漆黄素作为制备抗凝血、抗血栓形成和心肌保护作用药物的应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种漆黄素作为制备抗凝血、抗血栓形成和心肌保护作用药物的应用，其能降低缺血心肌细胞炎症反应，具有抗凝血、抗血栓形成和心肌保护作用。本发明采用的技术方案为：漆黄素作为制备抗凝血药物的应用，为抑制ADP诱导的血小板聚集、抑制血小板释放、降低血清Fg和vWF含量而产生抗凝血作用。漆黄素作为制备抗血栓形成药物的应用，为显著延长CT、PT、TT和APTT，间接起到抗血栓形成作用。漆黄素作为制备对缺血/再灌注心肌细胞起保护作用药物的应用，通过抑制炎症细胞侵润、MMP-9和NF-kB的表达、NF-kB核转移、心肌细胞凋亡等途径降低缺血心肌细胞炎症反应，减少损伤心肌的梗死面积，产生对缺血心肌细胞的保护作用。
【专利说明】漆黄素作为制备抗凝血、抗血栓形成和心肌保护作用药物的应用
[0001]一、【技术领域】:
本发明涉及一种漆黄素作为制备抗凝血、抗血栓形成和心肌保护作用药物的应用。
[0002]二、【背景技术】 :
心肌缺血 / 再灌注损伤(myocardial ischemia reperfusion injury, MIRI)是冠心病、心肌梗死等疾病发病和防治的主要因素，如何减轻MIRI已成为防治缺血性心脏病和心脏介入治疗方面的重要课题。再灌注后细胞凋亡是心肌缺血再灌注损伤发生的重要机制之一，抑制凋亡可增加心脏射血分数，减少再灌注心脏发生心功能不全的可能性。冠心病是导致人类死亡的主要病因之一，平均每年约380万男性和340万女性死于该病，据统计因为心肌再灌注损伤导致患者死亡或心力衰竭的发生率分别为10%和25%[1-3]，因此，寻找MIRI病因，探究其发病机制，寻找其治疗方案，研制有效药物有着非常重要的意义。
[0003]三、
【发明内容】
:
本发明的目的在于提供一种漆黄素作为制备抗凝血、抗血栓形成和心肌保护作用药物的应用，其能降低缺血心肌细胞炎症反应，减少损伤心肌的梗死面积，产生对缺血心肌细胞的保护作用。具有抗凝血、抗血栓形成和心肌保护作用。
[0004]为实现上述目的，本发明采用的技术方案为:
漆黄素作为制备抗凝血药物的应用，为抑制ADP诱导的血小板聚集、抑制血小板释放、降低血清Fg和vWF含量而产生抗凝血作用。
[0005]漆黄素作为制备抗血栓形成药物的应用，为显著延长CT、PT、TT和APTT，间接起到抗血栓形成作用。
[0006]漆黄素作为制备对缺血/再灌注心肌细胞起保护作用药物的应用，通过抑制炎症细胞侵润、MMP-9和NF-kB的表达、NF-kB核转移、心肌细胞凋亡等途径降低缺血心肌细胞炎症反应，减少损伤心肌的梗死面积，产生对缺血心肌细胞的保护作用。
[0007]漆黄素作为制备抗凝血、抗血栓形成和心肌保护作用药物的应用，其特征在于:漆黄素的剂量范围大鼠为为5~45 mg/kg，换算为人剂量为0.8~7.2 mg/kg。
[0008]漆黄素作为制备抗凝血、抗血栓形成和心肌保护作用药物的应用，其特征在于:漆黄素的制成品为药品制剂或保健食品。
[0009]漆黄素作为制备抗凝血、抗血栓形成和心肌保护作用药物的应用，其特征在于:漆黄素的剂型为经口、肌肉、静脉、透皮吸收的制剂及外用制剂。
[0010]与现有技术相比，本发明具有的优点和效果如下:
