专利名称：一种丹酚酸a冻干粉针及其制备药物用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种丹酚酸A冻干粉针及其制备药物用途。
背景技术：
脑血管病又称脑卒中，是由各种病因使供应脑部血液的血管发生病变所致的一种神经系统疾病。其主要病因为脑动脉系统病损(如脑动脉硬化)等原因导致的脑动脉管腔狭窄、血管痉挛、闭塞或破裂、血流减少或完全阻塞，脑部血液循环和功能障碍，脑组织受损而发生的一系列症状。主要包括缺血性和出血性脑血管病。其中(ICVD，又称缺血性卒中)占80 左右。缺血性脑血管病是指局部脑组织包括神经细胞、胶质细胞及联系纤维由于供血障碍发生的变性、坏死或一过性的功能丧失。血管内血栓形成、栓塞、血管狭窄导致的脑动脉阻塞是缺血性脑卒中的主要原因。缺血引起脑神经细胞损伤和死亡的作用机制多样、复杂，缺血性脑卒中(即脑缺血)后，由于脑部缺乏血液和氧气的供应，导致大脑能量代谢失衡，产生一系列病理性损伤，如氧化应激、兴奋性氨基酸毒性、钙超载、炎症反应等，从而导致神经元的大量死亡。它是临床上的常见病、多发病，死亡率及致残率很高，现已经成为世界公认的三大致死疾病之一。临床上治疗主要是溶栓、挽救缺血区域(半暗带)的濒临死亡的神经元和促进损伤后神经功能的恢复。防治缺血性脑血管疾病是目前人类迫切需要解决的医学难题。目前美固FDA仅批准了组织纤溶酶原活化因子(tPA)用于中风后的溶栓治疗，但其治疗时间窗很窄，只有在中风4.5小时内使用才有效；而且还存在出血以及缺血再灌加重脑损伤的危险性。而目前针对缺血性中风治疗的神经保护药包括钙通道阻断剂如尼莫地平、谷氨酸受体拮抗剂如地佐环平(DizocilPine)、抗氧化剂或自由基清除剂如依达拉奉、NO信号传导通路调节剂芦贝鲁哩(Lubeluzole)以及炎症抑制剂恩莫单抗(Enlimomab)等。但它们中有的治疗作用不确切或特异性不强，有的毒副作用较大、耐受性小，有的还处于临床前或临床研究阶段，很难在防治缺血性脑卒中发挥积极影响。因而，研发出快速有效、安全稳定的防治脑缺血药物迫在眉睫。在此领域中医药发挥了不可忽视的积极作用。丹酚酸A (Salvianolic acid A),又名丹酚酸甲，是唇形科植物丹参Salviamiltiorrhiza Bunge的干燥根及根莖中所含的一种水溶性酹酸类化合物,丹酹酸A对脑微血管栓塞有明显的药理作用，而且作用优于丹酚酸B (张恒艾.丹酚酸A对脑微血管栓塞大鼠的影响及机制研究[D].北京:北京协和医学院研究生院，2011〕，丹酚酸A是由丹参素和咖啡酸缩合而成，含有多个酚羟基、羟基、酯键等活泼基团，其对光和热不稳定，暴露空气易氧化成丹酚酸C和异丹酚酸C等，由于丹酚酸A的上述理化特性，制成丹酚酸A注射齐IJ，其稳定性成为制成注射剂的关键技术。但是，有关丹酚酸A制剂特别是注射剂研究文献资料不多，并且普遍存在注射剂不稳定性的问题，无法保证丹酚酸A药理作用。
发明内容
为克服现有技术存在的上述缺陷，本发明提供了一种丹酚酸A冻干粉针，进一步地，也提供了其用于预防和或治疗缺血性脑血管病方面的用途。本发明提供一种丹酚酸A冻干粉针，所述丹酚酸A冻干粉针包括含丹酚酸A主份原料，填充剂和抗氧剂；其中所述冻干粉针的各成份按下列重量配比制成:含丹酚酸A主份原料IOg 80g，填充剂IOg 80g，抗氧剂为制成总量的0.01% 0.2%，其中所述填充剂为甘露醇、葡萄糖、乳糖中的任意一种或几种，所述抗氧剂选自维生素C、硫脲、亚硫酸氢钠、焦亚硫酸钠中的任意一种或几种，其中所述含丹酚酸A主份原料中丹酚酸A含量大于93%，小于100%，还包括4个其他成分:紫草酸0.1% 2%，迷迭香酸0.1% 2%，丹酚酸B0.1 % 2 %，丹酚酸C0.1 % 2 %，所述丹酚酸A冻干粉针采用下制备方法获得:取丹参药材，切成饮片或粉碎成直径约Imm 5mm颗粒，每次加3 15倍量、45 95 0C水温浸提取，同时以10 50转/分速度搅拌，或加3 15倍量水煎煮提取，共提取I 3次，每次提取I 4小时；提取液减压浓缩至相对密度1.0 1.25 (600C )，加入乙醇使含醇量在50% 85%，静置，滤过，滤液减压回收乙醇并浓缩至无醇味，得丹参提取液；或者取丹参药材，切成饮片或粉碎成直径约Imm 5mm颗粒，每次加3 15倍量30% 60%乙醇回流提取，每次提取I 4小时，共提取I 3次；减压回收乙醇并浓缩至无醇味，得丹参提取液；上述丹参提取液加水稀释至每Iml含丹酚酸BI 30mg，水溶液用碱调pH至3.5 6.5，加入与丹酚酸B摩尔百分比0.1 3%氯化锌作为催化剂，在100 140°C温度加热转化I 6小时；转化液调pH值至2.5 4.5，静置、离心，上清液减压浓缩至每Iml含丹酚酸Al 10mg，经HPD-100大孔树脂柱层析分离，丹酚酸A上样量与大孔吸附树脂比为1: 35 I: 70，树脂柱径高比为1: 4 1: 30，分别用I 8倍柱体积水、I 10倍柱体积10% 40%乙醇洗脱，除去杂质，再用2 10倍柱体积20% 60%乙醇洗脱，HPLC检测，收集含有丹酚酸A的20% 60%乙醇洗脱部分，减压回收乙醇并浓缩至无醇味；水溶液浓缩至每Iml含1-1Omg丹酚酸A的溶液，通过聚酰胺层析柱分离，丹酚酸A上样量与聚酰胺比为1: 5 1: 25，树脂柱径高比为1: 4 1: 25，分别用I 10倍柱体积水、5 20倍柱体积20% 60%乙醇溶液洗脱除杂，再用4 15倍柱体积40% 90%乙醇溶液洗脱，收集含有丹酚酸A的40% 90%乙醇溶液部分，减压回收乙醇并浓缩至无醇味水溶液；水溶液浓缩，调酸pH至2.0 4.0，用水溶液1_8倍量的叔丁基甲基醚，分2 6次萃取，分离有机层，减压回收叔丁基甲基醚，制成每Iml含丹酹酸Alg IOg的萃取液,力口入I 3倍量硅胶，搅拌，挥干；把搅拌样硅胶加到已装好的5 20倍量干硅胶柱上，硅胶柱径高比为1: 4
I: 25，以正戊烷-叔丁基甲基醚为洗脱剂，梯度洗脱，分别用正戊烷-叔丁基甲基醚(4: 6)洗脱6 30倍柱体积，正戊烷-叔丁基甲基醚出:4)洗脱6 30倍柱体积，减压回收洗脱剂，回收有机溶剂后的丹酚酸A加5 20倍量水溶解，微波真空干燥，得所述含丹酚酸A主份原料，取含丹酚酸A主份原 料IOg 80g加注射用水1500 2800ml搅拌使溶解，用碱调pH值4.0 5.0，再加入所述填充剂使其溶解，再加入所述抗氧剂，搅拌使溶解混匀，再加入活性炭0.5 2g搅拌吸附，滤过除去活性炭，加注射用水灌装成瓶，送入冻干机再进行冷冻干燥，其中所述冷冻干燥包括如下步骤:A、冷冻:以20°C 30 V /h速度降温至-40 V -45 V，保温冷冻10 16小时；B、升华:抽真空至0.3mbar以下，在10 14小时内将冻结的丹酚酸A丹酚酸A制剂温度上升到_23°C _27°C，维持-23°C -27°C真空干燥6 8小时；C、干燥:继续升温，以0.5°C 1.(TC /min均匀升温至40°C 45°C，维持40°C 45°C干燥2 5小时后，将样品温度降至室温，加盖，即得丹酚酸A冻干粉针。优选的，其中所述冻干粉针的各成份按下列重量配比制成:含丹酚酸A主份原料20g 60g，填充剂20g 60g，抗氧剂为制成总量的0.02 % 0.1 %，其中所述含丹酚酸A主份原料中:丹酚酸A94% 97%，紫草酸0.20Z0 1.5%，迷迭香酸0.20Z0 1.5%，丹酚酸B0.2% 1.5%，丹酚酸 C0.4% 2.0%。优选的，其中所述填充剂用量为20mg 40mg/2ml 3ml。优选的，微波真空干燥温度:20-100°C，回差温度1_5°C，真空度-0.07Mpa以上，微波功率1-100KW，干燥10-200分钟。优选的，微波真空干燥温度:50-85°C，回差温度2-4°C，真空度-0.07Mpa以上，微波功率10-80KW，干燥100-150分钟。优选的，微波真空干燥温度:55-80°C，回差温度2-3°C，真空度-0.07Mpa以上，微波功率25-60KW，干燥120-140分钟。`再一方面，本发明还提供了所述的丹酚酸A冻干粉针用于制备预防和/或治疗缺血性脑血管病药物的的用途。优选的，其中所述缺血性脑血管病主要包括脑血栓、脑缺血再灌注损伤、脑栓塞、颅外颈动脉和脑基底动脉的粥样硬化或狭窄、腔隙性脑梗塞、短暂性脑缺血性发作、血管性痴呆中的任意一种或几种。优选的，其中所述丹酚酸A冻干粉针用于改善脑缺血后的神经功能的用途。优选的，其中所述丹酚酸A冻干粉针用于保护缺血脑组织损伤的用途。优选的，其中所述丹酚酸A冻干粉针用于保护血脑屏障的用途。优选的，其中所述丹酚酸A冻干粉针用于减少缺血脑组织梗死范围的用途。优选的，其中所述丹酚酸A冻干粉针用于减轻缺血脑组织水肿的用途。优选的，其中所述的丹酚酸A冻干粉针用于挽救缺血半暗带的用途。优选的，其中所述丹酚酸A冻干粉针用于促进脑部血管的新生和侧枝循环的建立的用途。优选的，其中所述丹酚酸A冻干粉针用于增加脑组织微血管密度的用途。优选的，其中所述丹酚酸A冻干粉针用于促进血管内皮生长因子表达的用途。优选的，其中所述丹酚酸A冻干粉针用于促进碱性成纤维细胞生长因子蛋白表达的用途。优选的，其中所述丹酚酸A冻干粉针用于增加缺血半暗带脑血流量用途。优选的，其中所述丹酚酸A冻干粉针用于改善脑组织能量代谢用途。优选的，其中所述丹酚酸A冻干粉针用于抑制缺血后脑组织神经元损伤或死亡的用途。
