微生物感染的治疗的制作方法
【专利摘要】本申请涉及用于治疗微生物感染或控制微生物污染的抗微生物系统，其避免了抗生素的使用。此类感染包括乳腺炎、肺结核、囊性纤维化以及可能由医疗器械上形成的生物膜所导致的污染。
【专利说明】微生物感染的治疗
【技术领域】
[0001] 本申请涉及用于治疗微生物感染的抗微生物组合物。具体而言，该组合物可以用于治疗细菌感染，或用于控制细菌污染，这避免了抗生素的使用。此类感染包括乳腺炎、肺结核、囊性纤维化和其他肺感染，以及在诸如医疗器械之类的表面上形成的生物膜所导致的污染。而且，所述的组合物还适用于治疗病毒、酵母菌或真菌感染，或者用于控制此类有机体的污染。
【背景技术】
[0002]乳腺炎为奶牛及其他产奶动物的乳房的持续炎性状况。其是美国奶牛的最普通的疾病之一，并且也是乳品工业代价最高的。当通常响应于乳头管中细菌的入侵而使得白细胞被释放到乳腺中时，形成乳腺炎。由患有乳腺炎的奶牛得到的牛奶具有更高的体细胞计数,并且体细胞计数越高,则牛奶的品质越低。
[0003]乳腺炎的常规治疗是使用抗生素，但是经过抗生素治疗的奶牛的牛奶是不可销售的，直到药品离开奶牛的系统为止。使用的抗生素可以是系统性的并被注入到肌体内，或者可以通过乳房内输注迫使它们通过乳头管进入到乳头中。乳腺炎可以是临床的，由此感染的可见迹象被记录；或者可以是亚临床的，其中感染的存在仅记录为所得牛奶中的体细胞计数的增加。在一些临床情况中，通常使奶牛保持未治疗的，但是通过为牛奶所付的钱数的减少而使得奶农的收益受损失，这种情况在牛奶中体细胞计数的增加的情况下发生。
[0004]本发明的抗微生物组合物具有多种其他的用途。这些用途包括哺乳动物的肺的感染。囊性纤维化和肺结核为目前极难治疗的两种疾病。
[0005]肺结核的症状是由于肺内感染所导致的，并需要长期抗生素治疗。囊性纤维化(CF)为这样的状况，其中患者，特别是在肺内，不能调节氯离子的跨膜转移。这种状况总是导致多种慢性的肺感染。抗生素对所述的两种状况的治疗可以导致严重的抗药性，从而降低它们的效力。目前，抗生素通过静脉血流、或者通过口服混悬剂/片剂、或者通过吸入来传递。由于抗生素不能高效地横向穿过肺膜而达到其所需要地方，所以药品的传递是CF患者的一个大问题。这导致了这样的问题，其中抗药性(通过引入亚抑制浓度)可能成为严重的问题。在药品被废弃的情况下，上述情况要进行任何其他的治疗。
[0006]烧伤患者或具有开放伤口的患者特别容易细菌感染，尤其是由于细菌的金黄色葡萄球菌菌种或假单胞菌菌种所导致的那些。此类感染的治疗通常通过口服或静脉内的抗生素规则。它们可以prophalactically给与,或者在感染明显时给与。抗生素的此类用途通常导致抗药性及无效治疗结果。研究者展望使用本发明的技术来治疗烧伤患者的新方法。
[0007]此外，每年大量抗生素治疗是由于医疗器械在患者使用时被污染的结果。多种有机体是造成此类感染的原因，包括革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌。在诸如尿导管或静脉内导管之类的此类部件上，无菌安装此类器械的结果通常是污染。经过多天后，在所述器械表面上存在的任何细菌细胞将增殖，从而导致生物膜的形成。由于药品跨越生物膜团块的内部细胞的转移较差，导致生物膜对抗生素的耐受水平甚至更高，使得此类生物膜极难使用抗生素来处理。就患者的不适而言，污染的医疗器械通常需要被取走及替换。虽然污染通常在医疗器械被安装后的多天后才被记录，但是其通常是在安装的极早期存在细菌的结果。
[0008]公知的是细菌抑制作用是由于在过氧化氢与硫氰酸盐之间通过乳过氧化物酶催化的反应(被称为乳过氧化物酶(LP)系统的过程)所导致。在某些情况下，过氧化物源为葡萄糖与葡萄糖氧化酶之间的反应，其导致葡萄糖酸和过氧化物的生成。该过程在牛奶的运输过程中使用。基于LP系统，建议用于控制感染的抗细菌处理。例如，PCT申请W02008/04128公开了具有抗微生物和免疫刺激作用的制备物，其包含氧化还原酶、用于生产过氧化氢的该酶的合适的底物、以及内源的过氧化氢制备物。该制备物产生了 2个阶段的过氧化氢的释放；内源形式的过氧化物确保具有即刻可用的过氧化氢，并且通过氧化还原酶生产其他的过氧化氢。
[0009]美国专利N0.6312687描述了用作抗微生物组合物的稳定的水性酶浓缩物，其包含乳过氧化物酶、葡萄糖氧化酶、碱金属卤化物盐以及缓冲剂。美国专利N0.5607681描述了抗维生素组合物，其包含碘化物阴离子和硫氰酸根阴离子、以及D-葡萄糖、和葡萄糖氧化酶或葡萄糖氧化酶及至少一种抗氧化剂。该组合物可以额外包含乳过氧化物酶。牛奶中LP系统的细菌抑制作用的建议基础是基于硫氰酸盐和过氧化氢源。在过氧化氢存在下，硫氰酸根离子被乳过氧化物酶氧化，从而生产次硫氰酸。在某些实施方案中，过氧化物离子由葡萄糖通过葡萄糖氧化酶的作用而非使用过氧化氢溶液或由合适的过氧化氢过水合物(例如过碳酸钠)的释放来生产。本申请提出使用其他的底物来帮助实现所述的反应，从而通过补充的酶催化手段来生产过氧化氢。过氧化氢对细菌和哺乳动物细胞是毒性的，而次硫氰酸与细菌蛋白质中的游离巯基反应，从而使多种代谢的酶失活。