本发明涉及15mg/kg~45mg/kg的漆黄素对心肌缺血/再灌注心肌细胞的保护作用及机制。所述的漆黄素对心肌缺血/再灌注大鼠有抗血栓活性，具有抗血小板聚集活性，其机制可能为显著延长CT、PT、TT、APTT，降低血清vWF含量，其15mg/kg~45mg/kg剂量效果与槲皮素或阿司匹林效果相当。漆黄素通过抑制炎症细胞侵润、MMP-9和NF-kB的表达、NF-kB核转移、心肌细胞凋亡等途径降低缺血心肌细胞炎症反应，减少损伤心肌的梗死面积，产生对缺血心肌细胞的保护作用。通过对比试验研究表明，本发明具有抗凝血、抗血栓形成和心肌保护作用。
[0011]四、【专利附图】
【附图说明】:
图1可见假手术组大鼠的心电图变化正常。
[0012]图2可见冠状动脉结扎后，心电图ST段高抬/T波高耸，标志造模成功。
[0013]图3为漆黄素对心肌缺血/再灌注大鼠全血凝血时间的影响(
i±SEM, n=12，与模型组比较，**Ρ〈0.01，*Ρ〈0.05)。
[0014]图4为漆黄素对心肌缺血/再灌注大鼠凝血酶原时间的影响(i 土SEM，n=12，与模型组比较，**ρ〈0.01，*Ρ〈0.05)。
[0015]图5为漆黄素对心肌缺血/再灌注大鼠凝血酶时间的影响(X ±SEM, η=12,
与模型组比较，**ρ〈0.01，*Ρ〈0.05)。
[0016]图6为漆黄素对心肌缺血/再灌注大鼠白陶土部分凝血活酶时间的影响G±SEM, n=12，与模型组比较，**Ρ〈0.01，*Ρ〈0.05)。
[0017]图7为漆黄素对心肌缺血/再灌注大鼠血浆vWF的影响(数据用? 土SEM表示，η=12，与模型组比较，**Ρ〈0.01，*Ρ〈0.05。与正常组相比，~Ρ〈0.05, 一Ρ〈0.01)。
[0018]图8为漆黄素对ADP诱导的人血小板聚集率的影响(η=12，**Ρ<0.01，*Ρ<0.05)。
[0019]图9为在20 μ M ADP和2 μ M NE诱导人血小板聚集下漆黄素和槲皮素的浓度抑制曲线。
[0020]图10为漆黄素对心肌缺血/再灌注大鼠心肌细胞凋亡率的影响(i 土 SEM，n=4，与模型组比较，**Ρ〈0.01，*Ρ〈0.05)。
[0021]图11为为漆黄素对心肌缺血/再灌注大鼠心肌细胞MMP-9表达的影响(i 土SEM，n=8，与模型组比较，**Ρ〈0.01，*Ρ〈0.05)。
[0022]图12为漆黄素对心肌缺血/再灌注大鼠心肌细胞NF-kB核转移细胞总数和比率的影响 G 土SEM，n=8，与模型组比较，**Ρ〈0.01，*Ρ〈0.05)。
[0023]图13为漆黄素对心肌缺血/再灌注大鼠心肌细胞NF-kB表达的影响(χ 土SEM，η=8，与模型组比较，**Ρ〈0.01，*Ρ〈0.05)。
[0024]图14为漆黄素对心肌缺血/再灌注大鼠心肌细胞梗塞面积的影响(i 土SEM，n=8，与模型组比较，**ρ〈0.01，*Ρ〈0.05)。
[0025]图15为漆黄素对心肌缺血/再灌注大鼠心肌细胞炎症细胞总数及炎症细胞百分率的影响(i ±SEM, n=8，与模型组比较，**Ρ〈0.01，*Ρ〈0.05)。
[0026]五、【具体实施方式】:
本发明为一种漆黄素作为制备抗凝血、抗血栓形成和心肌保护作用药物的应用，其具有抗凝血、抗血栓形成和心肌保护作用。具体体现在:
漆黄素作为制备抗凝血药物的应用，为抑制ADP诱导的血小板聚集、抑制血小板释放、降低血清Fg和vWF含量而产生抗凝血作用。
[0027]漆黄素作为制备抗血栓形成药物的应用，为显著延长CT、PT、TT和APTT，间接起到抗血栓形成作用。
[0028]漆黄素作为制备对缺血/再灌注心肌细胞起保护作用药物的应用，通过抑制炎症细胞侵润、MMP-9和NF-kB的表达、NF-kB核转移、心肌细胞凋亡等途径降低缺血心肌细胞炎症反应，减少损伤心肌的梗死面积，产生对缺血心肌细胞的保护作用。
