专利名称：作为人用疫苗的重组分枝杆菌的制作方法
作为人用疫苗的重组分枝杆菌本发明涉及在人对象中提供保护性免疫、特别是针对结核的保护性免疫的新型重组疫苗。1993年，世界卫生组织(WHO)已宣布结核(TB)全球性紧急状况。全世界约20亿
人i’2感染有结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis) -TB的病原微生物。这些
人均存在发展为该疾病的临床症状的风险。在大多数个体中，结核分枝杆菌感染最初被宿主防御所耐受，感染仍处于潜伏期。然而，潜伏的TB感染具有在任何时候发展为活动的TB病的潜能，而带有活性的TB的个体成为新的感染源。在WHO报告(2009)中，报道2007年新病例的数量为930万S并且正稳步增长。每年，约180万人死于该疾病。因此，TB继续成为全球范围内感染病致死的主要起因。卡介苗(Bacillus Calmette-Guerin,BCG)，减毒的牛分枝杆菌菌株，自1921年已用作TB疫苗。迄今，约40亿剂量已经被施用。3然而，以BCG接种疫苗对于阻止TB散布不够有效。BCG可以防止、至少减轻儿童系统性TB的严重症状，特别是脑膜炎。BCG不防止该疾病的肺感染形式。4然而，这对于中断该疾病的传播可能是必要的。仅存在几种抗生素治疗。它们越来越多地失败，因为越来越多的患者被多药耐药性的TB菌株所感染。15使这种状况更严重的是，新的高度致病性菌株，如结核分枝杆菌Bei jing/W,正在传播。6本发明的一个目的是开发抗TB的安全、良好耐受而有效的疫苗，特别对于流行病区的居民和非流行病区危险人群。该疫苗将替代当前所用的BCG疫苗。新的疫苗应当至少与现有菌株一样有效，并应当比BCG更为安全。5’7结核分枝杆菌和BCG由宿主巨噬细胞吞噬。细菌病原体在吞噬体内的定位使得细菌抗原通过主要组织相容性复合物(MHC) II途径运输。这导致优选刺激⑶4T细胞。然而，已表明MHC I限制性CD8毒性T细胞在针对结核分枝杆菌的免疫中至关重要。8，9不同于结核分枝杆菌，BCG仅对⑶8细胞毒性T细胞有微弱刺激。2，3〃°因此，产生表达吞噬溶酶体逃逸结构域的重组BCG菌株，以将分枝杆菌病原体导向MHC I途径。2，7该菌株分泌单核细胞增多性李斯特氏菌(L.monocytogenes)的李斯特菌溶胞素(Hly)。7’n这使得该菌株可以通过穿透吞噬体膜的方式逃逸受感染宿主细胞的吞噬体。失活脲酶C基因对于在吞噬体中保证最适Hly活性的酸性pH值是必需的。穿孔促使抗原转位到胞浆中，并且有利于通过增加的细胞凋亡得到交叉敏化。7’9这个过程能非常有效的模拟结核分枝杆菌对于免疫系统的诱导。这个作用模式预期将会发展出针对TB的有效并很好耐受的疫苗。这些概念已经在W099/101496和W02004/094469中描述过，其内容通过引用并入本文。在这个研究中，重组脲酶缺陷型BCG疫苗首次被应用与人类对象。本研究评估了这种疫苗的安全性，局部 与系统耐受性以及免疫原性。与商用的BCG疫苗相比，本研究使用了剂量递增的序贯设计。在德国，80个对象按照他们以前BCG的免疫记录分层被随机分为4组,每组20个对象。除了标准安全性监控之外，还进行加强型安全性监控，包括实验室参数、身体安全评估和详细的ECG分析。本发明的一个主题是应用于人的包含重组分枝杆菌作为活性成分的疫苗，所述重组分枝杆菌是脲酶缺陷型的并且包含编码融合多肽的重组核酸分子，所述融合多肽包含Ca)结核分枝杆菌抗原或其免疫原性片段，和(b)吞噬溶酶体逃逸结构域。