专利名称：一种含有溶菌酶的眼用制剂的制作方法
技术领域：
本发明属于酶学和药物制剂学领域，涉及一种含有溶菌酶的眼用制剂。
背景技术：
近年来，大量的眼科药物制剂的临床数据和研究资料表明，在眼部疾病的治疗过程中产生的副作用或不良反应有很多时候都是由于抑菌剂造成的。例如，眼部手术后使用药物进行术后治疗时，由于抑菌剂的影响而造成的角膜上皮细胞脱落等现象时有发生。并且，随着电脑、空调等的普及，干眼症患者人群也在不断增加，这类患者的治疗往往需要长期辅以人工泪液，而化学抑菌剂的长期使用会造成不同程度的角膜损伤。因此，眼用制剂中的抑菌剂带来的副作用已成为社会普遍关注的问题，也是目前全球眼科药物开发研究的热点。现有技术中采用多种方法来避免抑菌剂对眼部带来的伤害，如制成不含抑菌剂的眼科单剂量产品:如日本参天公司的可乐必妥滴眼液；也可以使用除菌的眼用制剂容器如:日本点眼剂研究所开发的乌诺前列酮异丙酯滴眼液。但这些包装方面的改善并不能保证完全无菌，且成本高，对于长期使用的人群来说，无疑会增加患者的经济负担。也有人尝试过在喹诺酮类滴眼液中不加抑菌剂，直接依靠药物的抗菌作用维持制剂的无菌状态。但由于喹诺酮类药物的抗菌谱及抑菌效力有限，其抑菌效果也不尽理想，不具备普遍应用性。溶菌酶(Lysozyme)是分子量为14.4kDa 的酶类，1922 年 Alexander Fleming 在寻找抗生素的过程中发现了溶菌酶。作为人体自身的抗感染天然屏障之一，它能够通过催化肽聚糖中N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡萄糖残基间和壳糊精中N-乙酰葡糖胺残基间的1，4-β链的水解，而破坏细菌的细胞壁，达到杀死细菌的目的，因此可以作为抑菌剂，已经在食物领域中得到应用 。溶菌酶作为酶类具高效性，其抗菌活性为同类化学物质的几十倍甚至上千倍；且作为人体固有活性物质，对人体无任何副作用，可应用于各类人群。除此之外，溶菌酶成本低廉、获取途经多、来源广阔，在蛋清、乳汁中都含有大量的溶菌酶，特别是近年来随着克隆技术的广泛应用，使得微生物提取溶菌酶也成为溶菌酶大量生产的一大途径。然而，溶菌酶在水中的稳定性较差，不能长时间保存。并且眼用制剂大多是水溶性制剂，因此溶菌酶应用于眼用制剂受到一定限制。
发明内容
本发明人经过深入的研究和创造性的劳动，获得了一种溶菌酶制剂。本发明人惊奇地发现，该溶菌酶制剂能够用于眼用制剂，并且溶菌酶在本发明的体系(包括合适的PH和稳定剂盐类浓度)中能够保持良好的稳定性。由此提供了下述发明:本发明者综合以上问题，寻找到一种对眼部安全、无刺激且高效的抑菌剂一溶菌酶，该抑菌剂可适用于各类人群，且成本低廉。溶菌酶作为一种眼用制剂的抑菌剂用量范围为 0.001%-25% (w/w)，优选范围为 0.01%-20% (w/w)，更优选为 0.1 %-15% (w/w)；进一步优选为0.3% -10% (w/w)，特别优选为0.5% -5% (w/w)。且在与其他抑菌剂联合使用，可以使两种抑菌剂的浓度同时降低，用量减小，降低其他抑菌剂对眼表的损害。过去虽有人考虑到以其作为眼用制剂的抑菌剂，但由于其在水溶液中的稳定性不佳，使得溶菌酶在此方面的应用未能得到发展。