优选的，其中所述丹酚酸A冻干粉针用于抑制脑组织神经细胞凋亡的用途。优选的，其中所述丹酚酸A冻干粉针用于增强脑组织内源性神经营养因子表达的用途。优选的，其中所述丹酚酸A冻干粉针用于抑制脑组织炎症损伤的用途。优选的，其中所述丹酚酸A冻干粉针用于抑制脑组织神经细胞内Ca2+超载的用途。优选的，其中所述丹酚酸A冻干粉针用于改善脑组织内单胺类神经递质紊乱的用途。优选的，其中所述丹酚酸A冻干粉针用于抑制脑组织兴奋性氨基酸毒性的用途。优选的，其中所述丹酚酸A冻干粉针用于抑制脑组织氧自由基损伤的用途。优选的，其中所述丹酚酸A冻干粉针用于保护脑血管内皮细胞的用途。优选的，其中所述丹酚酸A冻干粉针用于保护脑微血管内皮细胞损伤的用途。优选的，其中所述丹酚酸A冻干粉针用于预防和/或治疗脑血栓的用途。优选的，其中所述丹酚酸A冻干粉针用于抑制血栓形成的用途。优选的，其中所述丹酚酸A冻干粉针用于溶解血栓的用途。优选的，其中所述丹酚酸A冻干粉针用于改善血液流变学的用途。本发明提供的丹酚酸A冻干粉针主药是丹酚酸A主份原料，本发明通过对丹参的提取、转化、纯化、干燥工艺，得到了以丹酚酸A为主的主份原料:经过系统的筛选和优化，首先比较确定了起始原料丹酚酸B的提取溶剂和提取方法，由于丹酚酸B水溶性较好，确定了采用水提取或低浓度醇提取，又由于丹酚酸B热稳定性较差，确定了采用热水温浸提取并加搅拌提取方法，或用低浓度乙醇回流提取，使提取溶度低于100°C，保持丹酚酸B不被破坏，通过正交实验确定了最佳溶剂用量和提取时间，得到了适应工业化生产的丹酚酸B最佳提取工艺的。本发明与现有技术对比表明:起始原料用丹参药材直接提取即可进行投料转化，不需对丹酚酸B进行纯化后再进行转化，即本发明催化转化反应中，反应原料丹酚酸B不需要高纯度，例如不需要丹酚酸B的纯度> 50%。一般认为反应原料越纯越好，然而，本发明的催化转化反应中，丹酚酸B的纯度高低对转化反应效果没有影响。相反，丹酚酸B纯度>50%时不但产生大量杂质，且没有提高转化率，因此，本发明取得了预料不到的技术效果。
再者，本发明通过反复实验比较，首先确定了对丹酚酸A主份原料产率产生重要影响的因素如转化前丹酚酸类化合物的浓度、PH值、温度、时间等。在此基础上，又通过付出大最的时间、物质和精力反复实验对温度、PH值、时间、丹酚酸B的的浓度及其他相关条件进行了研究，以及这些因素彼此之间如何协同作用共同对丹酚酸A主份原料产率产生影响，从而确定了丹酚酸B转化丹酚酸A的需要控制的最佳温度、pH值、时间等，并将丹酚酸B起始浓度控制在lmg/ml 30mg/ml,从而使得本发明丹酹酸A转化率更加明显优于其他转化条件。化学反应中，反应物的纯度与浓度常常影响反应的效果。一般情况下对反应物有浓度要求，且认为浓度高比浓度低好。本发明的催化转化反应中，丹酚酸B的浓度常低对转化反应效果没有影响。相反，可能是由于高温转化的原因，丹酚酸B纯度高不但产生大量杂质，且没有提高转化率。而且含丹酚酸B水溶液中丹酚酸B的浓度并非越高越好，30mg/ml以上浓度转化率反而低，效果更差。因此，本发明在节约成本和生产周期方面，取得了预料不到的技术效果，具有创造性。在现有技术没有给出任何技术启示的情况下，本领域技术人员如果仅从理论上推断，是不可能得出在上述各条件参数下将丹酸B转化成丹酚酸A主份原料具有更好的转化效果的结论。更为重要的是，本发明通过创造性的劳动，发现氯化锌作为催化剂能显著提高丹酚酸B转化丹酚酸A主份原料的转化率，转化率非常稳定的能达到接近60 %，多数情况都可以超过60%，这在以往任何一项现有技术中都是不可能的，因此，取得了预料不到的技术效
果O由于丹酚酸A含量较低，经转化后丹酚酸A含量大提高，但还含大量杂质，因此，分别选择了弱极性和非极性大孔吸附树脂进行粗分离，再选择聚酰胺、溶剂萃取、硅胶分离，并对不同流份进行测定，去除杂质部分后，将丹酚酸A主份原料中的丹酚酸A含量从10%左右提高到80%，至90%，至93%，至96%。进一步，在显著提高转化率的同时，本发明通过适于实际产业应用的纯化步骤，尤其是通过一系列的分离、洗脱处理等步骤后，没有采用传统的常压干燥，并从真空干燥、喷雾干燥、微波真空干燥方法中优选了微波真空干燥，从而彻底克服了以往干燥温度过高，干燥时间过长及对丹酚酸A的破坏大的缺陷；而冷冻干燥时间过长，成本极高且冷冻干燥所得的提取物无法完全去除溶剂残留问题。另外，本发明还可以将低浓度与高浓度的丹酚酸B混合，只需配成合适的起始转化浓度即可，同样可以达到转化成丹酚酸A主份原料的目的。因此，这种转化原料的制备工艺非常简单，生产成本降低的同时也非常适于实际产业中的应用。丹酚酸A主份原料除 含主要成分丹酚酸A之外，还含少量丹酚酸B、紫草酸、迷迭香酸、丹酚酸C ;丹酚酸A通过清除自由基，减轻膜脂质过氧化引起的流动性和通透性变化，阻止离子的异常通透和酶的漏出，从而降低了脑缺血再灌注而引起的损伤，对脑缺血有保护作用。丹酚酸A可剂量依赖性地抑制腺苷二磷酸(ADP)、凝血酶、花生四烯酸、胶原或U46619诱导的血小板聚集，降低血小板中cAMP水平，以及减少ADP引起的血小板P选择素的表达和纤维蛋白原结合，从而阻止ADP引起的血小板白细胞聚集，对动脉粥样硬化及栓塞形成有防治作用；丹酚酸A改善大鼠大脑中动脉阻塞模型大鼠神经功能缺陷状态，缩小梗塞面积，减轻脑水肿，降低相关脑区神经元损伤程度，对脑缺血损伤有保护作用，对学习记忆损伤的保护作用。丹酚酸A主份原料中的丹酚酸B是丹参及其制剂丹参注射液、香丹注射液的主要有效成分，与丹酚酸A —样对脑缺血有保护作用，对动脉粥样硬化及栓塞形成有防治作用；对脑缺血损伤有保护作用，紫草酸、迷迭香酸、丹酚酸C作用与丹酚酸A类同，均有较强的抗氧化作用，能清除氧自由基，抑制脂质过氧化反应，其作用强度高于维生素C、维生素E，是目前已知的抗氧化作用最强的天然产物之一，明显抑制ADP、花生四烯酸、胶原诱导的家兔血小板的聚集反应，及抑制血栓形成的作用，并能延长缺氧条件下动物的存活时间。能明显改善脑缺血再灌损伤大鼠的神经功能缺陷，改善行为障碍，明显缩小脑梗死面积，明显改善FeCl3所致的大鼠脑缺血造成的动物神经功能损伤，使其障碍的改善，并能缩小脑梗死面积；迷迭香酸还有助于防止自由基造成的细胞受损，因此降低了癌症和动脉硬化的风险。丹酚酸A主份原料中的紫草酸还有抑制血管平滑肌细胞的增殖和迁移，预防动脉粥样硬化、血管狭窄和血管内膜增生，具有扩血管作用。能抑制尿酸和过超氧阴离予自由基的形成、抑制过氧化物的产生，有消炎和降尿酸的作用。体外能抑制促黄体激素释放的作用。丹酚酸A主份原料中的丹酚酸C还通过抑制微管蛋白聚合诱导细胞有丝分裂阻滞从而诱导凋亡，具有抗肿瘤细胞增殖活性。丹酚酸A主份原料中的丹酚酸A、丹酚酸B、紫草酸、迷迭香酸、丹酚酸C组合后具有共同的对脑血管有保护作用、对动脉粥样硬化及栓塞形成有防治作用、对脑缺血损伤有保护作用，使其比丹酚酸A单体化合物单独使用作用更强，同时还有有消炎和降尿酸的作用、降低了癌症和动脉硬化的风险。本发明提供的丹酚酸A冻干粉针，是在上述制备丹酚酸A主份原料工艺基础上，根据丹酚酸A的化学与物理特性，从影响药物稳定的附加剂，剂型、容器、外界如空气、光线、水分，杂质等产生化学反应反而导致药剂的分解进行创造性的实验分析。通过筛选制剂处方，反复试验，选择了甘露醇、葡萄糖、乳糖等，制成冻干粉针，粉针成型良好，块状物疏松，孔隙、色泽均匀，并且稳定·性非常高，通过加入少量抗氧剂，解决了由于空气、光线、水分，杂质等产生化学反应导致的药物分解。将丹酚酸A制成合适的制剂，解决了丹酚酸A制成注射剂稳定性问题，通过选择合适的辅料与剂型，保证了丹酚酸A药理作用，为临床提供安全、有效的丹酚酸A注射制剂。我们根据丹酚酸A的理化特性，通过选择合适的剂型，筛选了不同的辅料，优选了不同的制备工艺及工艺参数，制备出了稳定、安全、有效、质量可控的丹酚酸A冻干粉针。本发明与现有技术对比表明:本发明通过创造性的劳动，最终确定了冻干速度降温速度及冷冻时间，升华时升温速度与温度，确定真空升华时间，明确了干燥升温速度和温度，及干燥时间；创造性的明确定了冷冻降温速度与温度、升华升温速度与温度干燥升温速度与温度及时间之间的复杂关系，以及适宜的数值范围的确定等，从而才最终获得了稳定的冻干粉针剂。重要的是，采用本发明制备方法制成的丹酚酸A冻干粉针完全可以不改变丹酚酸A原有的化学属性；制成的丹酚酸A冻干粉针组合物与丹酚酸A相比具有水溶性好、热稳定性高、复溶性好等特点。更为重要的是，本发明中的原料药丹酚酸A通过碱液将pH值调整到适合范围，再通过加入甘露醇等，使其更易于冷冻干燥，并且不影响药性，而且制成冻干粉针后主药丹酚酸A的含量有所提高，而丹酚酸B的含量有所降低，不会使制剂作用降低，反而会使制剂作用加强，起到了意想不到的效果。另一方面，本发明还提供了其用于预防和或治疗缺血性脑血管病方面的用途。