[0010]文献中的一致结论教导，LP系统主要对过氧化氢酶阳性革兰氏阳性细菌具有细菌抑制作用，而且教 导对一些革兰氏阴性细菌具有PH依赖的杀菌作用(Wofsonand Sumner,1993，"Antibacterial activity of the lactoperoxidase system:areview〃Journal of Food Protectionl993，56 (10):887-892;Kussendrager and van Hooijdonk，2000〃Lactoperoxidase:physico-chemical properties, occurrence, mechanismof action and applications'British Journal of Nutrition,84, Suppl.1, S19-S25;Seifu et al，2005〃Significance of the lactoperoxidase system in thedairy industry and its potential applications: a review"，Trends in FoodScience&Technologyl6, 137-154)。精确的机制为保持未解决的LP系统的抗微生物性质提供了基础。在文献中报告的试验方案大幅改变，并且许多作者报告了细菌的抑制，但是在一段特定的时间后会再生长，并由此得到生物抑制而非杀灭生物的作用(例如Ishidoet al."Continuous supply of OSCN-1ons by lactoperoxidase system developedfrom Lactose as the primary substrate and its ant1-bacterial activities"，Milchwissenschaft, 661，2011)。此外，文件还提出了使用LP系统的杀细菌活性，而且报告了甚至在高LP浓度下，在测试后仍保持大量的培养细胞(例如Garcia-Garibay etal， 1995，Antimicrobial effect of the lactoperoxidase system in milk activated byimmobilised enzymes〃Food Biotechnology, (3)，157-166)。如本申请中其他处所讨论，在培养基中提供的或者在LP反应过程中生产的过氧化氢对细菌细胞是毒性的，直到进行特定的控制，所述的过氧化氢有助于所报告的抗微生物活性。此外，现有技术公开了多种据报告有协同作用的化合物，其被提出会增强或者确实能够具有LP系统的效力。此外，美国申请号2011/0008361A1提出所述的提取的阳离子级份(包含LP)的抗微生物作用为免疫刺激的组合，其有助于明确感染并定向抗微生物活性。
[0011]系统性信息的缺乏(关于影响LP系统的抗微生物作用的精确因素)是商业化应用的障碍一在敏感性环境(例如哺乳动物的肺)下，所述的系统潜在地具有过氧化氢毒性。
[0012]尽管广泛描述了 LP系统，但是本领域的技术人员认为其为用于治疗细菌感染的无效系统(Rainard&Riollet2006，"Innate immunity of the bovine mammarygland〃，Veterinary Research37，369-400;Sakai et al.，2008，"Generation of hydrogenperoxide by a low molecular weight compound in whey of Holstein dairycows^,Journal of dairy Research，75，257-261;Sakai et al.，2008，"Productionof hydrogen peroxide by a small molecular mass compound in milk fromHolstein cows with high and low milk somatic cell count"，Journal of DairyResearch, 75，335-339)。LP及相似系统的有力且有效的杀灭细菌能力的缺乏是此类应用的显著障碍。目前基于LP系统的商业化应用包括漱口剂、牙膏、食品防腐剂和消毒剂，其主要基于微生物生长的抑制而非细胞的杀死以及由各种环境下得到的细菌菌群的完全消除。例如，所提交的 关于乳过氧化物酶系统的专利(美国专利号4726945和US5607681)用于局部治疗，并且主要的设计方式为减少所存在的细菌的生长(在溶液中，例如离子乳液，或者粉刺或运动员足部的治疗；或者实际上在动物饲料中作为预防剂)。
[0013]本发明的抗微生物物质的光谱且大量潜在的目标不可能诱导抗性基因的增殖。由于药物组合物的成分可以在哺乳动物肌体内天然生产(例如通过中间体，例如硫氰酸盐、乳过氧化物酶、葡萄糖)，所以药品反应也不是问题。对药品的反应是目前的问题，20%的患者对 3 _ 内酉先胺药品有反应(〃Rapid de-sensitization for non-1mmediate reactionsin patients with cystic fibrosis' Whitaker et al.,201I,Journal of CysticFibrosis, 10(4):282-5)。
[0014]Ishido et al.(Milchwissenschaft, Vol.66，N0.1，2011)描述了乳过氧化物酶系统，其包含乳过氧化物酶、葡萄糖氧化酶、(6-半乳糖苷酶、乳糖和硫氰酸钾作为试剂，据说该试剂是抗细菌的。在所有的情况下，乳糖存在于组合物中。但是，所述的文件仅描述了细菌的生长抑制，并且未进行超过48小时的分析。此外，该文件陈述，对革兰氏阴性细菌E.coli和肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)、以及革兰氏阳性菌种木糖葡萄球菌(S.xylosus)、粪肠球菌(E.faecalis)，屎肠球菌(E.faecium)以及棉子糖肠球菌(E.raffinosus)不具有抑制作用。在文件中，结果被标记为“生长抑制”时间，测试时间不超过12小时。总之，该文件由此描述了细菌抑制作用而未描述杀菌作用。