本发明的另一主题是一种对人类对象接种疫苗的方法，包括施用药学上有效剂量的重组分枝杆菌，所述重组分枝杆菌是是脲酶缺陷型的并且包含编码融合多肽的重组核酸分子，所述融合多肽包含(a)结核分枝杆菌抗原或其免疫原性片段，和(b)吞噬溶酶体逃逸结构域。在一个特别优选的实施方案中，ureC序列是失活的(AUrec)，比如通过构建包含被选择性标记基因打断的ureC基因的自杀载体，用该载体转染目标细胞，并筛选具有脲酶阴性表型的选择性基因阳性细胞。所述细胞优选为牛分枝杆菌(M.bovis)细胞、结核分枝杆菌细胞(尤其是减毒的结核分枝杆菌细胞)或其他分枝杆菌，比如田鼠分枝杆菌(M.microti)、耻垢分枝杆菌(M.smegmatis)、卡内蒂分枝杆菌(M.canetti)、海洋分枝杆菌(M.marinum)或偶发分枝杆菌(M.fortuitum)。更优 选的,所述细胞是重组牛分枝杆菌OCG)细胞,尤其是来自丹麦株布拉格亚型(Danish subtype Prague)的重组牛分枝杆菌细胞13。最优选的，所述细胞是重组BCG丹麦株布拉格亚型，其表征为rBCG AUrec::Hly+::Hyg+(VPM1002)。本发明的分枝杆菌细胞包含重组核酸分子，如SEQ ID N0.1的核酸分子。该核酸分子包含信号肽编码序列(核苷酸1-120),编码免疫原性结构域的序列(核苷酸121-153),肽接头编码序列(核苷酸154-210)，编码吞噬溶酶体结构域的序列(核苷酸211-1722)，另一肽接头编码序列(核苷酸1723-1800)和编码随机肽的序列(核苷酸1801-1870)。相应的氣基酸序列不于SEQ ID N0.2。能够引发免疫反应的结构域选自牛分枝杆菌或结核分枝杆菌来源的免疫原性肽或多肽，或者长度为至少6个氨基酸、优选至少8个氨基酸的其免疫原性片段。合适抗原的具体实例是从结核分枝杆菌来源的Ag85B(p30) (Harth等人，1996)，从牛分枝杆菌BCG来源的Ag85B( a -抗原)(Matsuo等人，1988),从结核分枝杆菌来源的Ag85A(Huygen等人，1996),以及从结核分枝杆菌来源的ESAT-6 (Sorensen等人，1996, Harboe等人，1996和Andersen等人，1995)。更优选,免疫原性结构域衍生于抗原Ag85B。最优选,免疫原性结构域包含在SEQ ID N0.2中从41位到51位氨基酸的序列。重组DNA分子进一步包含吞噬溶酶体逃逸结构域，即提供融合多肽从吞噬溶酶体中逃逸到哺乳动物细胞胞浆中的多肽结构域。优选的是，该吞噬溶酶体逃逸结构域是在US5, 733，151描述过的李斯特氏菌的吞噬溶酶体逃逸结构域。更优选的是，吞噬溶酶体逃逸结构域是从单核细胞增多性李斯特氏菌的李斯特菌溶胞素基因(Hly)衍生而来的。最优选的是，该吞噬溶酶体逃逸结构域由选自下列的核酸分子编码:(a)包含如SEQ ID N0.1中所示的211-1722位核苷酸的核苷酸序列，(b)编码与在(a)序列相同氨基酸序列的核苷酸序列，和(c)在严格条件下和(a)或(b)序列发生杂交的核苷酸序列。除了在SEQ ID N0.1中描述的核苷酸序列之外，本发明也包括与之发生杂交的核酸序列。在本发明中，如 Sambrook 等人(Molecular Cloning.A laboratory manual, ColdSpring Harbor Laboratory Press (1989), 1.101-1.104)中所定义使用术语“杂交”。在本发明中，术语“杂交”在如下情况使用:在55° C、优选62° C、更优选68° C以IX SSC和0.1%SDS洗涤I小时之后，特别是在55° C、优选62° C、更优选68° C以0.2X SSC和