经过实验数据对比可知，易卒中型肾血管性高血压大鼠大脑中动脉阻塞(MCAO)术后麻醉苏醒评分，模型组苏醒后(12h内)的神经行为评分(自发活动、四肢运动的对称性、前肢伸展爬行动作的对称性、爬笼壁、推躯干反应、触须对刺激的反应等)显著低于假手术组，说明脑血栓缺血后易卒中型肾血管性高血压大鼠(RHRSP)神经功能受损严重，且在持续的72h内，神经行为评分持续明显低于假手术组；尼莫地平组和丹酚酸A单体化合物组以及丹酚酸A冻干粉针各剂量组与模型组相比，大鼠苏醒后的神经行为有不同程度的升高，以丹酚酸A冻干粉针中、高剂量组最为明显，且其缺血后24h的神经行为已基本接近假手术组水平；至缺血后72h丹酚酸A冻干粉针各剂量组大鼠神经行为已恢复正常，且同剂量丹酚酸A冻干粉针组大鼠的整体状态比丹酚酸A单体化合物组恢复得快且稍好，神经行为有更优的趋势。提示丹酚酸A冻干粉针能改善RHRSP脑血栓缺血后神经行为，具有保扩及改善脑缺血后神经症状的作用，效果优于尼莫地平，且有优于同剂量丹酚酸A单体化合物的趋势。经过脑组织病理检查实验数据对比可知，假手术组脑组织双侧对称，未见病变，模型组血管内血栓附着严重。与模型组比较，镜下观察丹酚酸A冻干粉针各剂量组大鼠缺血侧大脑中动脉(MCA)局部血栓的长度缩短，在动脉壁附着面积减小，以高、中剂量组最为明显。TTC染色可见梗死脑组织呈白色，丹酚酸A冻干粉针各剂量组中被染成白色的脑组织范围比模型对照组显著缩小。HE染色可见模型组缺血侧皮层MCA供血区(以额顶皮质为中心)梗死灶内有明显的脑组织软化，细胞坏死，局部坏死组织脱落等现象，丹酚酸A冻干粉针高剂量组大鼠此处未见组织萎缩脱落现象；丹酚酸A冻干粉针各剂量组和模型对照组的HE染色显示灶内、灶周均有小血管增生，但是丹酚酸A冻干粉针各剂量组与模型组比较增生的小血管数目显著增多；另外，HE染色显示模型对照组可见大小不等的灶状出血，丹酚酸A冻干粉针高、中剂量组并无发现有灶状出血现象。结果影示丹酚酸A冻干粉针能明显改善RHRSP脑血栓缺血后脑组织病理状态，降低血栓附着面积、减少梗死面积，增加梗死区内及周围脑组织的小血管数、减少脑出血现象、从而保护脑组织坏死脱落，具有保护脑血栓缺血致脑组织损伤的作用，且优于丹酚酸A单体化合物。经过实验数据对比可知，脑血栓后脑组织血脑屏障破坏，通透性增加，伊文思蓝(EB)结合白蛋白可通过开放的血脑屏障(BBB)进入脑组织。丹酚酸A冻干粉针给药后，各剂量组大鼠脑组织显微镜下EB光斑数以及脑组织EB检出含量明显减少，且少于同剂最的丹酚酸A单体化合物组，与模型组比较均有显著差异，说明丹酚酸A冻干粉针对脑组织损伤致血脑屏障通透性增加具有抑制作用，能保护血脑屏障，而保护脑组织进一步受损伤，作用效果强于丹酚酸A单体化合物。经过实验数据对比可知，通过对RHRSP脑血栓大鼠模型组比较，假手术组未见梗死脑组织；丹酚酸A冻干粉针各剂量组脑组织梗死体积及脑含水量明显小于模型对照组，且剂量越大，梗死体积越小，脑含水量越少。丹酚酸A冻干粉针低、中、高剂量组梗死体积及脑含水量均低于尼莫地平组；且比同剂量的丹酚酸A单体化合物组要低。说明丹酚酸A冻干粉针可加速病灶的修复，减小RHRSP脑血栓后缺血脑组织梗死范围，减轻脑组织水肿，具有修复和保护缺血后脑组织损伤的作用，优于丹酚酸A单体化合物及尼莫地平。经过实验数据对比可知，与RHRSP脑血栓缺血模型组比较，缺血治疗后，丹酚酸A冻干粉针各剂量组脑组织缺血半暗带区MVD和血管场面积不同程度地显著增高，较尼莫地平和同剂量丹酚酸A单体化合物更为明显，且7d内比较稳定。表明丹酚酸A冻干粉针能增加脑组织缺血半暗带的MVD和血管场面积比，提示丹酚酸A冻干粉针有促进缺血脑组织微血管新生和侧枝循环建立的作用，且效果优于丹酚酸A单体化合物和尼莫地平。经过实验数据对比可知，RHRSP脑血栓缺血模型组血管内皮生长因子信使核糖核酸(VEGFmRNA)表达水平较假手术组有明显升高，说明脑组织缺血缺氧后能刺激脑组织内VEGF的表达增加，提示脑梗死后机体自身 会出现一种对抗缺血性损伤的保护性反应，使VEGF的表达增加，在缺血后出现自身“代偿性血管再生”。丹酚酸A冻干粉针各剂量组与模型组组比较，VEGFmRNA表达水平显著升高，表明丹酚酸A冻干粉针能显著促进缺血脑组织血管新生，促进侧枝循环代偿的建立，挽救缺血半暗带，保护缺血导致的脑组织损伤，且存在一定的量效关系，有优于同剂量丹酚酸A单体化合物的趋势。经过实验数据对比可知，RHRSP脑血栓缺血模型组大鼠脑组织碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)蛋白表达较假手术组有明显升高，但随缺血时间的延长，有下降的趋势，提示脑组织缺血缺氧后，机体自身产生短暂的保护应激反应，可刺激脑组织bFGF蛋白表达增力口。丹酚酸A冻干粉针各剂量组与模型组比较，各时间段的bFGF蛋白表达显著增高；各剂量组自身各时间段比较显示，bFGF蛋白表达持续稳定；提示丹酚酸A冻干粉针能增加缺血脑组织原发和继发bFGF蛋白表达，具有很好的神经细胞保护作用和促进血管生成的作用，有助于侧枝循环的建立，挽救缺血半暗带，且作用效果优于丹酚酸A单体化合物和尼莫地平。经过实验数据对比可知，丹酚酸A冻干粉针能减轻脑缺血再灌注损伤大鼠神经功能缺损症状，有利于其神经行为的恢复，丹酚酸A冻干粉针具有改善脑组织损伤后神经功能的作用，且作用效果比丹酚酸A单体化合物明显。经过实验数据对比可知，丹酚酸A冻干粉针各剂量组与缺血再灌注损伤模型组相比:脑梗死体积比显著减少，脑指数以及脑含水量均明显减少，表明丹酚酸A冻干粉针能减少脑缺血再灌注大鼠脑组织梗塞范围，能减轻脑缺血再灌注损伤后的脑组织水肿程度，效果优于丹酚酸A单体化合物和尼莫地平。经过实验数据对比可知，局灶性脑缺血大鼠，给予不同剂量丹酚酸A冻干粉针IOmin始，各药物组较自身给药前缺血半暗带局部脑血流量(rCBF)有明显上升，且以丹酚酸A冻干粉针高、中剂量组尤为显著；丹酚酸A冻干粉针各剂量组相比，有良好的量效关系；丹酚酸A冻干粉针中剂量组各时段的rCBF与尼莫地平组相当。由此可知，丹酚酸A冻干粉针有增加脑缺血大鼠脑组织缺血半暗带rCBF的作用，有利于挽救缺血半暗带濒临死亡的脑组织，发挥治疗脑缺血的作用，且有优于丹酚酸A单体化合物的趋势。经过实验数据对比可知，在大`鼠持续缺血2h恢复再灌后，各组大鼠缺血半暗带rCBF均有不同程度的增加。但局灶性脑缺血再灌模型组大鼠缺血再灌3h内血流灌注极不稳定，在恢复再灌I 1.5h内，缺血半暗带rCBF升至最高水平,但仍在缺血前的50%以下，脑组织仍呈低灌注状态，且此后又急剧下降至缺血前40%以下，脑组织因再灌而加剧受损。而再灌后，尼莫地平、丹酚酸A冻干粉针高、中、低剂量组大鼠rCBF明显增高，各时间段rCBF与模型组相比都有极显著差异。再灌后lh，丹酚酸A冻干粉针高剂量组rCBF恢复至接近原rCBF的75%，尼莫地平组和丹酚酸A冻干粉针中剂量组恢复至约为原rCBF的69%，IOmmg/kg丹酚酸A单体化合物组恢复至原rCBF的65%左右，丹酚酸A冻干粉针低剂量组恢复至约为原rCBF的61 %，且至再灌注3h内，各药物组rCBF都维持在相对稳定的范围内。结果表明丹酚酸A冻干粉针能明显改善大鼠缺血再灌注后缺血半暗带脑组织的脑血流量，恢复脑细胞血供，从而挽救缺血半暗带，防止脑组织进一步损伤甚至死亡，且效果优于丹酚酸A单体化合物，对缺血性脑血管病有很好的治疗作用。经过实验数据对比可知，丹酚酸A冻干粉针能升高缺血脑组织三磷酸腺苷(ATP)、二磷酸腺苷(ADP)、(单磷酸腺苷)AMP、磷酸肌酸(PC)的含量，降低脑组织乳酸(LA)含量，能显著改善大鼠脑缺血以及缺血再灌注的能量代谢。丹酚酸A冻干粉针可通过改善缺血后脑组织的能量代谢，增加脑组织能量物质的供应，增强脑细胞的生存能力，挽救脑缺血后的缺血半暗带濒临死亡的脑细胞，防止脑组织进一步损伤甚至死亡，且作用效果较丹酚酸A单体化合物和尼莫地平明显，可很好地用于治疗缺血性脑血管病。
经过实验数据对比可知，大鼠脑缺血2h再灌24h后，神经细胞凋亡严重；而尼莫地平、丹酚酸A单体化合物以及不同剂量丹酚酸A冻干粉针干预后，与模型组比较，大鼠脑组织内神经细胞凋亡显著减少(P<0.001或P<0.01);且以丹酚酸A冻干粉针高、中剂量组的凋亡率最低；表明丹酚酸A冻干粉针具有抑制脑缺血损伤大鼠脑组织神经元死亡、抑制神经细胞凋亡的作用，效果优于丹酚酸A单体化合物和尼莫地平。神经营养因子是神经元生长与存活必需的一组蛋白质分子，对神经元生长、发育以及功能的完整性起支持作用。神经生长因子(NGF)、脑源性神经营养因子(BDNF)、神经营养因子-3(NT-3)是神经营养因子家族的一部分，可以维持神经元存活和促进神经细胞分化和诱导轴突生长；能保护神经元、促进神经元修复以及抑制迟发性神经元死亡，从而对抗脑缺血、保护脑缺血损伤。大鼠脑缺血再灌后，大鼠脑组织内较假手术组有所增高，提示脑缺血再灌损伤后，脑组织内NGF、BDNF表达应激保护性增加；但缺血后脑组织内NT-3含量明显减少。经过实验数据对比可知，与模型对照组比较，丹酚酸A冻干粉针各剂量组NGF、BDNF, NT-3蛋白表达均明显增强，且有优于同剂量丹酚酸A单体化合物以及尼莫地平的趋势。提示丹酚酸A冻干粉针能增强缺血损伤脑组织内源性神经营养因子NGF、BDNF、NT-3的表达，为神经元存活提供条件，而达到神经元保护的作用。大鼠脑缺血再灌注后，脑组织内炎症细胞因子白细胞介素_1β (IL-Ιβ)、白细胞介素_6(IL-6)、白细胞介素_8(IL-8)、肿瘤坏死因子- a (TNF-α )、细胞间粘附分子-1 (ICAM-1)含量均极显著增加；经过实验数据对比可知，给予丹酚酸A冻干粉针各剂量组的大鼠脑组织各炎症细胞因子含量较模型组明显降低，且较同剂量的丹酚酸A单体化合物组以及尼莫地平组显著。