滇南木姜子提取物及其制备方法与应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种滇南木姜子的新用途——滇南木姜子提取物在制备预防和治疗肺部肿瘤药物或保健品中的应用。本发明还提供了滇南木姜子提取物的制备方法。研究表明，滇南木姜子提取物能够激活Nrf2信号通路，促进抗氧化和II相解毒酶的表达，增加细胞内谷胱甘肽水平，增强细胞内还原能力，降低细胞内活性氧水平，并能够抑制致癌物砷和活性氧H2O2引起的细胞毒性。因此，可将其制备成相应的口服制剂和注射剂，并用于肺部肿瘤的预防和治疗。
【专利说明】滇南木姜子提取物及其制备方法与应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及滇南木姜子提取物，及其制备方法，以及其在制备治疗或预防肺部肿瘤的药物或保健品中的应用。
【背景技术】
[0002]随着社会的发展，人类生活水平和医疗环境的改善，人类寿命得到了显著的延长，但经济高速发展的同时，机动车保有量增加，尾气排放导致环境污染严重，引起肺部肿瘤的发病率持续增高，严重威胁人类健康。在尚无有效药物实现对恶性肿瘤有效治疗的前提下，研发具有预防作用的药物和保健品，防止疾病的早期形成和发生成为有效的应对方法。
[0003]核转录因子Nrf2(Nuclear factor-erythroid2~related factor2)是调节细胞氧化还原平衡的重要转录因子，通过与抗氧化酶和II相解毒酶启动子区域抗氧化反应原件(ARE)结合调控细胞氧化还原平衡，其目标基因包括编码GST、UGT、y GCS, NQOl的II相解毒酶，及GCUHO-1等内源性抗氧化蛋白。当机体暴露于亲电性异物、化学致癌物、内源性氧化剂等对机体有损伤作用的物质下，Nrf2便会被激活并通过上调抗氧化酶和II相解毒酶清除有害物，保护机体免受毒物的损伤(Lau et al.，Pharmacol.Res.，2008，58，262-270)。因此，通过激活Nrf2信号通路，增强机体自身清除毒物和致癌物的能力，能够预防炎症、肿瘤、神经退行性等疾病的发生。
[0004]在氧化应激状态下，面对内源性和外源性毒物对机体的侵害,利用外源性Nrf2激动剂上调机体Nrf2水平，能够增强机体自身防御能力，预防内源性活性氧、外源性致癌物等毒物对机体的损伤，对于预防恶性肿瘤的发生具有重要意义(Magesh et al.,Med.Res.Rev.，2012，32，4，687-726)。激活Nrf2信号通路，能够上调II相解毒酶水平，清除致癌物或降低其毒性，抑制致癌物诱导的DNA损伤、基因突变，通过上调Nrf2表达，能够增加细胞内谷胱甘肽水平，增强抗氧化酶活性，清除细胞内活性氧，抑制细胞脂质过氧化，从而预防恶性肿瘤的发生。因此，具有Nrf2激动作用的单体化合物、植物提取物等能够有效预防恶性肿瘤的发生率。
[0005]滇南木姜子(Litsea garrettii)为常绿乔木,高4至12米。小枝褐色,纤细,初时有淡黄色柔毛，后渐变无毛。顶芽卵圆形，外被黄褐色短柔毛。主产我国南部及西南部；生于海拔750~2000米的灌丛或阔叶林中。
【发明内容】
[0006]针对上述现有技术，本发明公开了滇南木姜子提取物，及其制备方法，以及新用途——滇南木姜子提取物在制备治疗或预防肺部肿瘤的药物或保健品中的应用。
[0007]本发明是通过以下技术方案实现的:
[0008]本发明的发明人通过研究发现，滇南木姜子提取物能够激活Nrf2信号通路，并能保护正常肺支气管表皮细胞抵抗致癌物砷和活性氧双氧水产生的细胞毒性，因此，可以以滇南木姜子提取物为原料制备预防肿瘤的保健品，也可以制备治疗肿瘤的药物(经查阅文献，迄今为止未见有滇南木姜子提取物激活Nrf2信号通路的报道，亦未见滇南木姜子用于肿瘤预防和治疗的报道)。