[0029]在实际应用中，漆黄素的剂量范围为5~45 mg/kg ;漆黄素的制成品为药品制剂或保健食品；漆黄素的剂型为经口、肌肉、静脉、透皮吸收的制剂及外用制剂。
[0030]漆黄素具有抗凝血、抗血栓形成和心肌保护作用的实验:
方法: 84只SD大鼠，雌雄各半，随机分为七组，分别为假手术组(Shame operation)，模型组(Model),漆黄素(Fisetin)45 mg/kg、15 mg/kg、5 mg/kg 组,槲皮素组(Quercetin)和阿司匹林肠溶片组(Aspirin)阳性对照组。前两组用0.5%的CMC-Na溶液以10 ml/kg灌胃，其它各组分别用相应药物的0.5%CMC-Na溶液灌胃。7 d后，在10%的水合氯醛麻醉(350 mg/kg)下，结扎左冠状动脉前室间支30 min再灌注2 h，制备心肌缺血/再灌注损伤模型。随后，大鼠断尾，采血测全血凝血时间(CT) ；3.8%枸橼酸钠抗凝采集腹主动脉血，分离血浆，按试剂盒说明书检测血浆凝血酶原时间(PT)、凝血酶时间(TT)和凝血活酶时间(APTT)；ELISA法检测血浆中血管性假性血友病因子(vWF)水平。取缺血心肌，采用Annexinv/PI双染，流式细胞仪检测心肌细胞的凋亡情况；TTC染色法测定心肌梗死面积；HE染色法测定心肌细胞的病理性病变；免疫组化方法测定NF-kB和MMP-9的表达。结果:与模型组相比较，漆黄素各剂量组、槲皮素和阿司匹林组均显著延长了心肌缺血/再灌注大鼠CT、PT、TT和APTT时间(P〈0.01或P〈0.05)。模型组血浆vWF的含量均显著高于假手术组、漆黄素45mg/kg 和 15 mg/kg 剂量组、槲皮素(15 mg/kg)组和阿司匹林(47 mg/kg)组(Ρ〈0.05, P〈0.01 )。与假手术组比较，模型组心肌细胞排列紊乱、细胞壁损坏、细胞肿胀、甚至细胞核破裂、细胞颜色深浅不一以及吞噬细胞聚集。模型组心肌细胞的炎症细胞侵润率、凋亡率方面，ΜΜΡ-9表达、NF-kB表达和NF-kB核转移百分率均升高(P〈0.01或Ρ〈0.05)。漆黄素45 mg/kgU5mg/kg组、阳性对照组与缺血再灌注组比较，可维持心肌纤维完整性、细胞核正常性，可降低心肌细胞凋亡百分率、抑制MMP-9和NF-kB表达以及降低NF-kB核转移百分率(P〈0.01或P〈0.05)，其作用介于假手术组和模型组之间。漆黄素对缺血再灌损伤心肌的保护作用呈剂量依赖性。
[0031]结论:漆黄素对心肌缺血/再灌注大鼠有抗血栓活性，其机制可能为显著延长CT、PT、TT、APTT,降低血清VWF含量，其大、中剂量效果与槲皮素或阿司匹林效果相当。漆黄素通过抑制炎症细胞侵润、MMP-9和NF-kB的表达、NF-kB核转移、心肌细胞凋亡等途径降低缺血心肌细胞炎症反应，减少损伤心肌的梗死面积，产生对缺血心肌细胞的保护作用。
[0032]材料和方法 1.1动物
SD大鼠，雌雄各半，体重180-220 g，由西安交通大学医学院实验动物中心提供，实验动物生产许可证号:SCXK (陕)2007-001，实验动物使用许可证号:SYXK (陕)2007-003。所有动物均按照陕西省动物养护和使用委员会提供的指导原则进行对待。动物房室温(26±3)°C，相对湿度(30-70)%，每日人工照明12 h，每天上下午各换气0.5 h按性别分笼饲养，自由饮水，喂颗粒饲料。[0033]1.2药品和试剂
阿司匹林肠溶片，洛阳奥吉娜药业有限公司，批号121004 ；
95%乙醇，西安化学试剂厂，批号:120612 ；
枸橼酸钠，天津市天力化学试剂有限公司，批号20121108 ；
硫酸氢氯吡格雷片，济南乐康信药业有限公司，批号080301 ；