提示丹酚酸A冻干粉针可以抑制缺血损伤脑组织炎症细胞因子的表达，抑制脑组织炎症反应的发生，抑制炎性反应介导的神经元及脑组织级联损伤，效果优于丹酚酸A单体化合物和尼莫地平。细胞内Ca2+超载是脑缺血过程中介导继发性脑损害的重要机理之一，是缺血、缺氧产生不可逆神经元损伤的最后共同途径。Ca2+超载可通过激发作为第二信使的激活蛋白酶、激活磷脂酶、激活内切核酸酶等一系列酶反应对细胞产生损害，诱导细胞凋亡，导致急性细胞死亡和迟发性神经元坏死。K+、Mg2+均为Ca2+拮抗剂。K+作为神经细胞胞极化状态必不可少的阳离子，可以抑制钙离子的内流进而减轻钙超载；Mg2+可激活机体内多种酶系，在脑组织内参与细胞多种重要的代谢活动，影响神经传导、离子转运、蛋白合成及能量代谢诸多方面，能缓解血管平滑肌的痉挛，改善微循环，改善脑损伤后缺血缺氧，阻滞颅脑损伤后神经细胞内钙超载。经过实验数据对比可知，脑缺血再灌注模型组与假手术组比较脑组织Ca2+含量极显著增高，K+、Mg2+含量显著降低；与模型组比较，尼莫地平组、丹酚酸A单体化合物组和丹酚酸A冻干粉针各剂量组能显著降低脑组织中Ca2+含量、升高K+、Mg2+含量，且以丹酚酸A冻干粉针效果最为显著。说明丹酚酸A冻干粉针能抑制Ca2+内流减轻钙超载，从而可抑制Ca2+超载诱导的神经元细胞凋亡。经过实验数据对比可知，丹酚酸A冻干粉针能明显提高脑缺血再灌注损伤大鼠的大脑皮层和纹状体单胺类递质5-羟色胺(5-HT)、去甲肾上腺素(NE)、多巴胺(DA)的含量，升高大鼠脑缺血再灌注损伤 脑组织中Y-氨基丁酸(GABA)、牛磺酸(Tau)含量、显著降低脑组织中谷氨酸(Glu)、天门冬氨酸(Asp)、甘氨酸(Gly)的含量以及氨基酸兴奋毒性指数。且剂量增加，作用增强。结合脑组织病理病理学检查显示的丹酚酸A冻干粉针能明显减轻脑水肿，改善神经元细胞形态的结果，表明丹酚酸A冻干粉针能抑制单胺类神经递质过度释放，改善单胺类神经递质紊乱；抑制脑缺血再灌注中兴奋性氨基酸的堆积，稳定兴奋性氨基酸-抑制性氨基酸递质的平衡，减轻兴奋性氨基酸毒性；从而抑制单胺类神经递质紊乱和兴奋性氨基酸毒性诱导的神经元细胞凋亡，且效果较同剂量丹酚酸A单体化合物以及尼莫地平更具有优势。经过实验数据对比可知，丹酚酸A冻干粉针各剂量组与缺血再灌注模型组相比，大鼠脑组织中脂质过氧化物(LPO)含量显著降低，且低于同剂量的丹酚酸A单体化合物组；超氧化物歧化酶(SOD)以及谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性显著升高，且有高于同剂量丹酚酸A单体化合物组的趋势，效果较尼莫地平组也更明显；说明丹酚酸A冻干粉针能增加缺血再灌注损伤脑组织中过氧化物清除酶的活性、抑制过氧化物的产生，从而对抗氧自由基对神经元细胞和脑组织的的损伤，其抗氧化作用有优于同剂量的丹酚酸A单体化合物的趋势。经过实验数据对比可知，脑血栓缺血模型组各时间段的脑血管内皮细胞凋亡数目显著高于假手术组，脑组织缺血后6h，内皮细胞凋亡就已明显增多，至缺血后24小时达高峰。与模型组比较，丹酚酸A冻干粉针各剂量组的各时间段的细胞凋亡数显著减少，且少于同剂量的丹酚酸A单体化合物和尼莫地平组。说明丹酚酸A冻干粉针能抑制脑缺血后脑血管内皮细胞凋亡，提高脑血管内皮细胞存活率，从而保证脑血管内皮细胞功能的正常，维持缺血损伤后脑血管结构和功能的完整而增强对抗脑缺血损伤的能力，发挥治疗缺血性脑血管病作用。经过实验数据对比可知，经丹酚酸A冻干粉针和尼莫地平作用后，缺氧及缺氧-复氧损伤大鼠脑微血管内皮细胞存活率显著升高，且丹酚酸A冻干粉针组存活率显著高于尼莫地平组，且比同剂量的丹酚酸A单体化合物组的细胞存活率也要高。提示丹酚酸A冻干粉针能保护脑微血管内皮细胞缺氧及缺氧-复氧损伤，增强其耐缺氧能力，提高缺氧损伤以及缺氧-复氧损伤的脑微血管内皮细胞存活率，优于尼莫地平和丹酚酸A单体化合物。经过实验数据对比可 知，缺氧-复氧损伤，能造成大鼠脑微血管内皮细胞各期凋亡率显著增加。与模型组比较，丹酚酸A冻干粉针各剂量组、丹酚酸A单体化合物组及尼莫地平组均可显著减低细胞早、晚期及总凋亡率；丹酚酸A冻干粉针各剂量组之间呈一定的量效关系。且丹酚酸A冻干粉针10 μ mol/L剂量组与尼莫地平40 μ mol/L剂量组效果相当，同剂量的丹酚酸A冻干粉针优于丹酚酸A单体化合物。提示丹酚酸A冻干粉针具有良好的抗缺氧-复氧损伤导致的大鼠脑微血管内皮细胞凋亡的作用。不同剂量丹酚酸A冻干粉针、丹酚酸A单体化合物和尼莫地平作用后，缺氧-复氧损伤的大鼠脑微血管内皮细胞分泌组织纤维酶原激活物(t-PA)和一氧化氮(NO)的分泌量较模型组显著升高(P < 0.01或P < 0.001)，其中丹酚酸A冻干粉针中、高剂量组升至接近正常对照组水平；各给药组t-PA/PAI和NO/ΕΤ比值也较模型组显著提高。实验结果提示丹酚酸A冻于粉针能改善缺氧-复氧损伤后脑微血管内皮细胞的分泌功能，作用效果显著优于尼莫地平，且有优于同剂量丹酚酸A单体化合物的趋势。缺氧-复氧损伤后，BMVEC胞内Ca2+浓度显著增高。经过实验数据对比可知，与模型组比较，各药物组Ca2+浓度极显著降低，以丹酚酸A冻干粉针中、高剂量组效果最为显著，细胞内钙离子浓度显著低于尼莫地平40 μ mol/L剂量组，且优于同剂量的丹酚酸A单体化合物。提示丹酚酸A冻干粉针具有抑制缺氧-复氧损伤致BMVEC胞内Ca2+浓度的作用。经过实验数据对比可知，丹酚酸A冻干粉针对大鼠动脉血栓形成时间的影响与生理盐水对照组比较，丹酚酸A冻干粉针高、中、低剂量组的血栓形成时间显著延长；低剂量组(0.5mg/kg)血栓形成时间与20mg/kg阿司匹林组相当；中剂量组比同剂量的丹酹酸A单体化合物组血栓形成时间延长；表明丹酚酸A冻干粉针能延长血栓形成时间，预防动脉血栓的形成，预防血栓而致的缺血性脑血管病。经过实验数据对比可知，丹酚酸A冻干粉针对大鼠血栓形成的影响与生理盐水组比较，丹酚酸A冻干粉针高、中、低剂量组大鼠血栓湿、干重均显著减轻。且低剂量组与20mg/kg阿司匹林组效果相当。说明丹酚酸A冻干粉针具有很好的抑制血栓形成的作用，能用于预防或治疗血栓所致的缺血性脑血管病，且比丹酚酸A单体化合物效果明显。经过实验数据对比可知，丹酚酸A冻干粉针对大鼠静脉栓塞的影响与生理盐水组比较，丹酚酸A冻干粉针高、中、低剂量组大鼠静脉血栓湿、干重显著减轻，低剂量组(0.5mg/kg)与20mg/kg阿司匹林组效果相当(P > 0.05);中剂量组较同剂量的丹酹酸A单体化合物效果明显。表明丹酚酸A冻干粉针有抑制静脉血栓形成的作用，可用于预防急性缺血性脑血管病发生后的静脉血栓栓塞。经过实验数据对比可知，丹酚酸A冻干粉针对大鼠体外血栓形成与生理盐水组比较，丹酚酸A冻干粉针高、中、低剂量组大鼠体外血栓形成的长度显著缩短，血栓湿、干重显著减轻，低剂量组(0.5mg/kg)与20mg/kg阿司匹林组效果相当；表明丹酹酸A冻干粉针对体外血栓形成具有较好的抑制作用，且有优于同剂量丹酚酸A单体化合物的趋势。。经过实验数据对比可知，丹酚酸A冻干粉针对体内已形成的血栓的影响与生理盐水组比较，生理盐水组均持续栓塞，且无出现再通现象；各药物组持续栓塞的动物数少，与生理盐水组相比均有极显著差异；丹酚酸A冻干粉针中剂量组，其血管开放程度与同剂量的丹酚酸A单体化合物组及2000U/kg尿激酶组相似，其再通率相当，但其血管开放状态较丹酚酸A单体化合物和尿激酶组有更稳定的趋势；丹酚酸A冻干粉针高剂量组持续再通率以及再通率均高于尿激酶组，且再栓率明显低于尿激酶组；丹酚酸A冻干粉针低剂量组再通率虽低于尿激酶组，但其再栓率与尿激酶组相当，且有低于尿激酶再栓率的趋势。说明丹酚酸A冻干分针有较好的溶栓以及防止溶栓后再栓塞的作用，且作用较稳定。脑血栓后，大鼠全血粘度、血浆粘度显著增高，红细胞压积也显著升高，经过实验数据对比可知，丹酚酸A冻干粉针各剂量组与模型组比较，其全血粘度和血浆粘度以及红细胞压积均明显降低；结果提示丹酚酸A冻干粉针能加快微血流流速，降低血液粘度，改善血液流变学而有效对抗脑血栓的作用，且较尼莫地平组效果更显著，亦有优于同剂量丹酚酸A单体化合物的趋势。综上所述， 本发明的丹酚酸A冻干粉针对缺血性脑血管病具有明显的治疗效果，本发明中所述缺血性脑血管病包括各种病因形成的影响脑循环的病变及其导致的以神经元死亡和神经功能的缺损为主的缺血性脑组织损害。主要包括一下的任何一种或几种:(I)脑血栓:由来自心脏的栓子如人工瓣膜、房颤、心室血栓、扩张性心肌病、动/静脉血管炎等形成栓子随血液流入脑部血管，导致构成整个脑部血循环的前循环和后循环的各级血管的任何一部位和/或多部位血栓。(2)脑缺血再灌注损伤(3)脑栓塞。(4)颅外颈动脉和脑基底动脉的粥样硬化或狭窄(5)腔隙性脑梗塞。(6)短暂性脑缺血性发作(7)血管性痴呆。
医学和药学研究人员无法预先在不做相关实验的前提下，预先得知丹酚酸A冻干粉针具有上述的良好用途。