0.1%SDS洗涤I小时之后，仍然能够观察到阳性杂交信号。在这种洗涤条件下与SEQ IDN0.1的核苷酸序列发生杂交的序列是本发明中优选的编码吞噬溶酶体逃逸结构域的核苷酸序列。在上面描述的编码吞噬溶酶体逃逸结构域的核苷酸序列可以直接获自李斯特菌体或者任何重组来源，例如含有在上面描述的相应李斯特菌核酸分子或者其变体的重组大肠杆菌细胞。优选，编码融合多肽的重组核酸分子含有信号肽编码序列。更优选，所述信号肽是在分枝杆菌中、优选牛分枝杆菌中有活性的信号序列，例如天然牛分枝杆菌信号序列。合适的信号肽的优选实例是编码Ag85B信号肽的核苷酸序列，其在SEQ ID N0.1中从1-120位核苷酸。进一步，优选在免疫原性结构域与吞噬溶酶体逃逸结构域之间提供肽接头。优选的是，所述肽接头长度为5-50个氨基酸。更优选的是，在SEQ ID N0.1中从154-210位核苷酸序列，或者由于遗传密码子简并性与该序列相应的序列。所述核酸序列可位于重组载体上。优选，所述重组载体是原核生物载体，即包含在原核生物细胞中复制和/或基因组整合的元件的载体。优选，所述重组质粒携带可操作地连接于表达控制序列的本发明的核酸序列。优选，所述表达控制序列为在分枝杆菌中、特别是牛分枝杆菌中有活性的表达控制序列。所述载体可以是染色体外载体，或者是适合于染色体整合的载体。所述质粒对于本领域技术人员是已知的，并且，例如在如上所述的Sambrook等人中提供。
在一些实施方案中，重组分枝杆菌细胞可以携带抗生素抗性基因，比如潮霉素(Hyg)抗性基因。在其它实施方案中，重组分枝杆菌细胞不携带抗生素抗性基因。优选，所述疫苗为应用于人的活疫苗，比如用于感染分枝杆菌、例如结核的流行病区的居民，或者在非流行病区的危险人群。所述疫苗可施用于未用分枝杆菌(比如BCG)免疫的对象，例如未预暴露于免疫原性分枝杆菌攻击的人或未用BCG预免疫的人。这些对象的例子是例如新生儿或者儿童，例如可达8岁的儿童，例如在分枝杆菌感染比如结核病流行病区，或者在非流行病区的危险人群。所述疫苗特别适合于接种具有HIV阳性父母例如母亲的对象。所述疫苗也可施用给HIV感染流行人群中未用分枝杆菌(比如BCG)免疫的对象。在其他实施方式中，所述疫苗可以施用给例如居住于结核病流行的地区中预先暴露于分枝杆菌例如BCG的对象，例如9岁以上的儿童或成人，或施用给用BCG预先免疫的对象。在这些对象中，本发明疫苗对已经存在BCG诱导的免疫状态具有增强效应。在进一步的优选实施方案中，施用所述疫苗在未免疫或预先免疫的对象中产生增加的IFN- y反应，并且上调⑶4+T细胞，特别是多功能⑶4+T细胞。在优选的实施方式中，所述疫苗是包含分枝杆菌细胞并任选地包含试剂诸如葡萄糖和/或葡聚糖的冻干物。任选地，所述疫苗额外地包含重构液、注射用水或盐水。在一些实施方案中，所述疫苗包含大约IO3-1O4CFU (菌落形成单位)、大约IO4-1O5CFU或大约IO5-1O6CFU 的剂量。粘膜表面施用(比如眼、鼻内、经口、胃、肠、直肠、阴道或泌尿道)或通过非肠道途径施用(比如皮下、皮内、肌内、静脉内或腹膜内)也可被选择。特别优选的是皮内施用。在一些实施方式中，所述疫苗以单剂量施用，包括免疫未用分枝杆菌免疫的对象或者加强接种预先暴露于分枝杆菌的对象，例如在施用本发明的疫苗之前已经用基于分枝杆菌的疫苗(例如用于已经与分枝杆菌例如病原性分枝杆菌接触的对象的天然BCG疫苗)预先接种的对象。可选地，本发明的疫苗可以以两个或更多剂量施用。每个剂量可以以大约I周到大约6个月或更长的间隔施用时间。本发明的疫苗用于对抗分枝杆菌的感染，特别是用于对抗结核的感染。本发明将使用下面的图、序列表和实施例来进一步说明。