双嘧达莫注射液，山西亚保药业集团股份有限公司，批号:216126 ；
盐酸肾上腺素注射液，天津金耀氨基酸有限公司，批号070412 ；
PT试剂盒，上海太阳生物技术有限公司，批号2001092 ；
APTT试剂盒，上海太阳生物技术有限公司，批号2011102 ；
TT试剂盒，上海太阳生物技术有限公司，批号:2021036。
[0034]阿司匹林，Sigma，美国，货号A 2093-100G ;
漆黄素，陕西昌岳植物技术有限公司，批号121016 ；
阿司匹林肠溶片，华东医药(西安)博华制药有限公司，批号1103009 ；
槲皮素，陕西昌岳植物技术有限公司，批号121116 ；
水合氯醛，上海山浦化工有限公司，批号121004 ；
福尔马林，天津市天力化学试剂有限公司，批号20120708 ；
75%酒精，宝鸡市康利工贸有限公司，批号20130103 ；
二甲苯，天津市津东天正精细化学试剂厂，批号20081001 ；
磷酸氢二钠，天津市天力化学试剂有限公司，20121108 ；
磷酸二氢钠，天津市天力化学试剂有限公司，20121108 ；
生理盐水，天津市天力化学试剂有限公司，批号20110508 ；
2，3，5-氯化三苯基四氮唑(TTC，美国Sigma公司)，中国华东师范大学化工厂，
批号 20121122 ；
5%牛血清蛋白(BSA)，武汉博士德生物工程有限公司；
SABC，武汉博士德生物工程有限公司；
一抗(大鼠)，武汉博士德生物工程有限公司；
生物素化山羊抗大鼠IgG，武汉博士德生物工程有限公司；
链霉素亲和素-生物素-过氧化酶复合物免疫组化试剂(SABC)，武汉博士德生物工程有限公司；
二氨基苯甲氨(DAB)，武汉博士德生物工程有限公司；
免疫组化试剂盒NF-kB、MMP-9，武汉博士德生物工程公司；
凯基Annexin V-EGFP/PI细胞凋亡检测试剂盒，南京凯基生物科技发展有限公司；
1.3主要仪器
SC-2000型四通道血小板聚集仪型，上海天呈科技有限公司；
LDZ5-2尚;1_1、机，北点医用尚;1_1、机/)^ ；
BL-420F生物机能实验系统，成都泰盟科技有限公司；
FCR0502-UF除热原型超纯水机，青岛富勒姆科技有限公司；
动物人工呼吸机DH- 150，浙江大学医学仪器厂；
AB 135-S型电子分析天平，Mettler Toledo,瑞士；NICHIRYO自动移液器，日本；
XW-80A漩涡混合器，上海精科实业有限公司；
CQ-120超声波清洗机，上海跃进医用光学器械厂；
10 μ L、20 μ L微量进样器，上海安亭微量进样器厂；
HHS电热恒温水浴锅，江苏省医疗器械厂；
FACS Calibur 流式细胞仪，Becton Dickinson,美国；
Powerlab/8sp数据记录和分析系统，ADInstruments, Austrilia,澳大利亚；
Leica RM 2235型徕卡手动转轮切片机，德国徕卡；
Microm GmbH HM 505E Cryostat, Walldrof, Gernany,德国；
BL-420F生物机能实验系统，成都台盟科技有限公司；自动移液枪，NICHIRYO,日本；NIKON ECLIPSE BOI 显微镜，日本，分析系统 Image-Pro Plus 6.1 Windows S/N ;手术器械、
秒表等。
[0035]2试验方法
2.1心肌缺血/再灌注模型的制备