为保证溶菌酶的稳定性，发明人通过大量的实验，处理溶菌酶原料，使获得的精制溶菌酶可在水溶液中保持3-5年稳定，攻克了这个难题。处理工艺如下:I)将溶菌酶溶于注射用水，得到溶菌酶溶液；2)向步骤I)中的溶菌酶溶液中加入稳定剂盐类；3)调节 pH 至 4.6-9.0。在本发明的一个实施方案中，还包括步骤4)静置，使溶菌酶与稳定剂盐类充分接触后过滤；在本发明的一个实施方案中，还包括5)加入吸附性物质对溶液中的杂质进行吸附，获得澄清透明的溶液，吸附后过滤除去吸附性物质后备用。在本发明的一个实施方案中，还包括6)得到的溶液可采用冷冻干燥、喷雾干燥等方式，使其以固体形式保存以备制剂用；亦可调节至等电点后，收集固体，采用真空干燥等方式，收集固体；亦可以液体形式加入其他药物、渗透压调节剂、保湿增稠剂等原辅料直接投料制成眼用制剂，例如滴眼液、眼膏剂、眼用凝胶剂、眼用固体制剂等剂型。下面是对上述工艺的详细解释:发明中所涉及到的眼用制剂的剂型可以为滴眼液、眼膏剂、眼用凝胶剂、眼用固体制剂等眼科常用的液体、半固体、固体剂型。发明中所涉及到的pH值调节剂，以调节注射用水的pH值，此时用到物质可以为稀盐酸、醋酸、氢氧化钠等为人们所常用的酸碱调节剂，亦可以是一些具有酸碱度调节功能的盐类物质，如枸橼酸、硼酸，磷酸二氢钠、磷酸氢二钠等物质。本领域技术人员能够理解，pH值是眼用制剂中非常重要的技术控制指标，关系到本发明所述眼用制剂的稳定性、有效性及眼刺激性。此外，PH值对于蛋白质亦是一个重要的控制指标，众所周知，蛋白质具有一个特性指标——等电点。蛋白质的水溶液PH值离等电点越近，其在水溶液中的稳定性越差，相反越远则越稳定。且蛋白质容易在强酸强碱中发生不可逆的变性反应，也就是我们通常所说的蛋白质变质。溶菌酶作为一种蛋白类的酶，同样具有蛋白质的共同性质。本发明为含有溶菌酶的眼用制剂，在制备过程中需同时兼顾溶菌酶与眼用制剂的特点，因此pH值的控制在本品中可以说是关键中的关键。在以往溶菌酶纯化的过程中，pH值均在4.6以下，其主要原因是在保证溶菌酶稳定的前提下，提高溶菌酶的收率。但发明人发现，在此PH值条件下，得到的溶菌酶制剂对人眼刺激过强，但将PH值增大后，其稳定性又降低。本发明人通过大量的实验发现溶液pH值、盐浓度及处理溶菌酶浓度在溶菌酶原料处理过程中至关重要，通过精密控制这三项参数值可实现在与人体接近的 PH值下，获得更为稳定的溶菌酶溶液，且可将溶菌酶在处理过程中得到更高的收率。通过一系列实验，发明者将含溶菌酶的眼用制剂处理过程中的PH值控制在4.6-10.0间可保证溶菌酶的稳定性，优选为4.7-9.0 ;更优选为4.8-8.5 ;特别优选为5.0-8.0 ;进一步优选为 5.0-7.0 ;更进一步优选为 5.5-6.5，例如 5.5,5.6,5.7,5.8,5.9、
6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、或 6.5。本发明中所涉及的稳定剂，多为盐类，包括但不限于碳酸钠、碳酸氢钠、枸橼酸钠、硼酸、硼砂、磷酸二氢钾、氯化钾、氯化钙等中的一种或多种盐类，优选为选自硼酸、硼砂、枸橼酸钠、以及磷酸氢二钾中的任一种或者多种。不拘于理论的限制，硼酸、硼砂、枸橼酸钠、以及磷酸氢二钾同时兼具PH调节的作用。不拘于理论的限制，溶菌酶可能会与一些盐作用产生沉淀，或者是溶菌酶的空间构象发生改变，从而导致溶菌酶活性和/或稳定性的改变。