2X)
10uM sense primer 0.5 ul lOuM antisense primer 0.5 ul Rox reference dye 0.5 ul
Template DNA 1 ul
无菌水 10 ul
4. 盖上热反应膜，将反应板装入定量分析仪。
5. 按仪器操作创建定量反应板。
6. 指定热循环的条件并开始运行反应板-:
聚合酶的活化20秒@95匸
PCR扩增(40个循环)5秒@95°" 31秒@60匸
7. 保存文件，单击start开始。
8. 待反应完毕，分析数据，以e-actin作为标准，计算每个细胞的e — t u b u 1 i n III 的表达水平，如在中位数以上定为阳性，如在中位数以下定为阴性。
实施例2、通过检测肿瘤组织P —tubulinm表达水平用于预测非小细胞肺癌患者对紫杉醇类 治疗的疗效
对120例非小细胞肺癌患者进行了肿瘤组织e —tubulinIII表达水平检测，并根据检 测结果预测患者对紫杉醇类治疗的疗效，其准确率达85%，假阴性率为5%,假阳性率 为10%。
实施例3、紫杉醇类治疗的乳腺癌患者行肿瘤组织e —tubulinIII表达水平检测用于预测其对
紫杉醇类治疗疗效
对IOO例乳腺癌进行了肿瘤组织P—tubulinIII表达水平检测，并根据检测结果预测
患者对紫杉醇类治疗的疗效，其预测准确率达88%，假阴性率为5%，假阳性率为7%。
实施例4、检测肿瘤组织0 —tubiilinffl表达水平用于预测结直肠癌患者对紫杉醇类治疗的疗 效
对80例服用选择性表皮生长因子受体酪氨酸激酶小分子抑制剂，包括但不限于易瑞 沙，又名ZD1839, gefitinib或Ireesa和它塞瓦，又名0SI-774, Erlotinib或Tarceva， 是人工合成的小分子量化合物，的结直肠癌患者进行了 EGFR Intronl (CA)n微卫星多 态性检测，并根据检测结果预测患者对靶向抑制剂的疗效，其预测准确率达85%，假阴性率为6%，假阳性率为13%。
实施例5、肿瘤组织e —tubulinffl表达水平检测用于预测转移性肾癌患者对紫杉醇类治疗的 疗效
对20例接受紫杉醇类治疗治疗的转移性肾癌患者进行了肿瘤组织e —t油uiinin表
达水平检测，并根据检测结果预测患者对对紫杉醇类治疗的疗效，其准确率达73%,假 阴性率为13%，假阳性率为14%。 实施例6、头颈部肿瘤患者检测肿瘤组织e —tubulinin表达水平用于预测其对紫杉醇类治疗
的疗效
35例头颈部肿瘤患者接受紫杉醇类药物的治疗，我们对这35例患者进行了肿瘤组织 日一tubulinIII表达水平检测，并根据检测结果预测患者对紫杉醇类治疗的疗效，其准确 率达77%，假阴性率为10%，假阳性率为13%。
虽然上面结合实施例对本发明进行了具体描述，但是熟悉本领域的专业技术人员均 了解，在不违背本发明的原则和精神的情况下，.根据本说明书及所附权利要求书中公开 的内容，可对本发明做出各种变动和改进。因此，所有这些变动和改进均应包括在所附 权利要求书中所要求的保护范围之内。紫杉醇类药物疗效预测试剂盒及其应用
<1U>广东省人民医院
<120>紫杉醇类药物疗效预测试剂盒及其应用 <160> 6
<210> 1 <211> 20 <212>DNA <213>人工序列
<220>
<221>miSC feature <223>引物
<400> 1
gcgagatgta cgaagacgac 20
<210> 2 <211> 20 <212>DNA
<213>人工序列 . <220>
<221>miSC feature <223>引物
<400> 2
tttagacact gctggcttcg 20 <210> 3
<211> 19 _
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>miSC feature <223>引物
<400> 3
gccaaccgcg agaagatga 19<210> 4 <211> 19 <212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>miSC feature <223>引物
<400> 4
catcacgatg ccagtggta 19
<210> 5 <211>〗50 <212> DNA
<2i3>人i:序列
<220>
<221> miSC feature
<223> 0标基闪P t u b u 1 i nIII标准品序列 <400> 5
gtagcggagg ctgaggaaca gggcacaggt gctctggccc agcacatagt cgggaattac 60 gtcgccaaat tcccagggca cgttgcgcap gaacttcagt acgggattgc ccctctgccg 120 agggctcaca atgatgctgt tggattttgcc 150
<210> 6 <211> 120 <212> DNA
<2i3> 人r.序列
<220>
<221> miSC feature
<223>校il:基W Beta-Actin标准品序列
<400> 6
gccaaccgcg agaagatga ccagatcatg tttgagacct tcaacacccc agccatgtac 60 gtggccatcc aggcagcgct gtccctgtac acctctggcc gtaccactgg catcgtgatg 120
权利要求
1. 一种紫杉醇类药物疗效预测试剂盒，它包括Trizol、RT-PCR逆转录试剂、T-载体连接试剂、荧光定量PCR试剂、引物、TAQ酶、标准品，其特征在于目标基因βtubulinIII上下游引物分别是forward5’-GCGAGATGTACGAAGACGAC-3’reverse5’-TTTAGACACTGCTGGCTTCG-3’；校正基因Beta-Actin上下游引物分别是forward5’-GCCAACCGCGAGAAGATGA-3’reverse5’-CATCACGATGCCAGTGGTA-3’；目标基因ERCC1标准品序列为GTAGCGGAGGCTGAGGAACAGGGCACAGGTGCTCTGGCCCAGCACATAGTCGGGAATTACGTCGCCAAATTCCCAGGGCACGTTGCGCACGAACTTCAGTACGGGATTGCCCCTCTGCCGAGGGCTCACAATGATGCTGTTGGATTTTGCC；校正基因Beta-Actin标准品序列为GCCAACCGCGAGAAGATGACCCAGATCATGTTTGAGACCTTCAACACCCCAGCCATGTACGTGGCCATCCAGGCAGCGCTGTCCCTGTACACCTCTGGCCGTACCACTGGCATCGTGATG。
2. 如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于RT-PCR检测试剂为oligo(dT)2。 ， dNTPmix， DEPC-treated water, 10XRT buffer, MgCl2， DTT， RNASEOUT ， Superscript III RT。
3. 如权利要求l所述的试剂盒，其特征在于T-载体连接试剂为2X Rapid Ligation Buffer, pGEM-T Vector, T4DNA连接酶。
4. 如权利要求l所述的试剂盒，其特征在于荧光实时定量RT-PCR检测人肿瘤组织ERCCl试剂为 SYBR Premix Ex Taq(2X) ， Rox reference dye 。
5. 权利要求l所述试剂盒应用于紫杉醇类药物对肺癌、乳腺癌、结直肠癌、胰腺癌、转移性 肾癌以及头颈部肿瘤的疗效预测。
全文摘要
本发明属于生物技术和临床医学检验领域，公开了一种检测β微管蛋白III(βtubulinIII)在肿瘤组织中的表达水平的试剂盒，该试剂盒可以用来有效筛选对紫杉类药物治疗有效的恶性肿瘤患者。
文档编号G01N21/64GK101424638SQ20061012244
公开日2009年5月6日 申请日期2006年9月27日 优先权日2006年9月27日
发明者吴一龙, 张绪超, 林嘉颖, 强 聂, 嵩 董, 至 谢, 郭爱林, 陈世良, 陈志红 申请人:广东省人民医院