图1.丹酚酸A核磁共振氢谱图；图2.丹酚酸A核磁共振碳谱图；图3.紫草酸核磁共振氢谱图；图4.紫草酸核磁共振碳谱图；图5.迷迭香酸核磁共振氢谱图；图6.迷迭香酸核磁共振碳谱图；图7.丹酚酸B核磁共振氢谱图；图8.丹酚酸B核磁共振碳谱图；图9.丹酚酸C核磁共振氢谱图；图10.丹酚酸C核磁共振碳谱 图；图11.混合对照品溶液HPLC图；图12.紫草酸对照品溶液HPLC图；图13.迷迭香酸对照品溶液HPLC图；图14.丹酚酸B对照品溶液HPLC图；图15.丹酚酸A对照品溶液HPLC图；图16.丹酚酸C对照品溶液HPLC图；图17.丹酚酸A组合物HPLC图；图18.注射用丹酚酸A冻干曲线图；图19.注射用丹酚酸A冻干真空曲线图。
具体实施例方式实施例1取丹参药材，粉碎成6目颗粒，每次加7倍量92°C水，温浸提取3次，同时以25转/分速度搅拌，每次温浸提取3小时；提取液减压浓缩至相对密度1.20 (600C )，加入乙醇使含醇量在70%，静置，滤过，滤液减压回收乙醇并浓缩至无醇味；加水稀释至每Iml含丹酚酸B20mg，水溶液用10%氢氧化钠调pH至4.0，加入0.5% ZnCl2作为催化剂，120°C温度加热转化4小时，转化液用20%磷酸调pH值至2.5，离心，上清液减压浓缩至每Iml含丹酚酸A3mg，经HPD-100大孔树脂柱层析分离，丹酚酸A上样量与大孔吸附树脂比为1: 50，树脂柱径高比为1: 10，分别用3倍柱体积水、5倍柱体积25%乙醇洗脱，除去杂质，再用4倍柱体积40%乙醇洗脱，HPLC检测，收集含有丹酚酸A的40%乙醇洗脱部分，减压回收乙醇并浓缩至无醇味；水溶液浓缩至每ml含5mg丹酚酸A的溶液，通过聚酰胺层析柱分离，丹酚酸A上样量与聚酰胺比为1: 10，树脂柱径高比为1: 8，分别用3倍柱体积水、12倍柱体积40%乙醇溶液洗脱除杂，再用8倍柱体积60%乙醇溶液洗脱，收集含有丹酚酸A的60%乙醇溶液部分，减压回收乙醇并浓缩至每Iml含丹酚酸A15mg水溶液；水溶液用20%磷酸调PH至2.5，用水溶液3倍量的叔丁基甲基醚，分3次萃取，分离有机层，减压回收叔丁基甲基醚，制成每Iml含丹酚酸A0.5g的萃取液，加入I 3倍量硅胶，搅拌，挥干；把搅拌样硅胶加到已装好的15倍量干硅胶柱上，硅胶柱径高比为1: 10，以正戊烷-叔丁基甲基醚为洗脱剂，梯度洗脱，分别用正戊烷:叔丁基甲基醚(4: 6)洗脱10倍柱体积，正戊烷:叔丁基甲基醚出:4)洗脱10倍柱体积，减压回收洗脱剂，回收有机溶剂后的丹酚酸A加12倍量水溶解，用微波真空干燥(干燥温度50°C，回差温度4°C，真空度-0.07Mpa以上，微波功率60KW) 130分钟，得丹酚酸A主份原粒。经测定，所述含丹酚酸A主份原料中丹酚酸A含量为94.57 %，紫草酸含量0.663% ;迷迭香酸含量1.16% ;丹酚酸B含量1.24% ;丹酚酸C含量1.48%。实施例2取丹参药材，粉碎成直径约2mm颗粒，每次加7倍量90°C水，温浸提取3次，同时以25转/分速度搅拌，每次温浸提取3小时；提取液减压浓缩至相对密度1.16(60°C)，加入乙醇使含醇量在70%，静置，滤过，滤液减压回收乙醇并浓缩至无醇味；加水稀释至每Iml含丹酚酸B20mg，水溶液用10%氢氧化钠调pH至3.5，加入0.5% ZnCl2作为催化剂，120°C温度加热转化4小时，转化液用20%磷酸调pH值至2.5，离心，上清液减压浓缩至每Iml含丹酚酸A3mg，经HPD-100大孔树脂柱层析分离，丹酚酸A上样量与大孔吸附树脂比为1: 50，树脂柱径高比为1: 10，分别用3倍柱体积水、5倍柱体积25%乙醇洗脱，除去杂质，再用4倍柱体积40%乙醇洗脱，HPLC检测，收集含有丹酚酸A的40%乙醇洗脱部分，减压回收乙醇并浓缩至无醇味；水溶液浓缩至每ml含5mg丹酚酸A的溶液，通过聚酰胺层析柱分离，丹酚酸A上样量与聚酰胺比为1: 10，树脂柱径高比为1: 8，分别用3倍柱体积水、12倍柱体积40%乙醇溶液洗脱除杂，再用8倍柱体积60%乙醇溶液洗脱，收集含有丹酚酸A的60%乙醇溶液部分，减压回收乙醇并浓缩至每Iml含丹酚酸A15mg水溶液；水溶液用20%磷酸调pH至2.5，用水溶液3倍量的叔丁基甲基醚，分3次萃取，分离有机层，减压回收叔丁基甲基醚，制成每Iml含丹酹酸A0.5g的萃取液,加入I 3倍量娃胶,搅拌,挥干；把搅拌样娃胶加到已装好的15倍量干硅胶柱上，硅胶柱径高比为1: 10，以正戊烷-叔丁基甲基醚为洗脱剂，梯度洗脱，分别用正戊烷-叔丁基甲基醚(4: 6)洗脱10倍柱体积，正戊烷-叔丁基甲基醚出:4)洗脱10倍柱体积，减压回收洗脱剂，回收有机溶剂后的丹酚酸A加10倍量水溶解，用微波真空干燥(干燥温度50°C，回差温度2°C，真空度-0.07Mpa以上，微波功率20KW) 120分针，得含丹酚酸A主份原料。经测定，所述含丹酚酸A主份原料中丹酚酸A含量为95.23 %，紫草酸含量0.70 %;迷迭香酸含量1.08% ;丹酚酸B含量1.21% ;丹酚酸C含量1.48%。实施例3取丹参药材，切成饮片，每次加8倍量85°C水温浸提取3次，同时以20转/分速度搅拌，每次温浸提取2.5小时；提取液减压浓缩至相对密度1.20 (600C )，加入乙醇使含醇量在75%，静置，滤过，滤液减压回收乙醇并浓缩至无醇味；加水稀释至每Iml含丹酚酸B15mg，水溶液用10%氢氧化钾调pH至5.0，加入0.6% ZnCl2作为催化剂，在120°C温度加热转化3.5小时，转化液用15%盐酸调pH值至2.5，离心，上清液减压浓缩至每Iml含丹酚酸A5mg，经HPD-100大孔树脂柱层析分离，丹酚酸A上样量与大孔吸附树脂比为1: 45，树脂柱径高比为1: 8，分别用3.5倍柱体积 水、4倍柱体积25%乙醇洗脱，除去杂质，再用5倍柱体积45%乙醇洗脱，HPLC检测，收集含有丹酚酸A的45%乙醇洗脱部分，减压回收乙醇并浓缩至无醇味；水溶液浓缩至每ml含5mg丹酚酸A的溶液，通过聚酰胺层析柱分离，丹酚酸A上样量与聚酰胺比为1: 9，树脂柱径高比为1: 7，分别用4倍柱体积水、10倍柱体积40%乙醇溶液洗脱除杂，再用8倍柱体积65%乙醇溶液洗脱，收集含有丹酚酸A的65%乙醇溶液部分，减压回收乙醇并浓缩至每Iml含丹酚酸A12mg水溶液；水溶液用15%盐酸调pH至2.6，用4倍量的叔丁基甲基醚，分4次萃取，分离有机层，减压回收叔丁基甲基醚，制成每Iml含丹酚酸A0.8g的萃取液，加入2 3倍量硅胶，搅拌，挥干；把搅拌样硅胶加到已装好的13倍量干硅胶柱上，硅胶柱径高比为1: 8，以正戊烷叔丁基甲基醚为洗脱剂，梯度洗脱，分别用正戊烷-叔丁基甲墓醚(4: 6)洗脱8倍柱体积，正戊烷-叔丁基甲基醚(6: 4)洗脱8倍柱体积，减压回收洗脱剂，回收有机溶剂后的丹酚酸A加8倍量水溶解，用微波真空干燥(干燥温度60°C，回差温度2.5°C，真空度-0.07Mpa以上，微波功率10KW) 130分钟，得含丹酚酸A主份原料。经测定，所述含丹酚酸A主份原料中丹酚酸A含量为96.03 %，紫草酸含量0.60 %;迷迭香酸含量1.01% ;丹酚酸B含量1.08% ;丹酚酸C含量1.27%。实施例4取丹参药材，粉碎成直径约2mm颗粒，每次加9倍量85°C水温浸提取2次，同时以30转/分速度搅拌，每次温浸提取3.5小时；提取液减压浓缩至相对密度1.18 (600C )，加入乙醇使含醇量在75%，静置，滤过，滤液减压回收乙醇并浓缩至无醇味；加水稀释至每Iml含丹酚酸B18mg，水溶液用10%碳酸钠调pH至5.2，加入0.6% ZnCl2作为催化剂，在123°C温度加热转化4.5小时，转化液用15%硝酸调pH值至2.8，离心，上清液减压浓缩至每Iml含丹酚酸A6mg，经HPD-100大孔树脂柱层析分离，丹酚酸A上样量与大孔吸附树脂比为1: 40，树脂柱径高比为1: 7，分别用4倍柱体积水、4倍柱体积25%乙醇洗脱，除去杂质，再用5倍柱体积40%乙醇洗脱，HPLC检测，收集含有丹酚酸A的40%乙醇洗脱部分，减压回收乙醇并浓缩至无醇味；水溶液浓缩至每ml含6mg丹酚酸A的溶液，通过聚酰胺层析柱分离，丹酚酸A上样量与聚酰胺比为1: 8，树脂柱径高比为1: 8，分别用4倍柱体积水、9倍柱体积40%乙醇溶液洗脱除杂，再用7倍柱体积`65%乙醇溶液洗脱，收集含有丹酚酸A的65%乙醇溶液部分，减压回收乙醇并浓缩至每Iml含丹酚酸AlOmg水溶液；水溶液用15%硝酸调pH至2.6，用4倍量的叔丁基甲基醚，分4次萃取，分离有机层，减压回收乙酸甲酯，制成每Iml含丹酚酸A0.7g的萃取液，加入3倍量硅胶，搅拌，挥干；把搅拌样硅胶加到已装好的10倍量干硅胶柱上，硅胶柱径高比为1: 7，以正戊烷-叔丁基甲基醚为洗脱剂，梯度洗脱，分别用正戊烷-叔丁基甲基醚(4: 6)洗脱8倍柱体积，正戊烷-叔丁基甲基醚(6: 4)洗脱9倍柱体积，减压回收洗脱剂，回收有机溶剂后的丹酚酸A加8倍量水溶解，用微波真空干燥(干燥温度60°C，回差温度3°C，真空度-0.07Mpa以上，微波功率5KW) 100分钟，得含丹酚酸A主份原料。 经测定，所述含丹酚酸A主份原料中丹酚酸A含量为94.72 %，紫草酸含量0.76 %;迷迭香酸含量1.13% ;丹酚酸B含量1.26% ;丹酚酸C含量1.46%。