聚乙二醇修饰的聚乙烯亚胺及其作为抗原蛋白载体的用途
【专利摘要】本发明公开了一种聚乙二醇修饰的聚乙烯亚胺及其作为抗原蛋白载体的用途；所述聚乙二醇修饰的聚乙烯亚胺结构通式如式(I)所示：(I)，其中，n、a1、a2、b均为任一自然数，且a1、a2、b≥1，n≥10。所述的聚乙二醇修饰的聚乙烯亚胺可与蛋白质复合形成稳定的纳米粒子作为蛋白载体生物材料。与现有技术相比，本发明制备的新型聚乙二醇修饰的聚乙烯亚胺具有较强的蛋白质结合性能，可以携带抗原蛋白被抗原提呈细胞识别并引起免疫反应；在提高抗原交叉提呈效果的同时也能够显著降低细胞毒性，有助于提高免疫治疗效果，是一种优良的治疗性肿瘤疫苗的纳米载体系统。
【专利说明】聚乙二醇修饰的聚乙烯亚胺及其作为抗原蛋白载体的用途
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物【技术领域】，具体涉及一种聚乙二醇修饰的聚乙烯亚胺及其作为抗原蛋白载体的用途。
【背景技术】
[0002]治疗性疫苗旨在打破机体的免疫耐受，提高机体的免疫应答。其作用机理是通过改善和增强对疫苗靶抗原的摄入、表达、处理、呈递和激活免疫应答，从根本上重新激活机体对靶抗原的免疫应答能力。它能在已患病个体上诱导特异性免疫应答，清除病原体或异常细胞，使疾病得以治愈。作为一种新兴的治疗型疫苗，尤其是在肿瘤治疗方面，有着广阔的发展前景
[0003]但目前以蛋白质抗原为基础的肿瘤疫苗的疗效有限，其中一个重要原因是其诱导产生的免疫反应为体液免疫即以抗体反应为主的免疫反应,而能够对肿瘤细胞起到杀伤作用的免疫反应是抗原特异性激活的细胞毒性T淋巴细胞免疫反应。因此，控制抗原在抗原提呈细胞(APCs)内部的处理过程和使其通过MHC-1途径进行抗原提呈是激活细胞毒性T淋巴细胞的关键，而提高抗原交叉提呈反应效率对于提高治疗性抗原效用具有非常重要的意义。
[0004]目前，通常作为生物载体材料得到应用的阳离子多聚物包括多聚赖氨酸(Poly-L-lysine, PLL)、多聚精氨酸、多聚组氨酸、组氨酸赖氨酸、壳聚糖(chitosan)、鱼精蛋白、多胺树突状物(polyamidoaminedendrimer)、聚丙烯亚胺树突状物(polypropyIeniminedendrimers)、超支化聚合妝、聚乙烯亚胺(polyethylenimine, PEI)等。其中聚乙烯亚胺(Polyethylenimine, PEI)是由Boussif等在1995年最早发现,其可缩合质粒DNA而不需受体介导，不需溶酶体抑制剂就可转染细胞，之后，PEI相关的生物载体材料也成为了载体领域的研·究热点。
[0005]聚乙烯亚胺是已经商业化的一种阳离子聚合物，每个单体(-CH2-CH2-NH2-)中含有2个碳原子和I个氮原子，即在PEI的骨架中每三个原子中含一个氨基，根据根据合成路线的不同和反应的温度不同，经过酸催化氮丙啶单体聚合，分别形成线状和链状的聚合物结构。多聚物的分子量范围很宽，其中以分子量为22kDa和25kDa的PEI应用最广。目前的研究表明，PEI在体内和体外均有较高的转染效率，而PEI的高转染效率与它具有强大的缓冲能力有关。
[0006]在生理条件下，PEI链上的氨基并不完全质子化，当PEI复合物通过与细胞膜相互作用内吞进入细胞后，形成内涵体，之后内涵体与溶酶体融合，在溶酶体中PH值降低，溶酶体中的PEI氨基质子化程度大大提高，PEI吸收大量质子而改变了溶酶体的内环境，引起溶酶体肿胀破裂，使PEI复合物得以放入胞质。这就是常用的一种“质子海绵”效应假说。但在PEI溶酶体的逃逸机制上仍有一定的争议。
[0007]利用抗原蛋白在一定条件下带负电的特点，在先前的研究工作中，陈剑等人设计了一种基于PEI25K的新型抗原载体输送系统，主要是将带负电的抗原蛋白质和带正电的PEI25K以静电作用结合形成纳米粒(Chen, J., et al., Improvedantigen cross-presentation by polyethyIeneimine-based nanoparticles.1nt JNanomedicine, 2011.6:p.77-84.)。研究表明，以PEI为基础制备的纳米粒子可以有效提高抗原交叉提呈反应，具有成为治疗性肿瘤疫苗的纳米载体系统的潜力。