84只SD大鼠雌雄各半，随机分为七组。分别为:假手术组，模型组，漆黄素大、中、小剂量组，槲皮素组及阿司匹林肠溶片阳性对照组，手术组和缺血再灌注组每天用0.5% CMC-Na溶液灌胃，其它各组用相应药物的0.5% CMC-Na溶液灌胃。7 d天后，用10%水合氯溶液(4ml/kg)腹腔注射麻醉，仰卧固定，用电极插入大鼠四肢皮下记录II导联心电图。气管切开，插气管插管。再于胸骨左缘3~4肋间开胸，暴露心脏，在左心耳与肺动脉干间结扎左冠状动脉前室间支，同时在结扎线与血管之间穿一段直径1.5 mm,长0.5 cm的硅胶管,结扎30min，结扎线远端心肌颜色发绀，心电图表现ST段抬高或T波高耸为结扎成[14]。剪断缝合线，取出硅胶管，缺血部位心肌颜色恢复，抬高的ST段下降50%以上外围模型成功，再灌注
2h，假手术组仅分离前室间支，不结扎。
[0036]2.2全血凝血时间(CT)试验
大鼠心肌缺血/再灌注造模成功后，剪大鼠尾(据末端0.5~1cm)，取血2滴血分开滴于玻璃片上(直径4~5mm)，自血液滴在玻片上开始计时，每隔30s用Iml注射器针头通过血滴，并挑血液一次，如见针尖挑起纤维蛋白丝，停止计时，记录全血凝血(CT)时间。再挑动另一滴未挑过的血液作对照，并以前一滴血作为结果报告。
[0037]2.3 PT、TT、APTT 和 vWF 检测
大鼠心肌缺血/再灌注造模成功后,腹主动脉采血,将4ml注入放有3.8%枸橼酸钠抗凝剂的试管中(抗凝剂和全血的比例为1:9),轻度混匀,3000r/min离心15min。首先,收集上层血浆0.8ml，放置于1.5mLEP管中，常温下，按试剂盒说明书操作，测定凝血酶时间(TT)、凝血酶原时间(PT)及活化部分凝血活酶时间(APTT);其次，收集上层血浆0.8ml，放置于1.5mLEP管中，按照vWF试剂盒说明书测定的水平。
[0038]2.4血小板聚集抑制试验
2.4.1采血及血小板制备
人抗凝血采自健康志愿者肘前静脉，以3.8%枸橼酸钠:全血为1: 9抗凝。上下颠倒试管混匀，1000r/min离心IOmin,制备富血小板血衆(PRP);吸取上清后,3000r/min离心lOmin，制备贫血小板血浆(PPP)，取无溶血现象的血浆备用。用PPP调节PRP中血小板数，使达到250个/nL。为了避免血小板被激活，以上操作均在室温下进行。
[0039]2.4.2药物溶液配制 漆黄素(6X10_3mol/L):称取漆黄素固体1.72mg，加l%Na2C03溶液127 μ L，超声溶解，加生理盐水至lmL，并调节PH至7.0。槲皮素(6X 10_3mol/L):称取槲皮素固体1.81mg，加1% Na2CO3溶液159 μ L，超声溶解，加生理盐水至lmL，并调节PH至7.0。双嘧达莫(120父10-611101/1):取双嘧达莫注射液(21^: 10mg)12.1 μ L，加生理盐水至lmL。阿司匹林(3mg/mL):取3mg阿司匹林溶于适量l%Na2C03水溶液中，调PH至7.0,总体积为lmL。氯吡格雷(360 μ g/mL):称取0.36mg固体，加生理盐水至lmL。3.8%枸橼酸钠:取1.9g枸橼酸钠固体，加生理盐水溶解至50mL。NE (120 μ mol/L)的配制:取盐酸肾上腺素注射液(lmg/mL) 13.2 μ L，加生理盐水至500mL。阿司匹林临用前溶于适量l%Na2C03水溶液中，以0.9%氯化钠稀释，以HCl调节pH值至7.0。ADP用生理盐水配制成3 000 μ mo I/L的溶液分装备用，临用前用生理盐水稀释至所需浓度。
[0040]2.4.3血小板聚集实验步骤
