专利名称：真菌环氧二烯烟酸类衍生物在制备促炎介质抑制剂的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及真菌环氧二烯烟酸类衍生物4-NDM(缩写为4NDM)，尤其是涉及真菌环氧二烯烟酸类衍生物在制备促炎介质抑制剂的应用。
背景技术：
炎症反应是机体免疫系统的重要组成部分之一，机体通过多种途径对其进行精密的调控。但当炎症反应不可控时，会导致机体多种疾病，如类风湿性关节炎 (rtheumatoid arthriti)、炎症性肠病(Inflammatory bowel disease, IBD)、神经退化性疾病(neurodegenerative disorder)及胺毒性休克(septic shock syndrome)等等， 长期的炎症反应刺激还会诱发机体癌变，这些都严重威胁着人们的身心健康(I、Monaco, et al. , Curr Drug Targets Inflamm Allergy, 2004, 3, 35-42 ;2、Schwartsburd et al., Cancer Metastasis Rev，2003，22，95-102)，因此对机体过激的炎症反应进行有效控制是目前开发治疗这些疾病药物的主要方向。研究表明，上述疾病中的炎症反应虽然所表现的症状不同，但是介导这些炎症反应的因子或介质是相同的，如肿瘤坏死因子- a (Tumor necrosis factor alpha, TNF-a )、白细胞介素-I (Interleukin-lbeta, IL-1 P )、白细胞介素-6(IL_6)等。一氧化氮(NO)、自由基(free radicals)等毒性分子在炎症反应中可被诱导表达，从而加剧机体的炎症程度(3、Heller et al.，Proc Natl Acad Sci USA, 1997, 94,2150-2155 ；4,Feldmann et al. ,Nat Med，2003，9，1245-1250)，因此对这些炎症因子进行抑制将有助于改善机体的炎症反应。目前，卩引哚美辛(indometacin)、阿司匹林(aspirin)等非类固醇类抗炎药物 (Non-steroidal anti-inflammatory drugs, NSAIDs)已经广泛地用于治疗类风湿性关节炎等炎症相关的疾病(5,Day et al. ,Med J Aust，1988，148，195-199)，但是所用的NSAIDs 一般都具有副作用，长期服用后会导致胃肠损伤及肾功能不正常等症状(6、LiChtenberger et al.，Nat Med, 1995,1,154-158 ;7、Fernandez et al.，Nat Med, 1995,1,602-603)。因此，需要进一步寻找有效抑制炎症反应的化合物，为以后开发低副作用的抗炎药物提供新的思路。真菌环氧二烯(Mycoepoxydiene, MED)为厦门大学生命科学学院海洋微生物药物课题组于2002年从海洋微生物中分离得到。4NDM是以Mycoepoxydiene为先导化合物,利用靶向对接技术，定向设计抑制Hsp90的MED衍生物，并采用荧光滴定的方法，结合表面等离子体增强(SPR)等技术，结果表明，4NDM与Hsp90的亲和力比MED与Hsp90的亲和力高约100倍。经前期研究发现，4NDM具有较好的抗肿瘤活性。MTT法体外检测抗肿瘤活性得到其对于HeLa细胞株的IC50为4. 7 y M(8、张连茹，易玉婷，陈俊杰等，基于抗肿瘤活性化合物MED烟酸类衍生物的设计及作用靶点[D]，厦门:厦门大学学报，2010，31 (6) 1184-1189 ； 9、沈月毛，张伟，张连茹等，真菌环氧二烯烟酸衍生物4-NDM及其合成方法与用途，中国专利号ZL201010150471. 2)，但未报道其具有抗炎症生理活性。所述4NDM是以Mycoepoxydiene为先导化合物,设计并合成的烟酰胺类衍生物。
发明内容