实施例5取丹参药材，切成饮片，每次加10倍量80°C水温浸提取3次，同时以15转/分速度搅拌，每次温浸提取3小时；提取液减压浓缩至相对密度1.12 (600C )，加入乙醇使含醇量在70%，静置，滤过，滤液减压回收乙醇并浓缩至无醇味；加水稀释至每Iml含丹酚酸B20mg，水溶液用10%碳酸氢钠调pH至4.4，加入0.8% ZnCl2作为催化剂，在128°C温度加热转化4.0小时，转化液用20%硫酸调pH值至2.6，离心，上清液减压浓缩至每Iml含丹酚酸A5mg，经HPD-100大孔树脂柱层析分离，丹酚酸A上样量与大孔吸附树脂比为1: 40，树脂柱径高比为1: 7，分别用4倍柱体积水、4倍柱体积25%乙醇洗脱，除去杂质，再用5倍柱体积40%乙醇洗脱，HPLC检测，收集含有丹酚酸A的40%乙醇洗脱部分，减压回收乙醇并浓缩至无醇味；水溶液浓缩至每ml含6mg丹酚酸A的溶液，通过聚酰胺层析柱分离，丹酚酸A上样量与聚酰胺比为1: 10，树脂柱径高比为1: 15，分别用4倍柱体积水、7倍柱体积35%乙醇溶液洗脱除杂，再用6倍柱体积60%乙醇溶液洗脱，收集含有丹酚酸A的60%乙醇溶液部分，减压回收乙醇并浓缩至每Iml含丹酚酸A12mg水溶液；水溶液用20%硫酸调pH至2.8，用4倍量的叔丁基甲基醚，分4次萃取，分离有机层，减压回收叔丁基甲基醚，制成每Iml含丹酚酸A0.5g的萃取液，加入2.5倍量硅胶，搅拌，挥干；把搅拌样硅胶加到已装好的9倍量干硅胶柱上，硅胶柱径高比为1: 8，以正戊烷:叔丁基甲基醚为洗脱剂，梯度洗脱，分别用正戊烷-叔丁基甲基醚(4: 6)洗脱8倍柱体积，正戊烷-叔丁基甲基醚(6: 4)洗脱8倍柱体积，减压回收洗脱剂，回收有机溶剂后的丹酚酸A加10倍量水溶解，用微波真空干燥(干燥温度65°C，回差温度4°C，真空度-0.07Mpa以上，微波功率12KW) 110分钟，得含丹酚酸A主份原料。经测定，所述含丹酚酸A主份原料中丹酚酸A含量为95.23 %，紫草酸含量0.69 %;迷迭香酸含量1.17% ;丹酚酸B含量1.25% ;丹酚酸C含量1.47%。实施例6取丹参药材，粉碎成直径约2mm颗粒，每次加9倍量85°C水温浸提取3次，同时以20转/分速度搅拌，每次温浸提取2.5小时；提取液减压浓缩至相对密度1.1 (600C )，加入乙醇使含醇量在70%，静置，滤过，滤液减压回收乙醇并浓缩至无醇味；加水稀释至每Iml含丹酚酸BlOmg，水溶液用 20%柠檬酸钠调pH至5.5，加入0.4% ZnCl2作为催化剂，在132°C温度加热转化3.5小时，转化液用20%醋酸调pH值至2.6，离心，上清液减压浓缩至每Iml含丹酚酸A5mg，经HPD-100果孔树脂柱层析分离，丹酚酸A上样量与大孔吸附树脂比为1: 35，树脂柱径高比为1: 8，分别用3倍柱体积水、4.5倍柱体积25%乙醇洗脱，除去杂质，再用6倍柱体积40%乙醇洗脱，HPLC检测，收集含有丹酚酸A的40%乙醇洗脱部分，减压回收乙醇并浓缩至无醇味；水溶液浓缩至每ml含8mg丹酚酸A的溶液，通过聚酰胺层析柱分离，丹酚酸A上样量与聚酰胺比为1: 12，树脂柱径高比为1: 18，分别用4倍柱体积水、8倍柱体积30%乙醇溶液洗脱除杂，再用5倍柱体积65%乙醇溶液洗脱，收集含有丹酚酸A的65%乙醇溶液部分，减压回收乙醇并浓缩至每Iml含丹酚酸A15mg水溶液；水溶液用20%醋酸调pH至2.7，用5倍量的叔丁基甲基醚，分5次萃取，分离有机层，减压回收叔丁基甲基醚，制成每Iml含丹酚酸A0.5g的萃取液，加入2倍量硅胶，搅拌，挥干；把搅拌样硅胶加到已装好的10倍量干硅胶柱上，硅胶柱径高比为1: 10，以正戊烷、叔丁基甲基醚为洗脱剂，梯度洗脱，分别用正戊烷-叔丁基甲基醚(4: 6)洗脱8倍柱体积，正戊烷-叔丁基甲基醚出:4)洗脱8倍柱体积，减压回收洗脱剂，回收有机溶剂后的丹酚酸A加12倍量水溶解，用微波真空干燥(干燥温度65°C，回差温度5°C，真空度-0.07Mpa以上，微波功率15KW) 90分钟，得含丹酚酸A主份原料。经测定，所述含丹酚酸A主份原料中丹酚酸A含量为95.24 %，紫草酸含量0.69 %;迷迭香酸含量1.07% ;丹酚酸B含量1.21% ;丹酚酸C含量1.46%。实施例7取丹参药材，粉碎成直径约2mm颗粒，每次加9倍量88 °C水温浸提取3次，同时以22转/分速度搅拌，每次温浸提取3.5小时；提取液减压浓缩至相对密度1.24 (600C )，加入乙醇使含醇量在75%，静置，滤过，滤液减压回收乙醇并浓缩至无醇味；加水稀释至每Iml含丹酚酸B13mg，水溶液用10%氢氧化钠调pH至3.6，加入0.5% ZnCl2作为催化剂，在133°C温度加热转化4.5小时，转化液用10%盐酸调pH值至2.7，离心，上清液减压浓缩至每Iml含丹酚酸A5mg，经HPD-100大孔树脂柱层析分离，丹酚酸A上样量与大孔吸附树脂比为1: 40，树脂柱径高比为1: 9，分别用4倍柱体积水、4倍柱体积22%乙醇洗脱，除去杂质，再用6倍柱体积43%乙醇洗脱，HPLC检测，收集含有丹酚酸A的43%乙醇洗脱部分，减压回收乙醇并浓缩至无醇味；水溶液浓缩至每ml含IOmg丹酚酸A的溶液，通过聚酰胺层析柱分离，丹酚酸A上样量与聚酰胺比为1: 15，树脂柱径高比为1: 20，分别用4倍柱体积水、8倍柱体积30%乙醇溶液洗脱除杂，再用5倍柱体积60%乙醇溶液洗脱，收集含有丹酚酸A的60%乙醇溶液部分，减压回收乙醇并浓缩至每Iml含丹酚酸A12mg水溶液；水溶液用10%盐酸调pH至2.8，用5倍量的叔丁基甲基醚，分5次萃取，分离有机层，减压回收叔丁基甲基醚，制成每Iml含丹酚酸A0.5g的萃取液，加入3倍量硅胶，搅拌，挥干；把搅拌样硅胶加到已装好的12倍量干硅胶柱上，硅胶柱径高比为1: 10，以正戊烷、叔丁基甲基醚为洗脱剂，梯度洗脱，分别用正戊烷-叔丁基甲基醚(4: 6)洗脱6倍柱体积，正戊烷-叔丁基甲基醚出:4)洗脱7倍柱体积，减压回收洗脱剂，回收有机溶剂后的丹酚酸A加10倍量水溶解，用微波真空干燥(干燥温度50°C，回差温度IV，真空度-0.07Mpa以上，微波功率3KW) 150分钟，得含丹酚酸A主份原料。经测定，所述含丹酚酸A主份原料中丹酚酸A含量为95.02 %，紫草酸含量0.75%;迷迭香酸含量1.12% ;丹酚酸B含量1.26% ;丹酚酸C含量1.46%。实施例8取丹参药材，切成饮片，每次加9倍量90°C水温浸提取3次，同时以25转/分速度搅拌，每次温浸提取3小时；提取液减压浓缩至相对密度1.13(60°C)，加入乙醇使含醇量在75%，静置，滤过，滤液减压回收乙醇并浓缩至无醇味；加水稀释至每Iml含丹酚酸B20mg，水溶液用10%碳酸钠调pH至3.5，加入1.0% ZnCl2作为催化剂，在135°C温度加热转化4.5小时，转化液用15%硫酸调pH值至3.0,离心,上清液减压浓缩至每Iml含丹酹酸A5mg,经HPD-100大孔树脂柱层析分离，丹酚酸A上样量与大孔吸附树脂比为1: 36，树脂柱径高比为1: 9，分别用3倍柱体积水、4倍柱体积25%乙醇洗脱，除去杂质，再用5倍柱体积45%乙醇洗脱，HPLC检测，收集含有丹酚酸A的45%乙醇洗脱部分，减压回收乙醇并浓缩至无醇味；水溶液浓缩至每Iml含6mg丹酚酸A的溶液，通过聚酰胺层析柱分离，丹酚酸A上样量与聚酰胺比为1: 10，树脂柱径高比为1: 10，分别用4倍柱体积水、8倍柱体积45%乙醇溶液洗脱除杂，再用8倍柱体积65%乙醇溶液洗脱，收集含有丹酚酸A的65%乙醇溶液部分，减压回收乙醇并浓缩至每Iml含丹酚酸AlOmg水溶液；水溶液用15%硫酸调pH至2.7，用4倍量的叔丁基甲基醚， 分4次萃取，分离有机层，减压回收叔丁基甲基醚，制成每Iml含丹酚酸A0.6g的萃取液，加入3倍量硅胶，搅拌，挥干；把搅拌样硅胶加到已装好的10倍量干硅胶柱上，硅胶柱径高比为1: 8，以正戊烷、叔丁基甲基醚为洗脱剂，梯度洗脱，分别用正戊烷-叔丁基甲基醚(4: 6)洗脱8倍柱体积，正戊烷-叔丁基甲基醚出:4)洗脱8倍柱体积，减压回收洗脱剂，回收有机溶剂后的丹酚酸A加8倍量水溶解，用微波真空干燥(干燥温度80°C，回差温度4°C，真空度-0.07Mpa以上，微波功率60KW) 120分钟，得含丹酚酸A主份原料。经测定，所述含丹酚酸A主份原料中丹酚酸A含量为95.34%，紫草酸含量0.62%；迷迭香酸含量1.10% ;丹酚酸B含量1.23% ;丹酚酸C含量1.47%。