[0015]Garcia-Garibay et al.(Food Biotechnology, 9 (3), 157-166 (1995))描述了^-半乳糖苷酶和葡萄糖氧化酶在生牛奶中生产过氧化氢从而减少牛奶中不需要的微生物有机体的用途。仅在24小时内，再次实施测试，由此呈现显示微生物有机体的数量减少的数据仅表明细菌抑制作用。
[0016]Sandholm et al.(J.Vet.Med.B35, 346-352 (1988))描述了葡萄糖氧化酶用作乳头或乳房内杀菌剂的抗细菌试剂。
[0017]美国专利N0.5607681描述了抗微生物的组合物，其包含碘离子和硫氰酸根离子、氧化还原酶及其相应的可氧化底物、以及乳过氧化物酶。该文件仅描述了在至多72小时内对细菌的活性，并未描述该系统的治疗应用。
[0018]本发明提出了由现有技术转变的范例。其描述了用于治疗感染的广谱的真正的杀菌剂。
[0019]?本发明显示由LP系统或通过其他手段生产的活性氧物质(ROS)事实上根据浓度依赖的剂量应答，在多种培养基及跨越大范围的PH和温度下，为大量的致病革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌的杀细菌剂(参见发明详述)。我们还显示，ROS能够完全杀死在多种表面上的生物膜中生长的细菌和真菌。
[0020]?在一系列详细的受控的试验中，已经显示该杀细菌活性由于ROS的作用而是独特的，并且就这一点而言，在不具有残余的过氧化氢存在并且缺乏任何其他的协同试剂(例如乳铁蛋白、季铵化合物、脂肪酸等)下，ROS是有效的(参见发明详述)。
[0021]?可以与用于抗生素和其他抗微生物治疗试剂相同的方式，计算在特定的环境中完全杀死特定的细菌菌群所需的ROS浓度，并用于生成精确的剂量应答/最低抑菌浓度信息(参加发明详述)。
[0022]?给药这些剂量水平的ROS物质可以用于完全杀死多种革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌病原体，包括由牛乳房和哺乳动物的肺分离的那些；作为附着在多种表面上的生物膜生长的那些；由患者分离的那些；以及对多种抗生素具有抗性的那些(参见发明详述)。
[0023]?此外，还显示，可以例如在牛乳房中使用LP系统，在治疗位点处生成所需的ROS的杀细菌及治疗浓度，或者可以在外部，在感染位点处制备ROS物质，并在缺乏允许成功治疗并消除细菌感染的任何其他活性组分下进行传递。
[0024]因此，本技术提供了在例如医疗器械的表面上限制微生物感染和生物膜生长的独特方式。
[0025]发明目的
[0026]本发明的第一目的为提供用于治疗微生物感染的经改善的组合物。另一个目的为提供能够杀死细菌、病毒、真菌和酵母菌(与延缓细菌、病毒、真菌和酵母菌的生长相对)的组合物。另一个目的为提供能够杀死对抗生素具有抗性的有机体的组合物。
[0027]乳腺炎
[0028]另一个目的为提供在未使用抗生素的条件下用于治疗临床和亚临床乳腺炎的组合物。本发明的另一个目的为提供对乳腺炎的治疗，其无需在治疗过程中将牛奶丢弃。
[0029]本发明的另一个目的为提供容易给药的乳腺炎的临床溶液。在上文所讨论的现有技术中，所述的反应如下:如果将所有的成分混合在一起，则反应立即发生，由此得到短的货架期。在现有技术中，必须具有在给药所述产物之前进行混合的2种等分液，由此开始反应。另一个缺点为这样的事实:葡萄糖的浓度总是为限定因素。为了在临床情况下具有足够的葡萄糖，必须加入浓缩的来源。这导致了溶解度的问题。此外，加入外源葡萄糖还可以在牛奶的下游处理中产生问题，并且还可以导致消费者关于消费用牛奶的风味和甜味的问题。
[0030]本发明人检验了牛奶本身的特征，以试图回避葡萄糖给药的需要。牛奶为乳糖来源。B-半乳糖苷酶被分解并将二糖转化为其构成成分(葡萄糖和半乳糖)的酶。由此，酶的使用依赖于牛奶本身的重要构成成分，从而开发LP系统在感染位点处生成活性氧物质的能力。当所述的系统直到葡萄糖存在时才发生反应时(并且直到B-半乳糖苷酶与牛奶接触时，才生成葡萄糖)，则使用所述的酶使得给药所述的混合物更加容易。这比在使用前不得不给药葡萄糖或者实际上的合适的单糖或二糖更有用，从而无需使用浓缩的且有问题的糖溶液。
[0031]肺的感染 [0032]本发明的另一个目的为治疗大量的其他的细菌感染。药品的传递以及对抗生素的抗性为治疗囊性纤维化(CF)和肺结核(TB)的主要问题。抗生素抗性通常在仅有亚抑制浓度的药品到达目标位点(即，肺)时发生。这种情况通常导致慢性感染，严重的损害了患者的健康。肺的成分的理想传递为喷洒喷雾，从而直接进入肺。这具有这样的优点:所述的成分在正确的位点处并且在正确的浓度下与有机体直接相互作用。如果所述的成分以口服给药或者通过血流给药，则需要更高的浓度来得到相同的效果。当使用抗生素时，这导致使用高浓度的药品，增加了抗性的几率或者与药品的反应。由于本系统的成分天然存在于哺乳动物系统(或者在饲料中规律使用)中，所以与它们的反应是极不可能的，这是在药品反应是通常的情况下使用抗生素进行治疗的优点。在患有CF的患者中，在肺中，硫氰酸盐的天然水平由于膜中水的调节失败而减少，从而降低了器官中天然发现的乳过氧化物酶系统的效力。外部加入对诊断患有CF的人propylactically作用的或者用于治疗已经发展成肺感染的患者的活性氧物质。此类喷洒喷雾具有在医院使用的潜力，从而减少手术过程(其中肌体腔对环境是开放的并处于风险下)中的感染，特别是由对抗生素具有抗性的细菌菌株所引起的那些感染。