不拘于理论的限制，上述稳定剂盐类兼具两种功效:其一为调节溶液渗透压，保证眼用制剂与泪液的渗透压相同而减少眼刺激。另一作用为，盐类的存在可以驱使溶菌酶的构型中同性电荷的分子以斥力在溶液中保持稳定，而异性电荷的分子则会相互聚集而沉淀，从溶液中分离。盐类的存在可有效的除去溶液中的不稳定因素，从而保证溶菌酶稳定性。本发明通过大量试验获得稳定剂的以上作用机理，打破以往普遍使用的氯化钠等盐类的单纯局限，得到了更适合溶菌酶的稳定剂盐类，并且增加了稳定剂盐类的种类，使制剂的制备组方上更为多样化。发明人在对比处理与未处理过溶菌酶原料的活性时，惊奇地发现，稳定剂盐类的加入可以保持或增强溶菌 酶原料的活性。有些盐类甚至可以直接用于调节溶液的PH值，可作为之后所制备制剂中缓冲盐。在上述发明中已提及，本品是通过控制pH值、稳定剂盐浓度、溶菌酶浓度三个指标来对溶菌酶浓溶液进行处理，而得到稳定的溶菌酶眼用制剂的。因此在本发明中，盐类的用量亦是很重要的控制指标之一。盐的量通常在0.001%-30% (w/w)之间；优选为0.01 % -25% (w/w),更优选为 0.1% -20% (w/w);特别优选为 1% -20% (w/w),进一步优选为 3% -15% (w/w)，例如 3%,4%,5%,6%,7%,8%,9%,10%,11%>12%,13%,14%,或 15% (w/w)。上述发明中所涉及的静置是为保证在特定的pH值下，盐类物质与溶菌酶充分接触而设计的，充分的接触有利于更好的沉淀异性电荷，排除不稳定性因素，使获得的溶菌酶更加稳定。静置通常在0°C-40°C环境下(例如室温或者常温)进行，静置的时间在为不小于2小时，例如2-48小时。本发明人在研究中发现，盐析虽可以保证溶菌酶在一定时间的稳定性，但是在长时间的储存过程中，含溶菌酶的滴眼液仍会出现少量的析出物。经发明人进行大量实验研究，发现在上述盐析过程的基础上加上吸附沉降的过程，可以使得溶菌酶更加稳定的存在于溶液体系中。上述发明中所涉及的吸附性物质，目的在于保证液体中的溶菌酶以最稳定的构型或者空间构象存在。不拘于理论的限制作为蛋白质，溶菌酶在水中会以各种构型存在，而各种构型之间会互相转变。曾经有人对其各种构型进行研究，发现溶菌酶在水溶液中大部分都是表面带负电的，而其带正电为少量，正是由于这种正电构型的分子对带有异性电荷(负电)的分子具有一定的吸引力，从而造成蛋白质聚集。因此，本发明者采用一些带有负电的吸附剂，对溶液中的不稳定因素进行吸附，以使其溶液稳定性增加。本发明中采用的吸附剂包括活性炭、硅藻土、膨润土等。使用量为0.001%-10% (w/w)之间；优选为0.01-8%;更优选为 0.1% -6%。吸附的温度为(TC -80°C;优选为 5°C -75°C、10°C -70°C >20°C -65°C、或 30。。-60。。。吸附时间一般为 5min-48h ;优选为 IOmi n_36h、15min-24h、20min_12h、25min_6h、或 30min_2ho处理工艺中涉及到两次过滤，此过滤可以为单层滤纸、滤膜的简单过滤，亦可以为深层过滤，如砂滤棒、石英砂板、钛棒、用于深层过滤的纸板以及适应工业化生产的滤芯过滤等过滤方式。