图1:处理组的平均红斑大小和研究天数的相关性图2:处理组的平均硬结大小和研究天数图3:用Ag85B刺激未免疫对象后IFN- y反应相对于基线的平均变化。A.PBMC ELISA，测定 IFN-YB.ELISpotC.全血 ELISA，测定 IFN- y所有测定均用2 u g/mL的Ag85B进行刺激。VPM1002 (5x10s)组使用红色柱表示，BCG组用蓝色柱表示。刺激:Ag85B2ii g/mL。VPM1002增强了 IFN-Y反应。图4:在预先免疫的对象中用Ag85B刺激后IFN- y反应相对于基线的平均变化。A.PBMC ELISA，测定 IFN-YB.全血 ELISA，测定 IFN- y所有测定均用2 u g/mL的Ag85B进行刺激。VPM1002 (5x10s)组使用红色柱表示，BCG组用蓝色柱表示。刺激:Ag85B2ii g/mL。VPM1002增强了 IFN-Y反应。图5:在未免疫对象中单阳性与多功能CD4+T细胞相对于基线的变化。A.用PH)再刺激的单阳性⑶4+T细胞(表达IFN- y )的频率B.用Ag85B再刺激的多功能⑶4+T细胞(表达IFN- y和IL-2)的频率C.用PH)或再刺激的多功能⑶4+T细胞(表达IFN- y和TNF- a )的频率D.通过对来自用VPM1002 (红色)或BCG对照(蓝色)免疫的成年人的PBMC进行FACS ICS来测定Ag85B再刺激的。SEQ ID N0.1:表示编码分枝杆菌85B抗原和李斯特菌吞噬溶酶体逃逸结构域的核酸分子的核苷酸序列。SEQ ID N0.2:表示与SEQ ID N0.1的核酸序列相对应的氨基酸序列。
实施例在针对BCG接种史分级的健康男性志愿者中进行I期临床研究以评价本发明的疫苗(VPM1002)相比于BCG的安全性与免疫原性。1.疫苗VPM1002的鉴定
VPM1002是从牛分枝杆菌BCG丹麦株布拉格亚型(表征为rBCG AureC::Hly+::Hyg+)来源的经过基因修饰的BCG疫苗。VPM1002可以活的牛分枝杆菌BCGAureC::Hly+::Hyg+的冻干块获得。一瓶包含 5xl06CFU(范围 2_8xl06CFU)的 VPM1002。李斯特菌溶胞素基因(Hly)被整合在脲酶C基因(ureC)中，这使得脲酶C活性缺失并引入李斯特菌溶胞素活性。VPM1002是具有潮霉素(Hyg)抗性的。潮霉素抗性作为在该菌株的基因改造中的选择性标记，并作为在基因修饰生物(GMO)监测与GMO应急计划(GMO-emergency-plan)中的特异性标记。VPM1002对于在治疗分枝杆菌中普遍使用的抗生素敏感，比如异烟肼、利福平和こ胺丁醇。VPM1002以冻干(冷冻干燥)块供应，该冻干块采用ImL H2O (可注射用水)重构。重构之后的浓度大约在5x106CFU。对于5xl03和5x104CFU的施用剂量，分别使用无菌直接应用的0.9%氯化钠溶液以1:100或1:10的比例稀释重构的VPM1002悬液。2.目的本研究的主要目的是研究单剂量的VPM1002的安全性。