[0033]烧伤/皮肤/ 口
[0034]所述技术的合适目标的其他感染为烧伤或开放性伤口引起的那些。就药品反应、安全、效力和抗性而言，使用所述的系统高于目前抗生素治疗方案的优点与治疗CF或TB中上文所述的那些相似。本发明人显示活性氧物质在治疗生物膜基的细胞(附着于固体层的那些)中是有效的。这为大多记录于TB/CF患者的肺、开放性伤口或烧伤中的细菌表现型。这种表现型赋予细菌以对抗多种抗生素的广泛的抗性("Antibiotic resistance ofbacteria in biofilms〃，Stewart&Costerton, 2001，The Lancet, 358，135-138)。
[0035]此外，就多数目的而言，所述系统的形式还起到一般抗细菌溶液的作用。例如，包含抗细菌系统的漱口剂有助于防止生物膜在口内形成。同样，抗细菌的鼻洗剂可以用于帮助减少窦道问题，例如鼻窦炎或敏感性鼻炎。目前，使用类固醇和含盐的鼻洗剂。此外，抗细菌的含盐洗剂还有助于与鼻腔内的细菌菌落战斗。
[0036]医疗器械
[0037]此外，使用活性氧物质(例如通过卤代过氧化物酶基系统生成的那些)在治疗和预防植入医疗器械上的细菌感染中具有多个优点。感染(对抗性的生物膜形式)在多种器械(例如导管)中是特别普通的。浸溃或涂敷多种酶的器械能够与血液中天然存在的底物反应。
[0038]一般的抗细菌洗剂
[0039]本发明的另一个目的为提供一种组合物，其用作用于多目的产物的一般的、安全的抗细菌洗剂。所提出的系统在洗涤/除去表面、管、啤酒管线、烹饪器材等的细菌中是有效的。[0040]抗真菌试剂
[0041]感染可有由于酵母菌或真菌的生长以及细菌的生长而发生。如此，能够发挥抗微生物活性(与抗细菌活性相对，其为使用抗生素的情况)的治疗方案是非常有利的。最后，针对值得注意的2种真菌菌株测试活性氧物质(次碘酸盐)的抗微生物活性(下文的实施例18)。真菌的假丝酵母菌株通常描述为机会病原体。它们可以导致多种皮肤状况，例如外阴阴道炎和尿路感染。它们在HIV患者和其他免疫系统损伤的患者中是普遍的。酿酒酵母(Saccharomyces cerevesiae)(通常称为酵母菌或烘焙者酵母菌)为食品生产中的重要有机体。此外，其为饮品工业提出了大问题，其为在啤酒管线中发现的典型有机体，并且为饮料腐败的原因。如此，本发明的抗微生物活性氧物质为治疗或控制真菌感染或清除表面从而消除真菌污染的良好的治疗候选物。[0042]此外，本发明发现了作为抗病毒试剂的用途。
[0043]发明概述
[0044]根据本发明，提供了杀灭微生物的组合物，其包含能够生产反应性物质的活性氧物质或成分，该组合物在24小时的时间内能够传递活性氧物质至至少0.4毫摩尔/升的水平。该组合物在24小时的时间内能够传递活性氧物质至至少0.5毫摩尔/升、至少0.6毫摩尔/升、至少0.7毫摩尔/升、至少0.8毫摩尔/升、至少0.9毫摩尔/升、至少1.0毫摩尔/升、至少2.0毫摩尔/升的水平。
[0045]所述的活性氧物质可以通过过氧化物酶、用于过氧化物酶的底物以及过氧化氢的
反应来生产。
[0046]就杀灭微生物而言，我们是指能够杀死诸如细菌、病毒、真菌和酵母菌之类的微生物的组合物，这与简单的延缓它们的生长相对。杀灭微生物的组合物能够杀死在其所施加的环境中存在的至少90%、优选为至少95%、更优选为至少99%、更优选为至少99.99%的微生物。
[0047]此外，所述的组合物能够杀死抗生素抗性有机体。
[0048]所述的组合物的活性氧物质可以包含卤代硫氰酸盐(也称为亚硫氰酸盐，SCN0—)。
[0049]此外，所述的组合物的活性氧物质还可以包含次碘酸盐(10一也称为次碘酸盐)
[0050]此外，所述的组合物的活性氧物质还可以包含次氯酸盐(C10—)。
[0051]在另一个方面中，本发明提供了杀灭微生物的组合物，其额外包含过氧化物酶和氧化还原酶。该组合物特别适用于治疗囊性纤维化或肺结核患者的感染、烧伤受害者或者具有插入的医疗器械的患者。
[0052]在另一个方面中，本发明提供了杀灭微生物的组合物，其额外包含过氧化物酶、氧化还原酶以及糖苷水解酶。该组合物特别适用于治疗乳腺炎感染。
[0053]此外，所述的组合物还可以包含用于过氧化物酶的底物。
[0054]过氧化物酶可以为卤代过氧化物酶。该卤代过氧化物酶可以为乳过氧化物酶、氯代过氧化物酶、溴代过氧化物酶或碘代过氧化物酶。合适的氯代过氧化物酶包括髓过氧化物酶和嗜曙红细胞过氧化物酶。合适的溴代过氧化物酶包括卵过氧化物酶、钒溴过氧化物酶和Murex snail bromoperoxidase。合适的碘代过氧化物酶包括辣根过氧化物酶和甲状腺过氧化物酶。
[0055]如果使用乳过氧化物酶，则所述的组合物可以进一步包含碘化钾或碘化钠、或者硫氰酸钾或硫氰酸钠作为底物。氯代过氧化物酶与牛奶、血液等中容易利用的氯离子反应，这样不必总数添加氯离子。如果使用溴代过氧化物酶或碘代过氧化物酶，则底物可以为分别为溴离子或碘离子的来源。
[0056]卤代过氧化物酶与可利用的过氧化氢以及合适的底物(碘化物/溴化物/氯化物或硫氰酸盐)反应，从而生产抗细菌的反应性物质。糖苷水解酶可以为半乳糖苷酶，其将牛奶中随意可得的乳糖转化为葡萄糖和半乳糖。