[0009]具体应用时，可以以滇南木姜子提取物为原料，添加医学上可接受的辅料，制成胶囊剂(包括软胶囊)、片剂、散剂、颗粒、口服液、酒剂、丸剂、微丸剂、合剂、酊剂等剂型，优选颗粒剂、胶囊剂、片剂；或者将滇南木姜子提取物进一步纯化制成注射制剂。也可以将滇南木姜子提取物与其它对肺部肿瘤有治疗或预防作用的药物混合，再添加或不添加医学上可接受的辅料，制成胶囊剂(包括软胶囊)、片剂、散剂、颗粒、口服液、酒剂、丸剂、微丸剂、合剂、酊剂、注射剂等剂型。
[0010]所述滇南木姜子提取物，是通过以下方法制备得到的:
[0011]将滇南木姜子提地上部分粉碎，用O~95%乙醇(体积百分数)回流提取I~8次，每次溶剂用量为药材重量的I~20倍，每次提取时间为0.5~10小时；合并提取液，过滤，回收乙醇，进行浓缩、干燥，即得滇南木姜子提取物。
[0012]优选的，用30~90%乙醇回流提取2~4次，每次溶剂的用量为药材重量的3~7倍,每次提取时间为2~4小时。
[0013]所述滇南木姜子提取物，可以用于制备治疗或预防肺部肿瘤的药物或保健品。
[0014]本发明的发明人完成了滇南木姜子提取物对Nrf2信号激活作用，及对致癌物砷和活性氧双氧水引起的细胞毒性的保护作用的研究。结果表明，上述滇南木姜子提取物能够在蛋白水平激活Nrf2，增加Nrf2及其下游基因NQOl和GCS的表达，通过增加细胞内谷胱甘肽的水平增强正常肺支气管细胞还原能力。发明人还发现滇南木姜子提取物能够抑制致癌物砷和活性氧双氧水诱导的细胞毒性，表现出抑制细胞癌变的能力。下面介绍滇南木姜子提取物对Nrf2信号通路的激活作用，及对致癌物砷和活性氧双氧水引起的细胞毒性的作用:
[0015]采用能够稳定表达含ARE依赖的荧光素酶质粒的MDA-MB-231-Luc细胞系，评价了滇南木姜子提取物对Nrf2转录的作用，结果表明滇南木姜子提取物具有激活Nrf2信号通路的作用(图1)。
[0016]选择人乳腺癌MDA-MB-231细胞作为检测细胞，评价滇南木姜子提取物对Nrf2信号通路的作用。蛋白质印迹分析结果表明，滇南木姜子提取物对能够上调Nrf2蛋白的表达，并能促进下游抗氧化和II相解毒酶蛋白NQOl和YGCS的表达(图2)。
[0017]选择人正常肺上皮Beas_2B细胞，检测了滇南木姜子提取物对细胞内谷胱甘肽水平的调节作用。结果显示，滇南木姜子提取物能够剂量依赖性的增加细胞内谷胱甘肽水平(图3)，增强细胞内还原能力和清除活性氧能力。
[0018]选择致癌物砷诱导的细胞毒性模型，评价滇南木姜子提取物对人正常肺上皮Beas-2B细胞的保护作用。经滇南木姜子提取物对处理后，细胞生存率显著高于未加药处理组，证明滇南木姜子提取物能够抑制三价砷诱导的细胞毒性(图4)，表明滇南木姜子提取物可用于肺部肿瘤的预防和治疗。
[0019]选择活性氧H2O2诱导的细胞毒性模型，评价滇南木姜子提取物对人正常肺上皮Beas-2B细胞的保护作用。结果表明滇南木姜子提取物能够抑制H2O2产生的毒性，提高细胞生存率(图5)。肿瘤的发生多与活性氧产生的毒性密切相关，该结果证明滇南木姜子提取物可用于肺部肿瘤的预防和治疗。【专利附图】
【附图说明】
[0020]图1:ARE依赖的荧光素酶报告试验表明滇南木姜子提取物对能够激活Nrf2信号通路，图中的滇南木姜子提取物浓度单位为μ g/mL,萝卜硫素2.5 μ M为阳性对照。
[0021]图2:蛋白质印迹分析表明滇南木姜子提取物能够在蛋白水平激活Nrf2其下游基因，图中的滇南木姜子提取物浓度单位为μ g/mL,萝卜硫素2.5 μ M为阳性对照。
[0022]图3:滇南木姜子提取物能够增加细胞内谷胱甘肽水平，图中萝卜硫素2.5μ M为阳性对照，其中滇南木姜子提取物浓度分别为:30 μ g/mL, 60 μ g/mL, 90 μ g/mL。
[0023]图4:滇南木姜子提取物能够降低砷(As)诱导的细胞毒性(*p〈0.05)，图中滇南木姜子提取物浓度为60 μ g/mL。
[0024]图5:滇南木姜子提取物能够降低双氧水(H2O2)诱导的细胞毒性(*p〈0.05)，图中滇南木姜子提取物浓度为60 μ g/mL。