本发明的目的在于提供真菌环氧二烯烟酸类衍生物在制备促炎介质抑制剂的应用，特别是真菌环氧二烯烟酸类衍生物在制备治疗内毒素休克等由炎症因子介导的炎症性疾病药物中的应用。本发明所述真菌环氧二烯烟酸衍生物为6-[(11 ，65，71 ，85)-8-甲基_9_氧杂双环 [4，2，I]九-2，4- 二烯-7-基]-5-(吡啶-4-氧基)-5,6- 二氢-2H-吡喃-2-酮，简称为 4NDM，其分子式为C19H19NO4，结构式为所述真菌环氧二烯烟酸衍生物为白色针状晶体，易溶于甲醇、丙酮、二甲基亚砜等有机溶剂中。经药理实验证实，所述真菌环氧二烯烟酸衍生物能有效地抑制炎症因子如肿瘤坏死因子(TNF-CI)、白细胞介素6(IL-6)和一氧化氮(NO)的表达。所述真菌环氧二烯烟酸类衍生物可用于制备促炎介质抑制剂，特别是真菌环氧二烯烟酸类衍生物可用于制备治疗内毒素休克等由炎症因子介导的炎症性疾病药物。所述炎症性疾病包括风湿性关节炎、炎症性肠病、神经退化性疾病、脓毒性休克
坐寸O
图I为MTT法检测4NDM对RAW264. 7细胞的细胞毒性。在图I中，横坐标为4NDM 浓度梯度(nmol/L)，纵坐标为595nm的吸光度值(595nm) ;MTT法实验结果表明，4NDM对 RAW264. 7细胞不具有细胞毒性；图中4NDM浓度为0的组为DMSO空白对照组。图2为MTT法检测在细菌脂多糖刺激下4NDM对RAW264. 7细胞的细胞毒性。在图 2中，横坐标为4NDM浓度梯度(nmol/L)，纵坐标为595nm的吸光度值(595nm) ；MTT法实验结果表明，在细菌脂多糖刺激下4NDM对RAW264. 7细胞不具有细胞毒性；图中4NDM浓度为 0的组为DMSO空白对照组，LPS浓度均为为100ng/mL。图3为4NDM对经细菌脂多糖刺激的RAW264. 7细胞中前炎症因子TNF- a表达的影响图。在图3中，横坐标为4NDM浓度(nmol/L)，纵坐标为前炎症因子TNF-a (pg/ml)。图4为4NDM对经细菌脂多糖刺激的RAW264. 7细胞中前炎症因子IL-6表达的影响图。在图4中，横坐标为4NDM浓度(nmol/L)，纵坐标为前炎症因子IL_6 (pg/ml)。图5为4NDM对经细菌脂多糖刺激的RAW264. 7细胞中前炎症因子IL-I ^表达的影响图。在图5中，横坐标为4NDM浓度(nmol/L)，纵坐标为前炎症因子IL-I ^ (pg/ml)。图6为4NDM对不同浓度细菌脂多糖刺激的RAW264. 7细胞中促炎症介质TNF-a表达的影响。在图6中，横坐标为细菌脂多糖的浓度梯度(ng/ml)，纵坐标为TNF-a的浓度 (pg/ml)。图7为4NDM对不同浓度细菌脂多糖刺激的RAW264. 7细胞中促炎症介质IL-6表达的影响。在图7中，横坐标为细菌脂多糖的浓度梯度(ng/ml)，纵坐标为IL-6的浓度(pg/ ml) o图8为4NDM对不同浓度细菌脂多糖刺激的RAW264. 7细胞中促炎症介质IL-I ^ 表达的影响。在图8中，横坐标为细菌脂多糖的浓度梯度(ng/ml)，纵坐标为IL-I ^的浓度 (pg/ml)。图9为4NDM对经细菌脂多糖刺激的RAW264. 7细胞中NO表达的影响。在图9中， 横坐标为4NDM的浓度梯度(y mol/L)，纵坐标为NO的浓度(y mol/L)。
具体实施例方式下面结合具体实例进一步阐述本发明。实施例I 4NDM细胞毒性试验采用MTT法检测去乙酰真菌环氧乙酯的细胞毒性，具体步骤如下将RAW264. 7细胞(4 X IO5个细胞/孔)接入96孔培养板培养过夜，加入细菌脂多糖(lipopoIysaccharide, LPS) (100ng/ml)及不同浓度的 4NDM(0. 1、2. 5、5、7. 5、10、12、 151111101/1，用01^0作为空白对照)共同作用24h或不同浓度的4NDM(0. 1、2. 5、5、7. 5、10、 12、15 u mol/L，用DMSO作为空白对照)单独作用24h，然后加入MTT至终浓度0. 5mg/ml作用3h，按IOOu I/孔加入溶解液(10% SDS, 0. 01mol/L HCL)过夜后测定OD5950OD595可反映细胞的生长情况，因此通过比较OD595值来判断4NDM是否存在细胞毒性。MTT法检测结果表明(参见图1、2) 4NDM在0 15 ii mol/L浓度条件下对 RAW264. 7细胞很可能不具有细胞毒性。实施例2 4NDM在抑制细菌脂多糖诱导的RAW264. 7细胞炎症反应中的应用通过检测细胞前炎症因子的浓度变化，从而判明4NDM是否可以抑制RAW264. 7细胞炎症反应。具体试验方法如下I)设置4NDM浓度梯度。将RAW264. 7细胞(4 X IO5细胞/mL)接入12孔培养板，24h后换液一次，l-2h后加入LPS至终浓度为100ng/ml刺激6h，同时加入不同浓度的4NDM (0、0. I、I、5、10 ii mol/L，用DMSO作为空白对照)，观察4NDM对LPS刺激前炎症因子表达的影响，提取细胞培养上清液做酶联免疫吸附检测。