[0057]氧化还原酶可以为葡萄糖氧化酶，其与所得的葡萄糖反应，从而生产过氧化氢。相似地，还可以使用半乳糖氧化酶，从而与半乳糖反应，由此生产过氧化氢。
[0058]优选地，所述的组合物可以进一步包含二糖。该二糖随后可以被其相应的糖苷水解酶水解，例如蔗糖和蔗糖酶，从而允许单糖的释放，通过使用相应的氧化还原酶，上述过程由此可以起到额外的过氧化氢的来源的作用。
[0059]此外，可以加入包含多于2个糖分子、并且被分解生成过氧化氢来源的寡糖或多糖。
[0060]在一些实施方案中，所述的组合物包含传递过氧化氢来源的2种酶；将二糖分解成构成成分的单糖的糖苷水解酶；以及与单糖反应从而释放过氧化氢的其他的氧化还原酶。
[0061]所述的组合物可以包含额外的过氧化氢来源。一种额外的过氧化氢来源为外源加入过氧化氢溶液，或者通过合适的过氧化氢过水合物(过碳酸钠)释放。
[0062]备选地或者此外，多种酶可以用于生产过氧化氢。黄嘌呤氧化还原酶/氧化酶与次黄嘌呤或黄嘌呤(均存在于牛奶中)反应，从而生产过氧化氢。因此，可以将黄嘌呤氧化还原酶/氧化酶和/或黄嘌呤加入到所述的组合物中，从而生产过氧化氢。相似地，糖醇可以与它们的合适的氧化酶反应，从而生产过氧化氢来源。例如，甘油氧化酶与甘油反应，从而生产过氧化氢来源，因此，可以将甘油氧化酶/甘油加入到所述的组合物中。另一个实例为甘露醇与甘露醇氧化酶反应。此外，已知柠檬酸会释放过氧化氢，并由此还可以将其加入到所述的组合物中。相似地，L-氨基酸氧化酶为与游离的氨基酸(也存在于牛奶中)反应的酶，从而生产过氧化氢。相似地，该氨基酸的加入(具有或不具有L-氨基酸的补充)可以提供过氧化氢的来源。
[0063]本发明的方面证明在牛奶中具有特别有效的抗细菌品质，其中本发明提供了杀灭细菌的组合物，其额外包含过氧化物酶、氧化还原酶以及糖苷水解酶(具体为3 -半乳糖苷酶)。具体而言，所述的系统在高水平的生物负荷下，有效地完全杀死革兰氏阳性和革兰氏阴性有机体(即，消除108.1°细胞/ml)。根据现有技术，当WHO陈述乳过氧化物酶系统在生牛奶中主要发挥细菌抑制作用、并且在缺乏冰箱的条件下在生牛奶的运输过程中仅适用于通过此类手段在短期内限制细菌的生长时，本发明为惊人的发现(Import of an F AO/WHO Technical Meeting FAO Headquarters, Rome, Italy, 28November-2December2005)o其他研究者推论所述的系统中的任何杀灭细菌的活性均是由于过氧化氢成分，并且乳过氧化物酶系统为细菌抑制的(Thomas et al.，1994，"Antibacterial activity of hydrogenperoxide and the lactoperoxidase-hydrogen peroxide-thiocyanate system againstoral streptococci"，Infe ction and Immunity，Vol.62，N0.2，p529_535)。
[0064](6-半乳糖苷酶与牛奶中存在的乳糖反应，从而生产葡萄糖和半乳糖。所得的葡萄糖与葡萄糖氧化酶反应，从而生产过氧化氢。该过氧化氢与碘化钾/硫氰酸钾反应，从而产生抗细菌的作用。抗细菌作用是由乳过氧化物酶促进的，所述的乳过氧化物酶催化碘化物及其他合适的底物的过氧化。
[0065]依赖于牛奶中固有的乳糖可以取消高浓度葡萄糖溶液的使用，该溶液为内外情况中的限定因素，从而可以现场使用所述的产物。
[0066]在本发明的另一个方面中，提供了用于治疗感染或污染的组合物，其包含黄嘌呤氧化还原酶/氧化酶。所述的组合物可以进一步包含次黄嘌呤和/或黄嘌呤。此外，所述的组合物还可以包含氧化还原酶、糖苷水解酶或二糖。
[0067]在本发明的另一个方面中，提供了用于治疗感染或污染的组合物，其包含L-氨基酸氧化酶。所述的组合物可以进一步包含游离的氨基酸。此外，所述的组合物还可以包含氧化还原酶、糖苷水解酶或二糖。
[0068]本发明的组合物的一个潜力在于治疗牛(或其他哺乳动物)乳腺炎。其可以用于治疗临床及亚临床乳腺炎，并提供这样的优点:无需除去由大池塘得到的经治疗的牛奶。在所提出的溶液中存在的酶是安全的，并且潜在的底物(包括碘化钾或硫氰酸钾)在使用浓度下是安全的。所述的组合物不可能诱导对抗生素的抗性，这为另一个优点。此外，在2005年11月22日-12月2日在Rome，Italy举办的FA0/WH0技术会议的报告表明乳过氧化物酶系统不会将非正常代谢物的物质引入到牛奶中。
[0069]使用生产本发明的杀灭生物的活性氧物质的酶提供了在一段时间内连续生产组合物的手段，其在与抗生素 治疗时是有利的，其中必须另外加入新的分子，从而补充抗微生物的活性。
[0070]适用于治疗乳腺炎的一种产物为加载7-10mL溶液(通过补充胶质来增加其粘度)的乳房内输注传递器械(可任选地提供为双桶注射器)，其中所述的溶液包含2mg葡萄糖氧化酶(-200单位/mg)、0.5mLP -半乳糖苷酶(>2，600单位/mg)、4mg乳过氧化物酶(>80单位/mg)、以及100-150mg碘化钾，从而用于生产杀灭细菌的活性氧物质，以治疗乳腺炎。