取含血小板数为250个/nL的血浆300 μ L，置四通道血小板聚集仪的测定样品方杯中，分别加入生理盐水、漆黄素(终浓度分别为I X 10' I X 10' I X 10' I X 10' I X I(T8和 I X l(T10mol/L)、槲皮素(终浓度分别为 I X 10' I X 10' I X 10' I X 10' I X I(T8 和lXl0.mol/L)、氯吡格雷(终浓度为3 X Kr5 mol/L)、和双嘧达莫(终浓度为2X1(T6 mol/L)和阿司匹林(终浓度为2.8X10_4 mol/L)，37°C培育20 min后，用PRP调节透光率为0%，用PPP调节透光率为100%。各受试管分别加入ADP (终浓度为20 μ mol/L)和肾上腺素(终浓度为2 μ mol/L)、诱导血小板活化，同时加入磁子搅拌后，开始计时，记录血小板抑制率。并计算血小板聚集抑制率(%)=(对照组血小板聚集率-给药组血小板聚集率)/对照组血小板聚集率X 100%。
[0041]2.5心肌细胞凋亡的测定
Annexinv/PI双染，流式细胞仪测定心肌细胞凋亡水平:再灌注后取缺血区心肌组织5mm3约70 mg,步骤:(I)将左心室肌至于5-6 mL D-Hanks液中剪碎洗净,后弃去D-Hanks液体；(2)加入0.08%胰蛋白酶10 mL、室温、轻摇消化5 min ; (3)过200目尼龙网并收集滤液，加含小牛血清的培养液10 mL终止消化；(4)于1800 r/min离心10 min,弃去上清液,加含小牛血清的培养液5 mL，吹散细胞、于1800 r/min再离心10 min，弃去上清液；(5)加PBS ImL，吹散细胞，取200 μ L细胞悬液做流式，将细胞重悬于300 μ L Binding Buffer，加入3μ L Annexin V-EGFP 和 3 μ L Propidium 1dide (PI)，混匀，室温避光反应 20 min,上机检测，自动计算凋亡心肌细胞的百，结果判断:Annexin V —/PI —为正常细胞，Annexin V VPI 一为凋亡细胞，Annexin V +/PI+为坏死细胞；(6)取200 μ L做流式；(7)按照AnnexinV-EGFP/PI细胞凋亡检测试剂盒说明书方法加试剂；(8)上机检测[15_17]。
[0042]2.6 NF-kb 和 MMP-9 表达的测定
免疫组化方法测定NF-kB和MMP-9的表达:①MMP-9:取材同上，石蜡切片常规脱蜡，3%H202室温20 min灭活内源性过氧化物酶，蒸馏水洗3次。用0.01 mmol/L枸橼酸盐缓冲液(PH6.0)进行抗原热修复。磷酸盐缓冲液(PBS) (pH7.2)洗涤2次。滴加5%牛血清蛋白(BSA)封闭，室温放置20 min。甩去多余液体，滴加1: 100稀释的一抗(大鼠)，4°C放置过夜。PBS (pH7.2)洗3次，每次2 min。滴加生物素化山羊抗大鼠IgG，37°C反应20 min。PBS (pH7.2)洗3次，每次2 min。滴加链霉素亲和素-生物素-过氧化酶复合物免疫组化试剂(SABC)，37 °C反应30 min。PBS (pH7.2)洗4次，每次5 min。二氨基苯甲胺(DAB)显色剂室温显色，镜下控制反应时间，HE轻度复染，脱水，透明，封片，显微镜观察MMP-9表达情况
[18]。②NF-kB:再灌注2 h后，取左心室前壁的部分肌肉组织，10%福尔马林固定，酒精梯度脱水，二甲苯透明，常规石蜡包埋切片，免疫组化染色按试剂盒说明书采用SABC法、DAB显色、苏木精复染，中性树胶封固。鼠抗NF-kB p65单克隆抗体与NF-kB结合后理论上显棕黄色颗粒。每组取8个样本，于高倍显微镜(400倍)下，每个样本取5个视野，统计NF-kB表达及其核转移百分率[19】]。实验设备，Olympus BX51 Positive Position FluorescenceMicroscope, Japan。图像分析软件，Image Pro Plus6.0图像分析系统。