通过ELISA检测试剂盒 (购自 eBioscience 公司，Mouse TNF-a (Cat# :88-7324-88, Lot# :E09483_1334)、Mouse IL-6 (Cat# :88-7064-88, Lot# E09362-1631)和 Mouse IL-I ^ (Cat# 14-7012-68A, Lot# E12434-1632)试剂盒各一个，)检测3种前炎症介质的浓度细胞培养上清液中的肿瘤坏死因子-a (TNF-a)和白介素_6 (IL_6)、细胞裂解液中的IL_1 3。细胞裂解液配方为0. I % triton X-100，ImmoI/L DTT,50mmol/L Tris-HCl(pH8. 0)。现将eBioscience公司ELISA检测试剂盒检测方法列举如下。(I)包被固定相抗体。使用Corning Costar 9018ELISA酶标板,用包被缓冲液以1/250的比例稀释固相抗体，混合摇匀后加入IOOii L/孔，将酶标板置于4°C过夜反应。(2)清洗。弃去孔内溶液，用清洗缓冲液清洗5次，每次间隔lmin，每次每孔洗液不少于250 y L，弃去洗液后轻轻在吸水纸上敲打以增加清洗效果。(3)封闭。将5X的实验稀释液稀释至IX后，按200 ii L/孔加入酶标板，室温静直反应Ih0(4)清洗。同步骤⑵，重复清洗至少5次。(5)加入适当抗原。使用IX实验稀释液，稀释阳性标准品，阳性标准品IOOy L/孔， 每个浓度做两个平行以保证其准确和可靠。加入稀释好的抗原样品(100 i! L/孔)至相应的孔中，盖上盖子置于室温静置反应2h或置于4°C过夜以便使抗原抗体达到最大结合度。(6)清洗。同步骤⑵，重复清洗至少5次。(7)加入检测抗体。使用IX实验稀释液以1/250的比例稀释检测抗体，混合摇匀后加入100 Ii L/孔,置于室温静置反应lh。(8)清洗。同步骤⑵，重复清洗至少5次。(9)加入酶标抗体。使用IX实验稀释液以1/250的比例稀释酶标抗体，混合摇匀后加入100 Ii L/孔,置于室温静置反应30min。(10)清洗。同步骤(2)，在此次清洗步骤中，应当间隔l_2min清洗一次，且重复清洗至少7次。(11)加入反应底物。每孔加入底物溶液100 U L，于室温静置反应15min。(12)每孔加入终止液50 u L，终体积150 U L，终止反应。(13)将酶标板置于酶标仪450nm处测量其最大吸光值(OD)，并数据分析。2)LPS浓度梯度。将RAW264. 7细胞(4X105细胞/mL)接入12孔培养板，24h 后换液一次，l-2h后加入LPS至终浓度为100、1000、10000ng/ml刺激6h，同时加终浓度为10 ii mol/L的4NDM，观察4NDM对不同浓度的LPS刺激前炎症因子表达的影响，提取细胞培养上清液做酶联免疫吸附检测。通过ELISA检测试剂盒(购自eBioscience公司， Mouse TNF-a (Cat# :88-7324-88, Lot# :E09483_1334)、Mouse IL-6(Cat# :88-7064-88, Lot# E09362-1631)和 Mouse IL-1 ^ (Cat# 14-7012-68A, Lot# :E12434_1632)试剂盒各一个，)检测3种前炎症介质的浓度细胞培养上清液中的肿瘤坏死因子-a (TNF-a )和白介素-6(IL-6)、细胞裂解液中的IL-I ^。3)将RAW264. 7细胞(4X105细胞/mL)接入96孔培养板培养过夜，然后加入 LPS(100ng/ml)及不同浓度的 4NDM(0. 1,2. 5、5、7. 5、10、12、15 y mol/L，用 DMSO 作为空白对照)刺激24h，收集细胞培养上清液，通过Griess方法(硝酸还原酶法)检测一氧化氮(NO) 的含量。4冊11对经细菌脂多糖刺激的狀1264.7细胞中前炎症因子丁即-0表达的影响图参见图3。在图3中，4NDM在0. l、ly mol/L浓度下对经细菌脂多糖刺激的RAW264. 7细胞中前炎症因子TNF-a的表达具有明显的抑制作用；4NDM浓度为0的组为DMSO空白对照组， 其他浓度组分别与DMSO组进行t检验；**表示p < 0. 01。4NDM对经细菌脂多糖刺激的RAW264. 