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实施例9取实施例3制成的含丹酚酸A主份原料80g，加注射用水2800ml搅拌使溶解，用10%氢氧化钠调pH值4.5，加入甘露醇60g使溶解，再加入维生素C0.5g,搅拌使溶解，混匀，加入活性炭2g搅拌吸附，滤过，除去活性炭；加注射用水至3000ml，检测中间体含量，pH值，检测合格后用0.22 μ m微孔滤膜滤过，滤液灌装干无菌的西林瓶中，部分塞上丁基橡胶塞，共制成1000瓶，装盘，灌装完成后，送入冻干机，关闭箱门，开启冻干机，以20°C /h速度降温至_40°C，保温冷冻16小时；抽真空至0.3mbar以下，在10小时内将冻结的丹酚酸A制剂温度上升到_25°C，维持_25°C真空干燥8小时；继续升温，以0.5°C /min均匀升温至41°C，维持41°C干燥3小时后，将样品温度降至室温，加盖，即得丹酚酸A冻干粉针。实施例10取实施例4制成的含丹酚酸A主份原料20g，加注射用水1800ml搅拌使溶解，用10%氢氧化钠调pH值4.6，加入甘露醇40g使溶解，再加入维生素C0.3g,搅拌使溶解，混匀，加入活性炭Ig搅拌吸附，滤过，除去活性炭；加注射用水至2000ml，检测中间体含量，pH值，检测合格后用0.22 μ m微孔滤膜滤过，滤液灌装于无菌的西林瓶中，部分塞上丁基橡胶塞，共制成1000瓶，装盘，灌装完成后，送入冻干机，关闭箱门，开启冻干机，以30°C /h速度降温至_45°C，保温冷冻10小时；抽真空至0.3mbar以下，在14小时内将冻结的丹酚酸A制剂温度上升到_27°C，维持_27°C真空干燥6小时；继续升温，以1.(TC /min均匀升温至45°C，维持45°C干燥2小时后，将样品温度降至室温，加盖，即得丹酚酸A冻干粉针。实施例11取实施例5制成的含丹酚酸A主份原料10g，加注射用水1500ml搅拌使溶解，用10%氢氧化钠调pH值4.6，加入甘露醇20g使溶解，再加入维生素C0.8g,搅拌使溶解，混匀，加入活性炭1.2g搅拌吸附，滤过，除去活性炭；加注射用水至2000ml，检测中间体含量，PH值，检测合格后用0.22 μ m微孔滤膜滤过，滤液灌装于无菌的西林瓶中，部分塞上丁基橡胶塞，共制成1000瓶，装盘，灌装完成后，送入冻干机，关闭箱门，开启冻干机，以25°C /h速度降温至_42°C，保温冷冻12小时；抽真空至0.3mbar以下，在13小时内将冻结的丹酚酸A制剂温度上升到_23°C，维持_23°C真空干燥7小时；继续升温，以0.8°C /min均匀升温至420C，维持42°C干燥4小时后，将样品温度降至室温，加盖，即得丹酚酸A冻干粉针。实施例12取实施例6制成的含丹酚酸A主份原料30g，加注射用水2000ml搅拌使溶解，用20%碳酸钠调pH值4.6，加入甘露醇20g、乳糖IOg使溶解，再加入硫脲0.5g，搅拌使溶解，混匀,加入活性炭1.0g搅拌吸附，滤过，除去活性炭；加注射用水至2000ml，检测中间体含量，pH值，检测合格后用0.22 μ m微孔滤膜滤过，滤液灌装于无菌的西林瓶中，部分塞上丁基橡胶塞，共制成1000瓶，装盘，灌装完成后，送入冻干机，关闭箱门，开启冻干机，以29°C /h速度降温至-44°C,保温冷冻14小时；抽真空至0.3mbar以下,在11小时内将冻结的丹酹酸A制剂温度上升到-26°C，维持_26°C真空干燥6.5小时；继续升温，以0.6 V Mn均匀升温至43°C，维持43°C干燥3.5小时后，将样品温度降至室温，加盖，即得丹酚酸A冻干粉针。实施例13取实施例7制成的含丹酚酸A主份原料35g，加注射用水2500ml搅拌使溶解，用10 %氮氧化钾调pH值4.6，加入葡萄糖30g使溶解，再加入亚硫酸氢钠3g，搅拌使溶解，混匀，加入活性炭1.5g搅拌吸附，滤过，除去活性炭；加注射用水至3000ml，检测中间体含量，PH值，检测合格后用0.22 μ m微孔滤膜滤过，滤液灌装于无菌的西林瓶中，部分塞上丁基橡胶塞，共制成1000瓶，装盘，灌装完成后，送入冻干机，关闭箱门，开启冻干机，以27°C /h速度降温至_43°C，保温冷冻11小时；抽真空至0.3mbar以下，在12.5小时内将冻结的丹酚酸A制剂温度上升到-24°C，维持_24°C真空干燥7.5小时；继续升温，以0.7V Mn均匀升温至40°C，维持40°C干燥5小时后，将样品温度降至室温，加盖，即得丹酚酸A冻干粉针。实施例14取实施例8制成的含丹酚酸A主份原料40g，加注射用水2700ml搅拌使溶解，用10%氢氧化钠调pH值4.6，加入葡萄糖20g、乳糖20g使溶解，再加入焦亚硫酸钠4g，搅拌使溶解，混匀，加入活性炭1.5g搅拌吸附，滤过，除去活性炭；加注射用水至3000ml，检测中间体含量，PH值，检测合格后用0.22 μ m微孔滤膜滤过，滤液灌装于无菌的西林瓶中，部分塞上丁基橡胶塞，共制成1000瓶，装盘，灌装完成后，送入冻干机，关闭箱门，开启冻干机，以28°C /h速度降温至-41 °C，保温冷冻13小时；抽真空至0.3mbar以下，在13.5小时内将冻结的丹酚酸A制剂温度上升到-25.5°C，维持-25.5°C真空干燥6.5小时；继续升温，以
0.9°C /min均匀升温至44°C，维持44°C干燥3.5小时后，将样品温度降至室温，加盖，即得丹酚酸A冻粉针。实施例15取实施例1制成的含丹酚酸A主份原料60g，加注射用水2700ml搅拌使溶解，用10%氢氧化钠调pH值4.6，加入甘露醇40g使溶解，再加入维生素C2g，搅拌使溶解，混匀，加入活性炭2g搅拌吸附，滤过，除去活性炭；加注射用水至3000ml，检测中间体含量，pH值，检测合格后用0.22 μ m微孔滤膜滤过，滤液灌装于无菌的西林瓶中，部分塞上丁基橡胶塞，共制成1000瓶，装盘，灌装完成后，送入冻干机，关闭箱门，开启冻干机，以24.5°C/h速度降温至-42.5°C，保温冷冻11.5小时；抽真空至0.3mbar以下，在13.5小时内将冻结的丹酚酸A制剂温度上升到-24.5°C，维持-24.5°C真空干燥6.5小时；继续升温，以0.55 °C /min均匀升温至42.5°C，维持42.5°C干燥2.5小时后，将样品温度降至室温，加盖，即得丹酚酸A冻干粉针。实施例16取实施例2制成的含丹酚酸A主份原料70g，加注射用水2800ml搅拌使溶解，用10%氢氧化钠调pH值4.6，加入甘露醇40g使溶解，再加入维生素C2g，搅拌使溶解，混匀，加入活性炭2g搅拌吸附，滤过，除去活性炭；加注射用水至3000ml，检测中间体含量，pH值，检测合格后用0.22 μ m微孔滤膜滤过，滤液灌装于无菌的西林瓶中，部分塞上丁基橡胶塞，共制成1000瓶，装盘，灌装完成后，送入冻干机，关闭箱门，开启冻干机，以28.5°C/h速度降温至-44.5°C，保温冷冻11.5小时；抽真空至0.3mbar以下，在13.5小时内将冻结的丹酚酸A制剂温度上升到-24.5°C，维持-24.5°C真空干燥6.5小时；继续升温，以0.75°C /min均匀升温至43.5°C，维持43.5°C干燥3小时后，将样品温度降至室温，加盖，即得丹酚酸A冻干粉针。实施例17取市售丹酚酸A单体化合物原料(丹酚酸A含量99.62%) 40g，加注射用水2700ml搅拌使溶解，用10%氢氧化钠调pH值4.6，加入葡萄糖20g、乳糖20g使溶解，再加入焦亚硫酸钠4g，搅拌使溶解，混匀,加入活性炭1.5g搅拌吸附，滤过，除去活性炭；加注射用水至3000ml，检测中间体含量，pH值，检测合格后用0.22 μ m微孔滤膜滤过，滤液灌装于无菌的西林瓶中，部分塞上丁基橡胶塞，共制成1000瓶，装盘，灌装完成后，送入冻干机，关闭箱门，开启冻干机，以28°C /h速度降温至_41°C，保温冷冻13小时；抽真空至0.3mbar以下，在13.5小时内将冻结的丹酚酸A制剂温度上升到-25.5°C，维持-25.5°C真空干燥6.5小时；继续升温，以0.9°C /min均匀升温至44°C，维持44°C干燥3.5小时后，将样品温度降至室温，加盖，即得丹酚酸A冻干粉针。实验例1:丹酚酸A主份原料分析方法及分离、结构鉴定研究一、丹酚酸A主份原料分析方法研究1.仪器与试药仪器:Waters e2695高效液相色谱仪，Empower2色谱工作站,2998 二极管阵列检测器；Sartorius cp225D十万分之一电子天平。色谱柱:YMCC18 色谱柱(250 X 4.6mm，5 μ m);
试剂:甲醉为色谱纯，水为Millipore制备的超纯水，其他试剂均为分析纯。迷迭香酸对照品、丹酚酸B对照品均购自中国药品生物制品检定所，供含量测定用；紫草酸对照品、丹酚酸C对照品均购自上海海灿生物科技有限公司，丹酚酸A对照品为自制，经纯度标化含量为99.52%。2.对照品溶液及供试品溶液的制备2.1对照品溶液的制备:分别精密称取紫草酸对照品约10.0Omg、迷迭香酸对照品约10.0Omg、丹酚酸B对照品约10.0Omg、丹酚酸C对照品约10.0Omg、丹酚酸A对照品约10.00mg，置不同IOOml量瓶中，分别加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，分别精密吸取紫草酸对照品、迷迭香酸对照品、丹酚酸B对照品、丹酚酸C对照品各IOml，置不同IOOml量瓶中，分别加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品储备溶液。精密吸取上述储备溶液各10ml，置同一 IOOml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，作为混合对照品溶液。2.3供试品溶液的制备精密称取实施例1样品约10.00mg，置50ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，精密吸取IOml至IOOml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。3.色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流速1.0ml/min ;检测波长:286nm ;柱温300C ;理论板数按丹酚酸A峰计算应不低于10000。O 10分钟时，甲醇的比例由30%升至40%，0.1 0.5%磷酸水溶液的比例由70%降至60% ;10 30分钟时，甲醇的比例由40%升至55%，0.1 0.5%磷酸水溶液的比例由50%降至45% ；30 60分钟时，甲醇的比例由55%升至80%，0.1 0.5%磷酸水溶液的比例由45 %降至20 %。在上述条件下，5个对照品的色谱峰保留时间见表1，HPLC图谱见图11 17。表1.各对照品的色谱峰保留时间结果