[0043]2.7心肌细胞梗死面积
TTC染色法测定心肌梗死面积:再灌注2 h后，经主动脉根部注入0.1~0.2 mL 1%TTC缓冲液，每组4例，将心脏置于37 °C恒温箱孵化30 min后，再放置于_20°C冰箱冷冻20 min。用生理盐水清洗，去除附着的血管和脂肪，从心尖到心基底平行切取I mm厚心肌片。正常心肌组织将被染成红色，梗死区为灰白色，照相，用Image Pro Plus6.0图像分析系统统计梗死面积[21_24]。
[0044]2.8心肌细胞病理变化测定
HE染色法测定心肌细胞的病理性变化:再灌注2 h后，每组8例，取左心室前壁70大小心肌肉组织块，10%福尔马林固定，酒精梯度脱水，二甲苯透明，常规石蜡包埋切片，进行苏木素-伊红(HE)染色，光学显微镜下观察心肌组织形态学变化[25’26]。
[0045]2.9统计分析方法
用统计学软件spssl3.0处理数据，结果均用均数土标准差(土 SEM )表示，组间比较采用t检验，P〈0.05表示有统计学差异，P〈0.01表示有显著性差异。用GraphPad Prism
5.0软件绘图。
[0046]3实验结果
3.1动态心电图监测
图1可见，假手术组大鼠的心电图变化正常。图2可见，冠状动脉结扎后，心电图ST段闻抬/T波闻耸，标志造|旲成功。
[0047]3.2心肌缺血/再灌注大鼠全血凝血时间
图3可见，与模型组相比较，漆黄素各剂量组、槲皮素和阿司匹林组均显著延长了心肌缺血/再灌注大鼠CT时间(P〈0.01或Ρ〈0.05)，漆黄素45mg/kg、15mg/kg延长CT效果与阿司匹林(47mg/kg)剂量组或槲皮素(15mg/kg)没有显著性差异。结果表明，漆黄素可明显延长心肌缺血/再灌注大鼠全血凝血时间。
[0048]图3为漆黄素对心肌缺血/再灌注大鼠全血凝血时间的影响(χ土SEM，n=12，与模型组比较，**P<0.01，*P<0.05)
3.3心肌缺血/再灌注大鼠PT、TT、APTT
由图4、图5和图6可见，同模型组相比，漆黄素45mg/kg、15mg/kg和5mg/kg三个剂量组PT、TT和APTT显著延长(P〈0.01或P〈0.05)，且对PT的影响呈剂量相关性。与模型组比较，槲皮素(15mg/kg)组和阿司匹林(47mg/kg)组可延长ΡΤ(Ρ〈0.05)。结果表明，漆黄素可延长心肌缺血再灌大鼠PT、TT和APTT值，具有抗凝血作用，且延长TT和APTT的效果优于槲皮素和阿司匹林。
[0049]3.4心肌缺血/再灌注大鼠vWF因子
图7可见，模型组血浆vWF的含量均显著高于假手术组、漆黄素45mg/kg和15mg/kg剂量组、槲皮素(15mg/kg)组和阿司匹林(47mg/kg)组(P〈0.05，P〈0.01)。与假手术组相比较，阿司匹林显著降低了血浆vWF的含量(P〈0.01)。结果表明，漆黄素可降低心肌缺血再灌大鼠血浆vWF的含量，具有抗血小板聚集作用。
[0050]3.5血小板聚集试验
图8可见，I X KT9M~I X KT5M漆黄素、双嘧达莫(终浓度为2X10—6 mol/L)、氯比格雷(终浓度为3X10_5 mol/L)和阿司匹林(终浓度为2.8X10_4 mol/L)同模型组相比有显著性差异(P〈0.01)。图9可见，使用Scott比值法计算漆黄素的IC5tl为4.54XlO-7M,槲皮素IC502.71 X IO-7M,漆黄素和槲皮素对人血小板聚集的影响呈剂量相关性。结果表明漆黄素能显著抑制血小板聚集率，且比双嘧达莫、氯比格雷和阿司匹林作用效果明显。