[0071]其他的制备物可以将酶保持为在使用前与底物的溶液混合的冻干粉，由此有助于在不可能冷藏的情况下的反应物的货架期。可以根据动物(羊等)的重量、牛奶的生产情况以及感染乳房中生物负荷的水平来生产其他相似的产物。此外，尤其适用溴化物/硫氰酸盐替代碘化物、使用不同的氧化还原酶、或者补充不同的过氧化氢的可能来源、或者使用黄嘌呤氧化还原酶(包含黄嘌呤氧化酶的复合酶)或L-氨基酸氧化酶(氧化还原酶家族的成员)方法来制备多种成分的不同组合。备选产物涉及使用任何其他的酶来替代乳过氧化物酶，其中所述的任何其他的酶与过氧化氢及合适的底物反应，从而生产抗微生物物质。其中，氯代过氧化物酶适用于加载7-10mL溶液(通过补充胶质来增加其粘度)，其中所述的溶液包含2mg葡萄糖氧化酶(-200单位/mg)、0.5mL^ -半乳糖苷酶(>2，600单位/mg)以及50 u I氯代过氧化物酶(>11,100单位/ml)。
[0072]在多种配制物中，之前已经描述了乳过氧化物酶系统(美国专利号US4726948和 US5607681)。 World Health Organisation (2005 年 11 月 28 日-12 月 2 日 FA0/WH0Technical Meeting FAO Headquarters, Rome, Italy的报告)建议在缺乏冷藏的第三世界国家，所述的系统用作增加牛奶的寿命的方法。WHO建议使用过碳酸钠作为过氧化氢来源的系统。在此提出的本发明的一个方面不同于已知的LP系统，不同之处在于本发明使用了过氧化氢的备选来源，前体是牛奶中存在的乳糖依次分解。此外，备选方法是使用氯代过氧化物酶替代乳过氧化物酶，其中所述的氯代过氧化物酶与牛奶中已经存在的盐反应，从而消除了向乳房中补充卤化物的需要。本发明这一方面的任一种形式(如过氧化物酶/氯代过氧化物酶)提供了由于现有制备物的优点，其在于这两种形式直到向乳房给药前都不会开始反应。各种形式在4°C下均具有长的货架期。WHO讨论了在它们所述的LP系统的对应物中存在的大量问题，而这些问题在本文所述的本发明的方面中不会发生。WHO提出的系统将香包形式的硫氰酸盐和过碳酸盐粉末传递至牛奶。粉末状的硫氰酸盐为吸湿性的，并且经过一段时间会降解，并且过碳酸钠作为过氧化氢来源可以导致氧的形式，这会使香袋破裂及破坏。
[0073]本文所描述的本发明改善了Kussendrager and van Hooi jdonk, 2000所述的乳过氧化物酶系统(Lactoperoxisdase:physico-chemicalproperties,occurrence, mechanism of action and applications.British Journal ofNutrition，81，519-525)。在治疗乳腺炎时，其使用了牛奶本身的重要组分一乳糖，从而驱动反应物生产特定需要浓度的杀灭细菌的活性氧物质，从而消除感染。与过碳酸钠相对，补充2种酶(3 -半乳糖苷酶及葡萄糖氧化酶)允许缓慢持久地释放可以连续地生产受控水平的杀灭细菌试剂所需的过氧化氢。由于在所提出的环境下的乳糖的可用性，过氧化氢在反应中不会成为限定因素。相对少量的(6-半乳糖苷酶证明与补充的大量葡萄糖同样有效。
[0074]本发明改善了在哺乳动物中天然发现的乳过氧化物酶系统，这是由于该系统调节了存在的过氧化氢的水平(以及实际上任何其他的成分)。在典型的感染过程中，过氧化氢的水平被细菌的触媒活性所抑制，由此降低了该系统的效力。过氧化氢的可用性低导致很多研究者认为乳过氧化物酶系统的抗微生物本性是“可疑的”(Rainard&Riollet2006, "Innate immunity of the bovine mammary glancT, VeterinaryResearch37，369-400;Sakai et al.，2008，"Generation of hydrogen peroxide by a lowmolecular weight compound in whey of Holstein dairy ccms"， Journal of dairyResearch,Journal of Dairy Research，75，257-261;Sakai et al.，2008，"Productionof hydrogen peroxide by a small molecular mass compound in milk fromHolstein cows with high and low milk somatic cell count"，Journal of DairyResearch, 75，335-339)。
[0075]使用黄嘌呤氧化还原酶/氧化酶、或者L-氨基酸氧化酶作为过氧化氢来源的本发明的实施方案改善了所述的技术，既无需补充糖(使用牛奶本身的构成成分)，也不会改变牛奶的风味(就其甜味而言)。
[0076]与乳过 氧化物酶系统有关的提交的专利(US4726945和US5607681)用于局部治疗，并且主要设计为减少存在的细菌的生长的方式(在溶液中，例如离子乳液，或者粉刺或运动员足部的治疗；或者实际上在动物饲料中作为预防剂)。本发明提供了作为抗生素方案的备选方案来治疗“全面”细菌感染的新手段。使用本发明，在其多个方面(在体外及体内)中，已经显示出高水平的杀灭细菌的活性。
[0077]技术上的改变，即，用于生产杀灭细菌的活性氧物质所使用的酶和底物的类型，可以用于治疗其他类型的细菌感染。
[0078]根据本发明的抗微生物的鼻洗剂产物包含所述的系统的所需的成分。这些成分包括合适的过氧化物酶，例如乳过氧化物酶或氯代过氧化物酶；合适的底物(例如碘离子、硫氰酸根离子或氯离子)。相似地，可任选地通过单糖及其分解酶(例如葡萄糖和葡萄糖氧化酶)、或过氧化氢释放分子(例如过碳酸盐或柠檬酸)来提供过氧化氢来源。这些成分和底物可以以存在于香袋中的盐的干粉/冻干的酶的形式补充，所述的盐的干粉/冻干的酶可以在使用前再水合。使用盐水溶液(或者将额外的氯化钠加入到香袋中)可以调节所需的盐度。相似地，使用过碳酸钠可以调节酸性。干粉形式的系统可以允许产物保持货架期，减小产物的体积从而仅需要水来“活化”所述的系统。