处理后的溶菌酶，可直接以液体形式进行投料；亦可借助冷冻干燥等干燥技术，或者借助氢氧化钠等碱性水溶液等物质将其PH值调节至溶菌酶等电点附近，使其大量析出后，过滤干燥，以固体状态使用。以上两种状态均可直接作为抑菌剂使用。如采用冷冻干燥工艺处理得到溶液，其冻干条件:现将处理后的到的溶液放入低温冰箱中进行预冻，预冻的温度在_80°C -70°C间，通常预冻8-12小时后，取出迅速放入已降温的冷阱中，冷阱的初始温度在_50°C _30°C间，抽真空Ih后，缓慢升温至-25°C -20°C后，继续抽真空10h，待水分基本完全升华后转入次级冻干，次级冻干过程中，将温度升至10°C后，保温5h左右，直至次级冻干结束。如采用喷雾干燥 条件:加料速度通常在1.0-3.0ml/min，进口气流温度通常为1050C _120°C，出口气流温度在 600C _80°C，喷头压力在 1.0-1.2kg/cm2。亦可采用氢氧化钠水溶液等碱性溶液调节其pH至等电点，收集固体后，采用25 0C -40 V，真空干燥24h左右，至其完全干燥后，收集得到的固体粉末。本发明还涉及如下的(I)-(IO)项中的任一项:1.一种眼用制剂，其含有溶菌酶，并且所述溶菌酶的含量为0.001%-25% (w/w)、0.01 % -20% (w/w) >0.1 % -15% (w/w) >0.3% -10% (w/w)或 0.5%-5% (w/w)。2.根据第I项所述的眼用制剂，其中，所述溶菌酶是以溶菌酶制剂的形式添加的，并且所述溶菌酶制剂通过如下步骤制备:I)将溶菌酶溶于注射用水，得到溶菌酶溶液；2)向步骤I)中的溶菌酶溶液中加入稳定剂盐类；3)调节 pH 至 4.6-9.0。3.根据第2项所述的眼用制剂，其中，所述溶菌酶溶液中溶菌酶的浓度为0.001 % -50 % (w/w)、0.01 % -20 % (w/w)、0.I % -15 % (w/w)、0.3 % -10 % (w/w)或0.5% -5% (w/w)。4.根据第2项所述的眼用制剂，其中，所述稳定剂盐类选自碳酸钠、碳酸氢钠、枸橼酸钠、硼酸、硼砂、磷酸二氢钾、氯化钾、以及氯化钙中的一种或多种；优选自硼酸、硼砂、枸橼酸钠、以及磷酸氢二钾中的一种或多种。5.根据第2项所述的眼用制剂，其中，所述pH为4.7-9.0、4.8-8.5、5.0-8.0、5.0-7.0、或 5.5-6.5。6.根据第2项所述的眼用制剂，其还包括下述步骤:4)静置，使溶菌酶与稳定剂盐类充分接触后过滤，得到滤液；优选地，所述静置在0°C -40°C环境下进行，静置时间为2-48小时之间。7.根据第2项所述的眼用制剂，其还包括下述步骤:5)加入带负电的吸附剂对滤液中的杂质进行吸附，获得澄清透明的溶液，然后过滤除去吸附性物质；优选地，所述吸附剂选自活性炭、硅藻土、和膨润土中的一种或多种。