[0051]3.6心肌细胞凋亡率
图10可见，流式细胞仪检测Annexinv-EGFP标记的心肌细胞调亡情况，模型组与假手术组比较，心肌细胞凋亡率升高(P〈0.05)。45mg/kg和15mg/kg漆黄素组、槲皮素组和阿司匹林组，与模型组比较，可显著抑制缺血再灌注大鼠心肌细胞凋亡(P〈0.01或P〈0.05)，漆黄素抑制缺血再灌注大鼠心肌细胞的凋亡有剂量依赖关系。
[0052]3.7 MMP-9 和 NF_kb 的表达
MMP-9参与炎症反应，主要表达在细胞质中，染色呈淡黄色颗粒。图11可见，模型组与假手术组比较表达有显著差异(P〈0.01)，45mg/kg漆黄素组、15mg/kg漆黄素组及槲皮素组与模型组比较，抑制MMP-9表达(P〈0.01)，其分布和密度都减少。15mg/kg漆黄素组和15mg/kg槲皮素组效果相当。
[0053]NF-kb具有逆转录功能的结构蛋白，表达与细胞质中。模型组与假手术组比较，黄色颗粒密度大、分布广、核转移显著(p〈0.01)。漆黄素各组及槲皮素组与模型组比较，可明显抑制其表达和核转移(P〈0.01)。槲皮素组较15mg/kg漆黄素组抑制其表达作用接近。见图12和图13。
[0054]3.8心肌细胞梗死面积
图14可见，大鼠心肌缺血再灌注后TTC染色，选择染色红色的正常心肌，进行灰度统计，结果显示，各组正常心肌面积，模型组与正常组比较，有较大面积梗死(P〈0.01);漆黄素各剂量组、槲皮素、阿司匹林与模型组比较，显著降低了心肌梗死面积(p〈0.01或P〈0.05)，且漆黄素各组有剂量依赖性。结果表明，漆黄素可抑制心肌缺血再灌大鼠的缺血心肌的坏死。
[0055]3.9心肌细胞病理变化
模型组与假手术组(p〈0.01)比较心肌细胞结构变化明显，心肌肌丝排列紊乱，横纹模糊不清楚，肌原纤维明暗带清晰；模型组心肌细胞严重水肿，大量吞噬细胞聚集，细胞膜模糊，细胞核肿胀、变淡、破裂溶解，肌丝断裂、溶解；漆黄素各剂量组、槲皮素组与模型组比较心肌纤维结构损伤程度明显减轻，心肌肌丝排列整齐，横纹清楚，细胞、细胞核膜完整，肌原纤维明暗清晰(p〈0.01或P〈0.05)。见图15。
【权利要求】
1.漆黄素作为制备抗凝血药物的应用，为抑制ADP诱导的血小板聚集、抑制血小板释放、降低血清vWF含量而产生抗凝血作用。
2.漆黄素作为制备抗血栓形成药物的应用，为显著延长CT、PT、TT和APTT，间接起到抗血栓形成作用。
3.漆黄素作为制备对缺血/再灌注心肌细胞起保护作用药物的应用，通过抑制炎症细胞侵润、MMP-9和NF-kB的表达、NF-kB核转移、心肌细胞凋亡途径降低缺血心肌细胞炎症反应，减少损伤心肌的梗死面积，产生对缺血心肌细胞的保护作用。
4.根据权利要求1、2或3所述的漆黄素作为制备抗凝血、抗血栓形成和心肌保护作用药物的应用，其特征在于:漆黄素的剂量范围为5~45 mg/kg。
5.根据权利要求1、2或3所述的漆黄素作为制备抗凝血、抗血栓形成和心肌保护作用药物的应用，其特征在于:漆黄素的制成品为药品制剂或保健食品。
6.根据权利要求1、2或3所述的漆黄素作为制备抗凝血、抗血栓形成和心肌保护作用药物的应用，其特征在于: 漆黄素的剂型为经口、肌肉、静脉、透皮吸收的制剂及外用制剂。
【文档编号】A61P9/10GK103536587SQ201310384907
【公开日】2014年1月29日 申请日期:2013年8月30日 优先权日:2013年8月30日
【发明者】龙丽辉, 李亚军, 刘凯歌, 曹永孝, 郭增军, 马星明, 刘琳洁 申请人:西安医学院附属医院