【具体实施方式】
[0025]下面结合实施例对本发明作进一步的说明，下述实施例仅为说明之目的，并非用于限制本发明。
[0026]实施例1:滇南木姜子提取物对Nrf 2信号通路的激活作用
[0027]方法:(I)滇南木姜子提取物的制备
[0028]滇南木姜子地上部 分200g，粉碎，75%乙醇800mL，提取2次，每次I小时，合并提取液，浓缩干燥即得，用于活性评价。
[0029](2)人乳腺癌细胞MDA-MB-231细胞系的培养
[0030]人乳腺癌细胞MDA-MB-231购自美国模式培养物集存库(ATCC)，采用含10%胎牛血清(FBS)、2mMHEPES和6ng/mL胰岛素的MEM培养基，置于37°C，5%C02培养箱中培养。
[0031](3) ARE依赖的荧光素酶报告试验
[0032]将MDA-MB-231-Luc细胞接种于96孔板上，24小时后加入不同浓度的待测化合物，处理16小时，采用细胞裂解液[0.1M磷酸钾和ImM 二硫苏糖醇]裂解细胞，用检测液(25mM双甘氨肽，15mM硫酸镁，500 μ MATP, 250 μ M荧光素和250 μ M辅酶Α)，测定荧光强度。
[0033]结果:如图1所示，滇南木姜子提取物能够显著增强ARE依赖的荧光素酶活性，在90 μ g/mL浓度下，强度是空白对照组的4倍，阳性对照药物萝卜硫素(2.5μΜ)是空白对照组的2倍。上述结果表明，滇南木姜子提取物能够诱导Nrf2信号通路，对人体具有保护作用。
[0034]实施例2:滇南木姜子提取物能够上调Nrf2及以下游基因蛋白水平的表达
[0035]方法:蛋白质印迹分析(Western blot)检测细胞中蛋白水平的变化
[0036]将MDA-MB-231细胞接种于直径35mm培养皿中，培养至密度达到70%~80%后，加入不同浓度的滇南木姜子提取物(滇南木姜子提取物为实施例1制备)处理16h，PBS洗涤2次，加入细胞裂解液(50 μ g/ml抑肽酶，0.5mM苯甲基磺酰氟，ImM正钒酸钠，IOmM氟化钠，ΙΟπιΜβ -磷酸甘油)，收集蛋白并采用Bradford法测定蛋白浓度。各取样品蛋白(100 μ g)上样，SDS-PAGE分离蛋白组分并采用电转移法将蛋白条带转移至硝酸纤维素薄膜上。薄膜经TBS配制5%的脱脂奶粉溶液室温封闭Ih后，分别与各待测蛋白抗体4°C孵育过夜。经TBS洗涤后分别加入辣根过氧化物酶偶联的二抗孵育Ih后，用增强型ECL化学发光进行蛋白分析。
[0037]结果:如图2所示，细胞经滇南木姜子提取物处理16h后，Nrf2及其下游抗氧化和II相解毒酶蛋白NQOl和Y GCS蛋白水平呈现剂量依赖性增加，证实滇南木姜子提取物能够在蛋白水平上激活Nrf2信号通路。
[0038]实施例3:滇南木姜子提取物增加细胞内谷胱甘肽水平
[0039]方法:(I)人正常肺上皮细胞Beas_2B细胞的培养
[0040]人正常肺上皮细胞Beas_2B购自美国模式培养物集存库(ATCC)，采用F12培养基，并向其中加入10%胎牛血清(FBS)，5%谷氨酰胺，置于37°C，5%C02培养箱中培养。
[0041](2)细胞内谷胱甘肽含量的测定
[0042]将Beas_2B细胞接种于直径35mm培养皿中，培养至密度达到70%~80%后，加入不同浓度的滇南木姜子提取物(滇南木姜子提取物为实施例1制备)处理24小时，PBS洗涤2次，加入0.5mL50mM磷酸钠和ImMEDTA缓冲液收细胞，超声lmin，1000Og离心15分钟，取上清液，按照谷胱甘肽测定试剂盒说明书操作，412nm测定吸光度并计算谷胱甘肽含量。
[0043]结果:如图3所示，滇南木姜子提取物能够显著增加细胞内谷胱甘肽水平，增强细胞内还原能力。
[0044]实施例4:滇南木姜子提取物能够抑制三价砷对人肺支气管上皮Beas_2B细胞的
毒性
[0045]方法:MTT法测定化合物对砷(As)诱导的细胞毒性的保护作用