8.根据第2项所述的眼用制剂，其中，所述吸附剂的使用量为0.001%-10% (w/w),吸附时间为5min_48h。9.根据第2至8项中任一项所述的眼用制剂，其还包括下述步骤:将溶菌酶制剂溶液制成溶菌酶制剂固体粉末；具体地，使用冷冻干燥或者喷雾干燥制得溶菌酶制剂固体粉末。10.根据第I至9项中任一项所述的眼用制剂，其为滴眼液、眼膏齐U、眼用凝胶剂、或眼用固体制剂。发明的有益效果溶菌酶为人体本身所固有，在泪液中作为一种抵御外界细菌等有害物质侵袭的天然抗菌物质，因此，对人体无任何危害，可以保证在长期使用的情况下对眼表无损伤，是一种理想抑菌剂。且作为天然抑菌剂，剂量的增大不会对人体产生任何副作用，因此为了加强抑菌效力可适当增大剂量，使获得的眼用制剂在达到良好稳定性的同时保证绝对的安全性。且与化学抑菌剂组成复合抑菌剂，可使化学抑菌剂用量降低至对人体损害较小的用量，而不降低整体防腐效力。发明人解决了溶菌酶在溶液中稳定性问题，从而扩展了溶菌酶作为抑菌剂的使用范围。在国内乃至全球范围内首次将溶菌酶作为眼科抑菌剂应用于眼科药物制剂中。本发明的眼用制剂以及其中的溶菌酶稳定性良好，并且具有良好的抑菌和/或防腐的性能，也有利于长期储存。
具体实施例方式下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。实施例1:溶菌酶制剂的制备(I)取0.5g溶菌酶原料加入注射用水IOOg中，搅拌溶解，待全部溶解后备用；(2)向其中加入磷酸二氢钠16g，使用lmol/L氢氧化钠调节注射用水的pH值至
5.0±0.2 ；(3) 20°C静置48h，混合纤维素膜过滤；(4)加入活性炭0.02g，70°C吸附20min，布氏漏斗过滤除去活性炭，将得到的溶液。(5)将处理后的到的溶液放入低温冰箱中，-70°C预冻，通常预冻8h后，取出迅速放入已降温的冷井中，冷井的初始温度在_40°C间，抽真空Ih后，缓慢升温至-20°C后，继续抽真空10h，待水分基本完全升华后转入次级冻干，将温度升至10°C后，保温5h左右，冷冻干燥后得到溶菌酶制剂。实施例2:溶菌酶制剂的制备(I)取硼酸6.2g，硼砂0.029g加入注射用水IOOg中，搅拌溶解，待全部溶解后备用；(2)向其中加入2.5g溶菌酶原料，使其pH值至6.3±0.3 ;
(3) 4°C冷藏静置2h，垂融漏斗过滤；(4)加入膨润土 2g，80°C吸附5min，砂滤棒过滤除去膨润土，得到处理后的溶菌酶制剂备用。实施例3:溶菌酶制剂的制备(I)取硫酸钠4.0g加入注射用水IOOg中，搅拌溶解，待全部溶解后备用；(2)向其中加入5.0g溶菌酶原料，氢氧化钠调节pH值至8.0±0.2 ;(3)室温(25 °C )静置6h，砂滤棒过滤；(4)加入活性炭10.0g,室温(25°C )吸附24h，砂滤棒过滤除去活性炭后，10%氢氧化钠浓溶液调节PH值至10.8±0.3，等电点沉降溶菌酶固体，过滤收集固体，在30°C下，真空干燥24h即得溶菌酶制剂。实施例4:溶菌酶制剂的制备(I)取20.0g溶菌酶原料加入注射用水50g中，搅拌溶解，待全部溶解后备用；(2)向其中加入柠檬酸钠0.2g，使其pH值至5.5±0.2 ；(3) I (TC静置12h，深层过滤纸板过滤；(4)加入硅藻土 2.0g, 10°C吸附48h，砂滤棒过滤除去硅藻土后，得到溶菌酶制剂备用。实施例5:溶菌酶制剂的制备(I)取10.0g溶菌酶原料加入注射用水IOOg中，搅拌溶解，待全部溶解后备用；(2)向其中加入氯化钠5.0g，三乙醇胺调节pH值至7.5±0.3 ；(3) 8°C静置24h，滤芯过滤；(4)加入活性炭5.0g，25°C吸附12h，砂滤棒过滤除去活性炭后，进行喷雾干燥。(5)喷雾干燥的加料速度为1.0ml/min，进口气流温度通常为120°C，出口气流温度在60°C，喷头压力在1.2kg/cm2，干燥后得溶菌酶制剂。注:上述实施例1-5中所使用的溶菌酶原料为溶菌酶的纯品或基本上为纯品(可视为纯品)，其中溶菌酶的含量约为I万U/mg。实施例6-1:以溶菌酶制剂做为抑菌剂的聚乙烯醇滴眼液I)处方:
权利要求
1.一种眼用制剂，其含有溶菌酶，并且所述溶菌酶的含量为0.001%-25% (w/w),0.01 % -20% (w/w) >0.1 % -15% (w/w) >0.3% -10% (w/w)或 0.5%-5% (w/w)。
2.根据权利要求1所述的眼用制剂，其中，所述溶菌酶是以溶菌酶制剂的形式添加的，并且所述溶菌酶制剂通过如下步骤制备: 1)将溶菌酶溶于注射用水，得到溶菌酶溶液； 2)向步骤I)中的溶菌酶溶液中加入稳定剂盐类；3)调节pH 至 4.6-9.0。
3.根据权利要求2所述的眼用制剂，其中，所述溶菌酶溶液中溶菌酶的浓度为0.001 % -50 % (w/w)、0.01 % -20 % (w/w)、0.I % -15 % (w/w)、0.3 % -10 % (w/w)或0.5% -5% (w/w)。
4.根据权利要求2所述的眼用制剂，其中，所述稳定剂盐类选自碳酸钠、碳酸氢钠、枸橼酸钠、硼酸、硼砂、磷酸二氢钾、氯化钾、以及氯化钙中的一种或多种；优选自硼酸、硼砂、枸橼酸钠、以及磷酸氢二钾中的一种或多种。
5.根据权利要求2所述的眼用制剂，其中，所述pH为4.7-9.0,4.8-8.5,5.0-8.0、5.0-7.0、或 5.5-6.5。
6.根据权利要求2所述的眼用制剂，其还包括下述步骤: 4)静置，使溶菌酶与稳定剂盐类充分接触后过滤，得到滤液；优选地，所述静置在0°C _40°C环境下进行，静置时间为2-48小时之间。
7.根据权利要求6所述的眼用制剂，其还包括下述步骤: 5)加入带负电的吸附剂对滤液中的杂质进行吸附，获得澄清透明的溶液，然后过滤除去吸附性物质；优选地，所述吸附剂选自活性炭、硅藻土、和膨润土中的一种或多种。
8.根据权利要求7所述的眼用制剂，其中，所述吸附剂的使用量为0.001%-10% (w/w),吸附时间为5min_48h。
9.根据权利要求2至8中任一项所述的眼用制剂，其还包括下述步骤: 将溶菌酶制剂溶液制成溶菌酶制剂固体粉末；具体地，使用冷冻干燥或者喷雾干燥制得溶菌酶制剂固体粉末。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的眼用制剂，其为滴眼液、眼膏剂、眼用凝胶剂、或眼用固体制剂。
全文摘要
本发明属于酶学和药物制剂学领域，涉及一种含有溶菌酶的眼用制剂。具体地，所述眼药制剂中溶菌酶的含量为0.001％-25％(w/w)、0.01％-20％(w/w)、0.1％-15％(w/w)、0.3％-10％(w/w)或0.5％-5％(w/w)。本发明的眼用制剂以及其中的溶菌酶稳定性良好，并且具有良好的抑菌和/或防腐的性能，也有利于长期储存。
文档编号A61K38/47GK103182074SQ20111045126
公开日2013年7月3日 申请日期2011年12月30日 优先权日2011年12月30日
发明者刘继东, 唐海, 王征月 申请人:沈阳兴齐眼药股份有限公司