7细胞中前炎症因子IL_6表达的影响图参见图4，在图4中，4NDM在3、5、10iinmol/L浓度下对经细菌脂多糖刺激的RAW264. 7细胞中前炎症因子IL-6的表达具有明显的抑制作用；4NDM浓度为0的组为DMSO空白对照组，其他浓度组分别与DMSO组进行t检验；***表示p < 0. 01。4NDM对经细菌脂多糖刺激的RAW264. 7细胞中前炎症因子IL_1 ^表达的影响图参见图5，在图5中，4NDM在l、5iimol/L浓度下对经细菌脂多糖刺激的RAW264. 7细胞中前炎症因子IL-I P的表达具有明显的抑制作用；4NDM浓度为0的组为DMSO空白对照组，其他浓度组分别与DMSO组进行t检验；***表示p < 0. 01。4NDM对不同浓度细菌脂多糖刺激的RAW264. 7细胞中促炎症介质TNF-a表达的影响参见图6，在图6中，4NDM在IOii mol/L浓度下对经不同浓度的细菌脂多糖刺激的RAW264. 7细胞中促炎症介质TNF-a表达具有明显的抑制作用。图中LPS组分别与 LPS+4NDM 组进行 t 检验，4NDM 浓度为 10 y mol/L 为 LPS，^■为 LPS+4NDM。4NDM对不同浓度细菌脂多糖刺激的RAW264. 7细胞中促炎症介质IL-6表达的影响参见图7，在图7中，4NDM在I Oii mo I/L浓度下对经不同浓度的细菌脂多糖刺激的RAW264. 7 细胞中促炎症介质IL-6表达具有明显的抑制作用。图中LPS组分别与LPS+4NDM组进行t 检验，4NDM 浓度为 10 u mol/L 表示 p < 0. 05 ;|ZZI为 LPS，^为 LPS+4NDM。4NDM对不同浓度细菌脂多糖刺激的RAW264. 7细胞中促炎症介质IL-IP表达的影响参见图8，在图8中，4NDM在IOii mol/L浓度下对经不同浓度的细菌脂多糖刺激的RAW264. 7细胞中促炎症介质IL-IP表达具有明显的抑制作用。图中LPS组分别与 LPS+4NDM 组进行 t 检验，4NDM 浓度为 10 y mol/L 为 LPS，^■为 LPS+4NDM。4NDM对经细菌脂多糖刺激的RAW264. 7细胞中NO表达的影响参见图9，在图9中， 4NDM在1、5 ii mol/L浓度下对经细菌脂多糖刺激的RAW264. 7细胞中NO的表达具有明显的抑制作用；图中4NDM浓度为0的组为DMSO空白对照组，其他浓度组分别与DMSO组进行t 检验；***表示p < 0. 01。实验结果(参见图3 9)表明4NDM可抑制细菌脂多糖诱导的RAW264. 7细胞的炎症反应。4NDM在制备治疗风湿性关节炎、炎症性肠病、神经退化性疾病和脓毒性休克等由促炎症因子介导的炎症性疾病药物中的具有广泛的应用。
权利要求
1.真菌环氧二烯烟酸类衍生物在制备促炎介质抑制剂的应用，所述真菌环氧二烯烟酸衍生物为6-[(11 ，65，71 ，85)-8-甲基 _9_ 氧杂双环[4，2，I]九 _2，4-二烯-7-基]-5-(批啶-4-氧基)-5，6- 二氢-2H-吡喃-2-酮，简称为4NDM，其分子式为C19H19NO4,结构式为
2.如权利要求I所述的真菌环氧二烯烟酸类衍生物在制备治疗内毒素休克由炎症因子介导的炎症性疾病药物中的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述炎症性疾病包括风湿性关节炎、炎症性肠病、神经退化性疾病、脓毒性休克。
全文摘要
真菌环氧二烯烟酸类衍生物在制备促炎介质抑制剂的应用，涉及真菌环氧二烯烟酸类衍生物4-NDM。提供真菌环氧二烯烟酸类衍生物在制备促炎介质抑制剂的应用，特别是真菌环氧二烯烟酸类衍生物在制备治疗内毒素休克等由炎症因子介导的炎症性疾病药物中的应用。所述真菌环氧二烯烟酸衍生物的分子式为C19H19NO4。经药理实验证实，所述真菌环氧二烯烟酸衍生物能有效地抑制炎症因子如肿瘤坏死因子(TNF-α)、白细胞介素6(IL-6)和一氧化氮(NO)的表达。所述真菌环氧二烯烟酸类衍生物可用于制备促炎介质抑制剂，特别是真菌环氧二烯烟酸类衍生物可用于制备治疗内毒素休克等由炎症因子介导的炎症性疾病药物。
文档编号A61K31/4433GK102579441SQ201210020358
公开日2012年7月18日 申请日期2012年1月29日 优先权日2012年1月29日
发明者孙艺飞, 宋思扬, 张连茹, 耿晶, 肖淑燕, 郑忠辉, 黄耀坚 申请人:厦门大学