[0079] 用于治疗CF/TB的组合物可以为通过喷洒喷雾手段传递至肺的溶液，其可以将本发明的所需的成分(乳过氧化物酶或氯代过氧化物酶、所需的底物(硫氰酸盐/氯化物)以及过氧化氢来源(葡萄糖及葡萄糖氧化酶；或者其他可行的酶方法，例如黄嘌呤氧化还原酶/氧化酶及次黄嘌呤/黄嘌呤、或者L-氨基酸氧化酶及L-氨基酸；或者通过加入过水合物，例如过碳酸钠；或者通过直接加入过氧化氢溶液))传递至肺。可以通过分离某些成分来实现溶液的储存，从而确保反应仅在传递至肺时发生。如此，一种溶液可以包含卤代过氧化物酶和葡萄糖，并且可以与包含底物和葡萄糖氧化酶的另一种溶液混合。这些成分的混合将开始反应，从而生产高度抗细菌活性的物质，该物质可以以给定的量通过喷洒器传递至肺。
[0080]可以根据人类的肺来调整各成分的浓度，而且可以为与上文所述的用于乳腺炎治疗的那些同样可能的最大级别。相似地，相同的整体传递机制可以用于一般的抗细菌咽喉
喷雾，其无需喷雾。
[0081]通过本发明高效地根除生物膜细胞的能力(参见本发明实施例3的详细描述)赋予了超过目前使用的抗微生物治疗的显著改善，已知目前使用的抗微生物治疗在治疗肺的囊性纤维化感染中是无效的，这是因为假单胞菌菌株表现出对抗生素更高的耐受性("Differences in biofilm formation and antimicrobial resistance of Pseudomonasaeruginosa isolated from airways of mechanically ventilated patients andcystic fibrosis patients^, Fricks-Lima et al., 2011,International Journal ofAntimicrobial Agents, 37(4), 309-315)。
[0082]此外，本发明的一个实施方案还提供了治疗烧伤患者的新方法。使用能够生产抗微生物物质的酶(尤其是卤代过氧化物酶，例如乳过氧化物/氯代过氧化物酶；以及氧化还原酶，例如葡萄糖氧化酶)浸溃的膏状药可以浸于凝胶基溶液中，所述的溶液包含生产抗细菌化合物所需的组分；潜在的底物，尤其是碘化物/硫氰酸盐/氯化物；以及与氧化还原酶反应的单体，尤其是葡萄糖。可以将该膏状药放置于所需的伤口上，从而允许安全地释放高度抗细菌的化合物，由此保持组织修复所需的安全需氧环境。
[0083]此外，各成分的浓度可以与上文所述的用于治疗乳腺炎的浓度相似。可以通过改变氧化还原酶和糖，通过其他酶反应(L-氨基酸氧化酶和L-氨基酸、黄嘌呤氧化还原酶/氧化酶以及黄嘌呤/次黄嘌呤)，通过加入诸如过氧酸钠之类的过水合物，或者直接加入过氧化氢溶液来使用生产过氧化氢的备选方法。
[0084]使用了卤代过氧化物酶基系统的本发明的实施方案还可以用于改善医疗器械的物理性质，从而限制在植入患者的过程中引起感染的几率。该方法是安全的，限定了药品的反应或抗性，而这通常是使用抗生素会产生的情况。所需的酶(乳过氧化物酶或卤代过氧化物酶，以及氧化还原酶、葡萄糖氧化酶和/或额外的地位)浸溃在器械的表面上是可行的传递方法。通常，驱动反应所需的底物(尤其是葡萄糖和硫氰酸盐/氯化物)存在于血液、唾液、牛奶和尿中，由此反应在酶和/或额外的底物的缓慢释放时发生。酶的缓慢释放可以通过电荷手段将它们锚定/涂敷在表面(浸溃的可生物降解的聚合物形式)上来进行。当聚合物降解时，新的酶分子是游离的，从而与通过器械上的底物反应。在浸溃后，在最初数天内这些酶的稳定释放将在重要的机会窗口(其中感染/生物膜通常会形成)保持器械的无菌。
[0085]可以通过将2种溶液(或可行的，将它们的干粉溶于水中)混合来生产一般的抗细菌溶液。例如，可以通过将过氧化物酶(例如氯代过氧化物酶或乳过氧化物酶)、合适的底物(可任选地盐形式，例如碘化钠/硫氰酸钠/或氯化钠)以及过氧化氢(廉价来源可以包括柠檬酸、过碳酸盐、过氧化氢本身、或与合适的酶发生反应的糖以及合适的酶，例如葡萄糖和葡萄糖氧化酶)的粗来源混合来制备抗细菌溶液。本发明的这一方面可以通过混合溶液中的各成分来活化。可以将溶液传递至需要清洁的表面。此类实例包括啤酒管线、陶瓷表面、金属表面等，并且可以在医院、工厂、厨房等地使用。所述的溶液可以是相对无毒的，并且不会生产与许多清洁产物(例如漂白剂)有关的气味。此外，诸如乳铁蛋白之类的蛋白质可以补充至所述的系统中，从而增加效力。已知乳铁蛋白有助于使细菌生物膜破裂，并由此可以起到强调产物的抗微生物本性的作用。 [0086]同样，所提出的组合物可以在给药感染位点之前预制备或活化。
[0087]发明详述
[0088]实施例1