[0008]但是单纯的PEI作为载体在体内应用有诸多问题，如PE1-DNA复合物进入血循环时，复合物表面的阳性电荷就成了一道障碍。带阳性电荷的复合物不仅导致红细胞的聚集，也能够和血浆成分如白蛋白、纤维蛋白原和补体C3等作用，导致聚集体的形成，颗粒增大；在循环内最后被肺脏毛细血管床捕获，这给治疗肺脏以外的疾病带来很大困难；载体表面阳性电荷和聚合体形成也是PEI高毒性的一个主要原因；此外，特定细胞或组织的靶向性也很差，这些都成为限制其体内应用的重要因素之一。因此研究者们对如何进一步增强转染效率并减轻其毒性作用需作进一步研究。
[0009]PEI的毒性作用于破坏细胞膜的完整性，在体内，细胞膜上的载脂蛋白会吸附PEI/DNA复合物，从而形成结构组成较复杂的多元聚集体，进而破坏膜的完整性。PEG是由乙二醇单体聚合而成的线性高分子材料，属于可溶性的惰性聚合物，由于PEG分子中存在大量乙氧基能够和水形成氢键，因此其可在周围形成一定厚度的水合层，而对环境中的大分子及粒子产生“屏蔽”效应。多年来研究表明，PEG是无毒和抗免疫原性的水溶性大分子，有优良的生物相容性。
【发明内容】
[0010]本发明的目的在于克服上述现有技术存在的不足，提供一种新型的聚乙二醇修饰的聚乙烯亚胺及其作为蛋白载体生物材料的用途。本发明为了改善PEI的生物性能，采用引入聚乙二醇(PEG)的方法对PEI进行修饰。PEI经PEG修饰后，可形成囊泡状结构屏蔽表面多余的正电荷，有利于体内的长循环给药应用，且可增加阳离子多聚物复合物颗粒的可溶性，而且PEG化的PEI复合物还可以减少颗粒之间的相互聚集及降低复合物与血清蛋白(如补体)、红细胞之间的相互聚集，延长在血液中的循环时间并降低全身毒性。因此用PEG修饰合成的PEG与PEI的聚合物作为基因递释载体有降低毒性、增加复合物稳定性、延长体内循环时间等优点。同样，将PEI进行聚乙二醇修饰能够增强其与蛋白相互作用，同时维持低毒性。因此，本发明提供的新型聚乙二醇修饰的聚乙烯亚胺在提高抗原交叉提呈效果的同时，显著降低了细胞毒性，有助于提高免疫治疗效果。
[0011]本发明的目的是通过以下技术方案来实现的:
[0012]第一方面，本发明涉及一种聚乙二醇修饰的聚乙烯亚胺，其结构通式如式(I)所示:
【权利要求】
1.一种聚乙二醇修饰的聚乙烯亚胺，其特征在于，其结构通式如式(I)所示:
2.一种如权利要求1所述的聚乙二醇修饰的聚乙烯亚胺的合成方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤: Α、在无水有机溶剂、吡啶存在的条件下，对甲苯磺酰氯与η倍摩尔比的单甲基聚乙二醇mPEG '
3.如权利要求2所述的聚乙二醇修饰的聚乙烯亚胺的合成方法，其特征在于，所述PEI的重均分子量为2000~25000。
4.如权利要求2所述的聚乙二醇修饰的聚乙烯亚胺的合成方法，其特征在于，所述单甲基聚乙二醇的重均分子量为400~10000。
5.—种如权利要求1所述的聚乙二醇修饰的聚乙烯亚胺作为蛋白载体生物材料的用途，其特征在于，所述的聚乙二醇修饰的聚乙烯亚胺可与蛋白质复合形成稳定的纳米粒子。
6.如权利要求5所述的聚乙二醇修饰的聚乙烯亚胺作为蛋白载体生物材料的用途，其特征在于，所述蛋白质为带负电的蛋白质。
7.如权利要求5所述的聚乙二醇修饰的聚乙烯亚胺作为蛋白载体生物材料的用途，其特征在于，所述蛋白质为肿瘤抗原或病毒抗原。
8.如权利要求5所述的聚乙二醇修饰的聚乙烯亚胺作为蛋白载体生物材料的用途，其特征在于，所述纳米粒子可作为肿瘤治疗性疫苗的载体。
9.如权利要求5所述的聚乙二醇修饰的聚乙烯亚胺作为蛋白载体生物材料的用途，其特征在于，所述聚乙二醇修饰的聚乙烯亚胺的η为10~20中的任一自然数。
【文档编号】A61P35/00GK103627005SQ201310554476
【公开日】2014年3月12日 申请日期:2013年11月8日 优先权日:2013年11月8日
【发明者】徐宇虹, 王辉, 陈剑, 盛瑞隆, 曹阿民 申请人:上海交通大学