[0046]将Beas_2B细胞接种于`96孔板上，加入不同浓度待测提取物处理16小时，然后加入不同浓度的砷和待测浓度提取物(植物提取物为实施例1制备)处理24小时，加入MTT3小时后，590nm测定吸光度并计算细胞生存率。
[0047]结果:如图4所示，采用滇南木姜子提取物预处理细胞16小时，然后加入20 μ M、40 μ M的砷和滇南木姜子提取物处理细胞24小时，结果表明滇南木姜子提取物对Beas-2B细胞具有保护作用，能够抑制砷诱导的细胞毒性。滇南木姜子提取物处理组的细胞生存率明显高于未加药物处理组。结果证明，滇南木姜子提取物能够抑制致癌物砷诱导的毒性，能够用于肺部肿瘤的预防和治疗。
[0048]实施例5:滇南木姜子提取物能够抑制活性氧双氧水(H2O2)对人肺支气管上皮Beas_2B细胞的毒性
[0049]方法同实施例4。
[0050]结果:图5所示，采用相应浓度滇南木姜子提取物预处理细胞16小时，然后加入100 μ Μ、200 μ M的H2O2和相应浓度滇南木姜子提取物处理细胞24小时，结果表明滇南木姜子提取物对Beas_2B细胞具有保护作用，能够抑制H2O2诱导的细胞毒性。滇南木姜子提取物处理组的细胞生存率明显高于未加药物处理组。结果证明，滇南木姜子提取物能够抑制活性氧H2O2产生的细胞毒性，能够用于肺部肿瘤的预防和治疗。
[0051]实施例6:滇南木姜子提取物的制备
[0052]滇南木姜子地上部分5kg，粉碎，用药材重量的4倍的80%乙醇回流提取3次，每次提取时间为3小时，合并提取液，过滤，回收乙醇，减压干燥，即得滇南木姜子提取物360g,收率为 7.2%ο[0053]实施例7:片剂的制备
[0054]滇南木姜子提取物(实施例6制备)30g，加入玉米淀粉40g，糊精20g，充分混匀，制颗粒，干燥，整粒，加适量滑石粉，压片，即得。
[0055]实施例8:胶囊剂的制备
[0056]滇南木姜子提取物(实施例8制备)30g，加入淀粉30g、糊精15g，微晶纤维素10g，充分混匀，制颗粒，干燥，整粒，加`入适量硬脂酸镁，装胶囊，即得。
【权利要求】
1.滇南木姜子提取物在制备预防和治疗肺部肿瘤的药物或保健品中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于:具体应用时，以滇南木姜子提取物为原料，添加医学上可接受的辅料，制成胶囊剂、片剂、散剂、颗粒剂、口服液、酒剂、丸剂、微丸剂、合剂或酊剂；或者将滇南木姜子提取物纯化制成注射制剂；或者:将滇南木姜子提取物与其它对肺部肿瘤具有治疗或预防作用的药物混合，再添加或不添加医学上可接受的辅料，制成胶囊剂、片剂、散剂、颗粒剂、口服液、酒剂、丸剂、微丸剂、合剂、酊剂或注射剂；所述滇南木姜子提取物为该植物地上部分的提取物。
3.一种滇南木姜子提取物，其特征在于:是通过以下方法制备得到的:将滇南木姜子地上部分粉碎，用O~95%乙醇回流提取I~8次，每次溶剂用量为药材重量的I~20倍，每次提取时间为0.5~10小时；合并提取液，过滤，回收乙醇，进行浓缩、干燥，即得滇南木姜子提取物。
4.权利要求3所述的滇南木姜子提取物在制备预防和治疗肺部肿瘤药物或保健品中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于:具体应用时，以滇南木姜子提取物为原料，添加医学上可接受的辅料，制成胶囊剂、片剂、散剂、颗粒剂、口服液、酒剂、丸剂、微丸剂、合剂或酊剂；或者将滇南木姜子提取物纯化制成注射制剂；或者:将滇南木姜子提取物与其它对肺部肿瘤具有治疗或预防作用的药物混合，再添加或不添加医学上可接受的辅料，制成胶囊剂、片剂、散剂、颗粒剂、口服液、酒剂、丸剂、微丸剂、合剂、酊剂或注射剂。
【文档编号】A61K36/54GK103550293SQ201310545697
【公开日】2014年2月5日 申请日期:2013年11月6日 优先权日:2013年11月6日
【发明者】李国辉, 沈涛, 任冬梅, 王小宁 申请人:济南市妇幼保健院