[0089]通过向7mL无菌水中加入150mg碘化钾、4mg乳过氧化物酶(>80单位/mg)以及2mg葡萄糖氧化酶(-200单位/mg)来生产抗微生物组合物。该实施方案被称为“K1-Dose-150”。相似地，使用150mg硫氰酸钾制备组合物，并且该组合物被称为“Thio-Dose-150”。使用双倍稀释96孔板生长测试基方法来测定这些组合物的抗微生物性质。将组合物的等分液加入到包含107_8个细菌细胞的150 ill生长培养基(存在有1-2%葡萄糖)中，并使最终体积为300 yl。通过除去150 ill混合物来双倍稀释组合物的浓度，并转移至包含150 ill相同的生长培养基的下一个孔中，其中所述的培养基缺少生产ROS的成分。在595nm下，在24小时内测量培养基的光学密度。完全抑制细菌所需的浓度为在24小时后在培养基中不会出现可见的生长迹象的组合物的使用浓度。对照包括这样的孔，其中未补充所述的组合物，或者其中一种成分由所述的组合物中除去。该方法用于测定所述的组合物对抗多种微生物有机体的抗微生物效力，其中所述的微生物有机体尤其为大肠杆菌(Escherichiacoli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、绿胺杆菌(Psuedomonas aeruginosa)、洋葱伯克霍尔德菌(Burkholderia cepaciae)、Streptococcus dysglactiae、乳房链球菌(Streptococcus uberis)、非溶血大肠杆菌。这些有机体通常被描述为多种感染的病原体(causative agent),其中所述的感染尤其为牛乳腺炎、囊性纤维化肺感染、皮肤感染、烧伤感染等，并由此代表了将使用所述的组合物来进行治疗的多种有机体。有机体对组合物的相对易感性在表1中有所描述(比例表示组合物的最低稀释，在该稀释条件下没有生长被记录，例如1:800是使组合物被稀释至这样的当量:每SOOiU生长培养基有Iul的组合物)，并且为组合物抑制生长的最低浓度。此外，还提供了经过24小时生产的抗微生物活性氧物质(ROS)的估计水平(也参见以下实施例19)。[0090]表1.细菌菌株对“Thio-Dose-150”和“K1-Dose-150”的易感性。MIC表示活性氧物质的水平，低于该水平时，未记录有杀灭细菌的作用(经过24小时生产的，单位为毫摩
/升)。
[0091]
【权利要求】
1.一种杀灭微生物的组合物，其包含活性氧物质或能够生产活性物质的成分，所述的组合物经过24小时的时间能够传递所述的活性氧物质达到至少0.4毫摩/升的水平。
2.权利要求1所述的组合物，其经过24小时的时间能够传递所述的活性氧物质达到至少0.5毫摩/升的水平。
3.权利要求1或2所述的组合物，其中所述的活性氧物质是通过过氧化物酶、该过氧化物酶的底物以及过氧化氢发生反应而生产的。
4.任一之前的权利要求所述的组合物，其中所述的活性氧物质选自次硫氰酸盐(亚硫氰酸盐，SCNO_)、次碘酸盐(10_)以及次氯酸盐(CLO_)。
5.权利要求3或4所述的组合物，其中所述的过氧化物酶选自乳过氧化物酶、氯代过氧化物酶、溴代过氧化物酶以及碘代氧化酶。
6.权利要求5所述的组合物，其包含乳过氧化物酶，并且进一步包含碘离子或硫氰酸盐离子。
7.权利要求5所述的组合物，其包含氯代过氧化物酶，并且进一步包含氯离子。
8.权利要求3至7的任意一项所述的组合物，其中所述的过氧化氢来源为所述的过氧化氢的溶液。
9.任一之前的权利要求所述的组合物，其中所述的过氧化氢由释放过氧化氢的化合物释放或者通过酶方法释放，其中所述的释放过氧化氢的化合物选自过碳酸盐、柠檬酸和过水合物。
10.权利要求3至9的任意一项所述的组合物，其中所述的过氧化氢通过糖及其合适的氧化还原酶之间的酶反应来生产。
11.权利要求10所述的组合物，其中所述的氧化还原酶为半乳糖氧化酶和/或葡萄糖氧化酶。
12.权利要求11所述的组合物，其进一步包含游离的单糖。
13.权利要求3至12的任意一项所述的组合物，其进一步包含二糖及其相应的糖苷水解酶，从而生产过氧化氢来源。
14.权利要求13所述的组合物，其中所述的糖苷水解酶为(6-半乳糖苷酶，而二糖为乳糖。
15.任一之前的权利要求所述的组合物，其中糖苷水解酶和/或氧化还原酶用于与在所述的感染位点存在的糖反应。
16.权利要求10所述的组合物，其中所述的过氧化氢的另一个来源衍生自多元醇(糖醇)与其相对的氧化酶的反应。
17.权利要求16所述的组合物，其中所述的多元醇为甘油，其相对的氧化酶为甘油氧化酶，或者其中所述的多元醇为甘露醇，其相对的氧化酶为甘露醇氧化酶。
18.权利要求2至17的任意一项所述的组合物，其中所述的过氧化氢由L-氨基酸与L-氨基酸氧化酶、或者黄嘌呤(或次黄嘌呤)与黄嘌呤氧化酶的酶反应而生产。
19.任一之前的权利要求所述的组合物，其进一步包含次黄嘌呤和/或黄嘌呤。
20.权利要求19所述的组合物，其进一步包含游离的氨基酸。
21.任一之前的权利要求所述的组合物，其额外包含乳铁蛋白或糖皮质激素。
22.权利要求21所述的组合物，其中所述的糖皮质激素为泼尼松或强的松。
23.任一之前的权利要求所述的组合物，其适用于乳房内输注或喷雾；用作抗微生物的溶液、乳液或干燥产物；用作加入到用于皮肤烧伤损伤的膏状药中的抗微生物溶液；用作作为鼻洗剂的抗微生物溶液；用作作为表面清洁剂的抗微生物溶液。
24.一种加载有任一之前的权利要求所述的组合物的乳房内输注传递器械。
25.任一之前的权利要求所述的组合物，其中所述的溶液被制备为乳液或干燥的产物。
26.任一之前的权利要求所述的组合物，其中所述的化合物附着在医疗器械的表面上。
27.任一之前的权利要求所述的组合物，其中所述的成分适用于依次或累积地传递至所述的感染位点。
28.任一之前的权利要求所述的组合物，其中允许所述的成分发生反应，然后加入到所述的感染位点。
29.任一之前的权利要求所述的组合物，其中允许所述的成分发生反应，然后加入到所述的感染位点，并且使用过 氧化氢酶治疗以除去过多的过氧化氢。
【文档编号】A61K33/18GK103648522SQ201280018449
【公开日】2014年3月19日 申请日期:2012年4月16日 优先权日:2011年4月15日
【发明者】V·奥弗莱厄蒂, P·麦凯 申请人:爱尔兰国立高威大学