权利要求
1.一种丹酚酸A冻干粉针，其特征在于:所述丹酚酸A冻干粉针包括含丹酚酸A主份原料，填充剂和抗氧剂；其中所述冻干粉针的各成份按下列重量配比制成:含丹酚酸A主份原料IOg 80g，填充剂IOg 80g，抗氧剂为制成总量的0.01 % 0.2 %，其中所述填充剂为甘露醇、葡萄糖、乳糖中的任意一种或几种，所述抗氧剂选自维生素C、硫脲、亚硫酸氢钠、焦亚硫酸钠中的任意一种或几种，其中所述含丹酚酸A主份原料中丹酚酸A含量大于93%，小于100%，还包括4个其他成分:紫草酸0.1% 2%，迷迭香酸0.1% 2%，丹酚酸B0.1 % 2%，丹酚酸C0.1% 2%， 所述丹酚酸A冻干粉针采用如下制备方法获得: 取丹参药材，切成饮片或粉碎成直径约Imm 5mm颗粒，每次加3 15倍量、45 95 °C水温浸提取，同时以10 50转/分速度搅拌，或加3 15倍量水煎煮提取，共提取I 3次，每次提取I 4小时；提取液减压浓缩至相对密度1.0 1.25 (600C )，加入乙醇使含醇量在50% 85%，静置，滤过，滤液减压回收乙醇并浓缩至无醇味，得丹参提取液；或者 取丹参药材，切成饮片或粉碎成直径约Imm 5mm颗粒，每次加3 15倍量30% 60%乙醇回流提取，每次提取I 4小时，共提取I 3次；减压回收乙醇并浓缩至无醇味，得丹参提取液； 上述丹参提液加水稀释至每Iml含丹酚酸BI 30mg，水溶液用碱调pH至3.5 6.5，加入与丹酚酸B摩尔百分比0.1 3%氯化锌作为催化剂，在100 140°C温度加热转化I 6小时； 转化液调pH值至2.5 4.5，静置、离心，上清液减压浓缩至每Iml含丹酚酸Al 10mg，经HPD-100大孔树脂柱层析分离，丹酚酸A上样量与大孔吸附树脂比为1: 35 I: 70，树脂柱径高比为1: 4 1: 30，分别用I 8倍柱体积水、I 10倍柱体积10% 40%乙醇洗脱，除去杂质，再用2 10倍柱体积20% 60%乙醇洗脱，HPLC检测，收集含有丹酚酸A的20% 60%乙醇洗脱部分，减压回收乙醇并浓缩至无醇味； 水溶液浓缩 至每Iml含1-1Omg丹酚酸A的溶液，通过聚酰胺层析柱分离，丹酚酸A上样量与聚酰胺比为1: 5 1: 25，树脂柱径高比为1: 4 1: 25，分别用I 10倍柱体积水、5 20倍柱体积20% 60%乙醇溶液洗脱除杂，再用4 15倍柱体积40% 90%乙醇溶液洗脱，收集含有丹酚酸A的40% 90%乙醇溶液部分，减压回收乙醇并浓缩至无醇味水溶液； 水溶液浓缩，调酸pH至2.0 4.0，用水溶液1-8倍量的叔丁基甲基醚，分2 6次萃取，分离有机层，减压回收叔丁基甲基醚，制成每Iml含丹酹酸Alg IOg的萃取液,加入I 3倍量硅胶，搅拌，挥干； 把搅拌样硅胶加到已装好的5 20倍量干硅胶柱上，硅胶柱径高比为1: 4 1: 25，以正戊烷-叔丁基甲基醚为洗脱剂，梯度洗脱，分别用正戊烷-叔丁基甲基醚(4: 6)洗脱6 30倍柱体积，正戊烷-叔丁基甲基醚出:4)洗脱6 30倍柱体积，减压回收洗脱剂，回收有机溶剂后的丹酚酸A加5 20倍量水溶解，微波真空干燥，得所述含丹酚酸A主份原料， 取含丹酚酸A主份原料IOg 80g加注射用水1500 2800ml搅拌使溶解，用碱调pH值4.0 5.0，再加入所述填充剂使其溶解，再加入所述抗氧剂，搅拌使溶解混匀，再加入活性炭0.5 2g搅拌吸附，滤过除去活性炭，加注射用水灌装成瓶，送入冻干机再进行冷冻干燥， 其中所述冷冻干燥包括如下步骤: A、冷冻:以20°C 30°C/h速度降温至-40°C -45°C，保温冷冻10 16小时； B、升华:抽真空至0.3mbar以下，在10 14小时内将冻结的丹酚酸A丹酚酸A制剂温度上升到_23°C -27°C，维持-23°C -27°C真空干燥6 8小时； C、干燥:继续升温，以0.5°C 1.(TC /min均匀升温至40°C 45°C，维持40°C 45°C干燥2 5小时后，将样品温度降至室温，加盖，即得丹酚酸A冻干粉针。
2.根据权利要求1所述的丹酚酸A冻干粉针，其中所述填充剂用量为20mg 40mg/2ml 3ml。
3.根据权利要求1所述的丹酚酸A冻干粉针，其特征在于微波真空干燥温度:20-100°C，回差温度1_5°C，真空度-0.07Mpa以上，微波功率1-100KW，干燥10-200分钟。
4.根据权利要求3所述的丹酚酸A冻干粉针，其特征在于微波真空干燥温度:50-85°C，回差温度2-4°C，真空度-0.07Mpa以上，微波功率10-80KW，干燥100-150分针。
5.根据权利要求4所述的丹酚酸A冻干粉针，其特征在于微波真空干燥温度:55-80°C，回差温度2-3°C，真空度-0.07Mpa以上，微波功率25-60KW，干燥120-140分钟。
6.权利要求1 5任一项所述的丹酚酸A冻干粉针用于制备预防和/或治疗缺血性脑血管病药物的用途。
7.根据权利要求6的用途，其中所述缺血性脑血管病主要包括脑血栓、脑缺血再灌注损伤、脑栓塞、颅外颈动脉和脑 基底动脉的粥样硬化或狭窄、腔隙性脑梗塞、短暂性脑缺血性发作、血管性痴呆中的任意一种或几种。
8.根据权利要求6或7的用途，其中所述丹酚酸A冻干粉针用于改善脑缺血后的神经功能的用途。
9.根据权利要求6或7的用途，其中所述丹酚酸A冻干粉针用于保护缺血脑组织损损伤的用途。
10.根据权利要求9的用途，其中所述丹酚酸A冻干粉针用于保护血脑屏障的用途。
11.根据权利要求9的用途，其中所述丹酚酸A冻干粉针用于减少缺血脑组织梗死范围的用途。
12.根据权利要求9的用途，其中所述丹酚酸A冻干粉针用于减轻缺血脑组织水肿的用途。
13.根据权利要求6或7的用途，其中所述的丹酚酸A冻干粉针用于挽救缺血半暗带的用途。
14.根据权利要求13的用途，其中所述丹酚酸A冻干粉针用于促进脑部血管的新生和侧枝循环的建立的用途。
15.根据权利要求14的用途，其中所述丹酚酸A冻干粉针用于增加脑组织微血管密度的用用途。
16.根据权利要求14的用途，其中所述丹酚酸A冻干粉针用于促进血管内皮生长因子表达的用途。
17.根据权利要求14的用途，其中所述丹酚酸A冻干粉针用于促进碱性成纤维细胞生长因子蛋白表达的用途。
18.根据权利要求13的用途，其中所述丹酚酸A冻干粉针用于增加缺血半暗带脑血流量用途。
19.根据权利要求13的用途，其中所述丹酚酸A冻干粉针用手改善脑组织能量代谢用途。
20.根据权利要求6或7的用途，其中所述丹酚酸A冻干粉针用于抑制缺血后脑组织神经元损伤或死亡的用途。
21.根据权利要求20的用途，其中所述丹酚酸A冻干粉针用于抑制脑组织神经细胞凋亡的用途。
22.根据权利要求20的用途，其中所述丹酚酸A冻干粉针用于增强脑组织内源性神经营养因子表达的用途。
23.根据权利要求20的用途，其中所述丹酚酸A冻干粉针用于抑制脑组织炎症损伤的用途。
24.根据权利要求20的用途，其中所述丹酚酸A冻干粉针用于抑制脑组织神经细胞内Ca2+超载的用途。
25.根据权利要求20的用途，其中所述丹酚酸A冻干粉针用于改善脑组织内单胺类神经递质紊乱的用途。
26.根据权利要求20的用途，其中所述丹酚酸A冻干粉针用于抑制脑组织兴奋性氨基酸毒性的用途。
27.根据权利要求20的用途，其中所述丹酚酸A冻干粉针用于抑制脑组织氧自由基损伤的用途。
28.根据权利要求6或7的用途，其中所述丹酚酸A冻干粉针用于保护脑血管内皮细胞的用途。
29.根据权利要求28的用途，其中所述丹酚酸A冻干粉针用于保护脑微血管内皮细胞损伤的用途。
30.根据权利要求6或7的用途，其中所述丹酚酸A冻干粉针用于预防和/或治疗脑血栓的用途。
31.根据权利要求30的用途，其中所述丹酚酸A冻干粉针用于抑制血栓形成的用途。
32.根据权利要求30的用途，其中所述丹酚酸A冻干粉针用于溶解血栓的用途。
33.根据权利要求30的用途，其中所述丹酚酸A冻干粉针用于改善血液流变学的用途。
全文摘要
本发明涉及一种丹酚酸A冻干粉针，所述丹酚酸A冻干粉针包括含丹酚酸A主份原料，填充剂和抗氧剂；其中所述冻干粉针的各成份按下列重量配比制成含丹酚酸A主份原料10g～80g，填充剂10g～80g，抗氧剂为制成总量的0.01％～0.2％，其中所述填充剂为甘露醇、葡萄糖、乳糖中的任意一种或几种，所述抗氧剂选自维生素C、硫脲、亚硫酸氢钠、焦亚硫酸钠中的任意一种或几种，其中所述含丹酚酸A主份原料中丹酚酸A含量大于93％，小于100％，还包括4个其他成分紫草酸0.1％～2％，迷迭香酸0.1％～2％，丹酚酸B0.1％～2％，丹酚酸C0.1％～2％，还公开了所述的丹酚酸A冻干粉针用于制备预防和/或治疗缺血性脑血管病药物的用途。
文档编号A61P7/10GK103142574SQ20121048714
公开日2013年6月12日 申请日期2012年11月20日 优先权日2012年11月20日
发明者吕武清, 杨小玲, 欧阳婷, 崔刚, 蒋春红, 张功俊, 刘艳红 申请人:吕武清