本研究的次要目的是研究单剂量的VPM1002用于接种抗结核病的免疫原性。3.方法学(研究设计)这是首次将VPM1002应用于人。本研究遵循开放、随机、可控、剂量递增的设计，以评估单剂量VPM1002的安全性与免疫原性。将单次VPM1002接种皮内施用给未免疫卡介苗(BCG)的对象或用BCG预先免疫的对象(在接种记录中有BCG接种记录或有BCG疤痕，并且在两种情况下纯化蛋白衍生物(PPD)皮试中均不强于弱阳性)。研究三个递增剂量的VPM1002。參考组对象接受单剂量的BCG疫苗。接种疫苗后，紧密监测安全參数，直至给药后4小吋。之后对象被允许离开诊所，除了每个剂量组的前3名对 象。他们留在诊所直到接种疫苗之后24小吋。安全性与药物动力学评估被进行至第57天，并在接种疫苗后6个月再次进行。在对于每组的前3名对象的第57天的结果可获得后，进行中间安全性分析。基于这些数据，以可达5x105CFU的剂量施用VPM1002被认为是安全并可以被良好耐受的。基于免疫原性的第二研究終点，对于样本大小进行了统计学重新评估。该分析结果(Pl=0.0119)显示在本研究中包括的80个对象的计划样本是充足的。增加样本大小并无必要。4.对象数量40位未免疫BCG的对象与40位预先免疫过BCG (或PPD阳性)的对象被纳入本研究。所有80名对象，除了 I名失去跟踪以外，全部按计划完成了研究。
权利要求
1.人用疫苗，其包含作为活性成分的重组分枝杆菌，所述重组分枝杆菌为脲酶缺陷型并包含编码融合多肽的重组核酸分子，所述融合多肽包含(a)分枝杆菌抗原或其免疫原性片段和(b)吞噬溶酶体逃逸结构域。
2.权利要求1的疫苗，其中所述重组 分枝杆菌细胞为重组牛分枝杆菌(BCG)细胞，特别是来自丹麦株布拉格亚型的重组牛分枝杆菌细胞。
3.权利要求1或2的疫苗，其中所述分枝杆菌抗原是Ag85B。
4.权利要求1-3任一项的疫苗，其中所述重组分枝杆菌细胞携带抗生素抗性基因，例如潮霉素抗性基因。
5.权利要求1-3任一项的疫苗，其中所述重组分枝杆菌细胞不携带抗生素抗性基因。
6.权利要求1-3 任一项的疫苗，其为 rBCG AUrec::Hly+::Hyg+ (VPM1002)。
7.权利要求1-6任一项的疫苗，其施用于未免疫分枝杆菌的对象，例如新生儿。
8.权利要求1-6任一项的疫苗，其施用于预先暴露于分枝杆菌的对象。
9.权利要求1-8任一项的疫苗，其为冻干物，任选地与重构液一起。
10.权利要求1-9任一项的疫苗，其包含约IO3-1O4CFUj^JIO4-1O5CFU或约IO5-1O6CFU的剂量。
11.权利要求1-10任一项的疫苗,其用于皮内施用。
12.权利要求1-11任一项的疫苗，用于单剂量或多剂量施用。
13.权利要求1-12任一项的疫苗，其用于上调多功能⑶4+T细胞。
14.权利要求1-13任一项的疫苗，其用于抗结核。
15.接种人对象的方法，其包括施用药学有效剂量的重组分枝杆菌，所述重组分枝杆菌为脲酶缺陷型并包含编码融合多肽的重组核酸分子，所述融合多肽包含(a)分枝杆菌抗原或其免疫原性片段和(b)吞噬溶酶体逃逸结构域。
全文摘要
本发明涉及在人对象中提供保护性免疫、特别是针对结核的保护性免疫的重组疫苗。
文档编号A61K39/04GK103118703SQ201180045082
公开日2013年5月22日 申请日期2011年9月16日 优先权日2010年9月20日
发明者L·格罗德 申请人:疫苗项目管理有限公司