用于抗肿瘤药物转运氯毒素靶向的氧化石墨烯纳米材料的制作方法
【专利摘要】一种制备CTX靶向的氧化石墨烯纳米材料的方法：1）将石墨和H2SO4-HClO4混合，于冰浴中搅拌混合，再于温水浴中继续搅拌，加热至100-120℃去酸，稀释至800～1000ml后离心，加碱溶液混合沉淀，于70-90℃搅拌并趁热过滤，洗涤至接近中性，-40℃下真空冷冻干燥，得到氧化石墨烯；2）将氧化石墨烯和磷酸盐缓冲液混合，加入N-羟基丁二酰亚胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐于室温活化反应；调整混合物的pH值为7.0-8.0，加入CTX反应，获得的产物离心、洗涤，-40℃下真空冷冻干燥，得到CTX靶向的氧化石墨烯纳米材料。本发明可以用于脑胶质瘤靶向转运抗癌药物阿霉素。
【专利说明】用于抗肿瘤药物转运氯毒素靶向的氧化石墨烯纳米材料
【技术领域】
[0001 ] 本发明涉及一种用于抗肿瘤药物转运氯毒素(CTX)靶向的氧化石墨烯纳米材料。
[0002]本发明还涉及上述氧化石墨烯纳米材料的制备方法。
[0003]本发明还涉及上述氧化石墨烯纳米材料的应用。
【背景技术】
[0004]神经胶质瘤是人脑重大疾病，是中枢神经系统最常见的原发性肿瘤，因其具有侵润性生长，脑内存在血脑屏障(BBB)等的特点，其治疗和早期诊断一直是世界性难题。
[0005]石墨烯，是一种由碳原子组成的Sp2杂环的新颖二维纳米材料，拥有许多非凡的电子、光学、热学和力学性能。氧化石墨烯(GO)是一种通过剧烈氧化石墨获得到的理想而又有效的药物纳米载体。用于药物输送的氧化石墨烯通常是单原子层，只有l_2nm厚，大小从几纳米到几百纳米。其独特的结构特性，比如具有二维SP2杂化碳原子域、较大的比表面积(2630m2/g)和富有含氧集团，使GO具有极好的生物相容性、溶解性、稳定性和表面两层都有通过化学结合或物理吸附结合药物的能力。此外，GO具有的活性集团COOH和OH可以偶联各种其他物质，如聚合物、生物分子(配体、DNA、蛋白质、量子点、无机纳米粒等等)，达到各种各样的生物和医学应用目的。
[0006]Chlorotoxin (CTX，TM601)是一个具有四个二硫键由36个氨基酸组成的多肽。CTX结合到肿瘤细胞表面蛋白质的特性导致其对肿瘤组织具有专一性。已有一些研究显示CTX优先结合到胶质瘤细胞。虽然CTX被用在广泛有效的肿瘤靶向平台，除了基因治疗其他应用并没有被描述过。
[0007]广谱抗癌药物阿霉素(DOX)`是一种成功的抗癌药物，广泛用于治疗各型肿瘤。由于DOX不能穿过血脑屏障和不受欢迎的副作用，其效用在胶质瘤治疗上有限。
【发明内容】
[0008]本发明的目的在于提供一种用于抗肿瘤药物转运CTX靶向的氧化石墨烯纳米材料。
[0009]本发明的又一目的在于提供一种制备上述氧化石墨烯纳米材料的方法。
[0010]为实现上述目的，本发明提供的CTX靶向的氧化石墨烯纳米材料，通过下述方法得到:
[0011]I)按5g石墨和IOOmL H2SO4-HClO4混合溶液的比例，于冰浴中搅拌混合，再于温水浴中继续搅拌，加热至100-120°C去酸，稀释至800~1000ml后离心，加碱溶液混合沉淀，于70-90°C搅拌并趁热过滤，洗涤至接近中性，_40°C下真空冷冻干燥，得到氧化石墨烯；
[0012]H2SO4-HClO4 体积比为 3:1 ;
[0013]2)按150毫克氧化石墨烯和20毫升磷酸盐(PBS)缓冲液的比例，加入4毫克的N-羟基丁二酰亚胺(NHS)和6毫克的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)于室温活化反应；调整混合物的pH值为7.0-8.0，加入15mg的CTX反应，获得的产物离心、洗涤，_40°C下真空冷冻干燥，得到CTX靶向的氧化石墨烯纳米材料。
[0014] 所述CTX靶向的氧化石墨烯纳米材料中，CTX偶联的氧化石墨烯纳米材料为褶皱般片状的石墨烯薄片，横向宽度200nm。
[0015]所述CTX靶向的氧化石墨烯纳米材料中，步骤I)中于冰浴中搅拌混合后放置24h，再于40°C温水浴中继续搅拌。
[0016]所述CTX革巴向的氧化石墨烯纳米材料中，步骤I)中是用0.1mNaOH溶液混合沉淀；用5%HC1和蒸馏水洗涤至接近中性。
[0017]本发明提供的制备上述CTX靶向的氧化石墨烯纳米材料的方法，其步骤为:
[0018]I)按5g石墨和IOOmL H2SO4-HClO4混合溶液的比例，于冰浴中搅拌混合，再于温水浴中继续搅拌,加热至100-120°C去酸，稀释至800~1000ml后离心，加碱溶液混合沉淀，于70-90°C搅拌并趁热过滤，洗涤至接近中性，_40°C下真空冷冻干燥，得到氧化石墨烯；H2SO4-HClO4 体积比为 3:1 ；
[0019]2)按150毫克氧化石墨烯和20毫升磷酸盐(PBS)缓冲液的比例，加入4毫克的N-羟基丁二酰亚胺(NHS)和6毫克的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)于室温活化反应；调整混合物的pH值为7.0-8.0，加入15mg的CTX反应，获得的产物离心、洗涤，_40°C下真空冷冻干燥，得到CTX靶向的氧化石墨烯纳米材料。
[0020]所述的方法中，步骤I)中于冰浴中搅拌混合后放置24h，再于40°C温水浴中继续搅拌。
[0021 ] 所述的方法中，步骤I)中是用0.1mNaOH溶液混合沉淀；用5%HC1和蒸馏水洗涤至接近中性。
[0022]本发明提供的CTX靶向的氧化石墨烯纳米材料作为靶向抗肿瘤药物输送平台的应用。
[0023]所述的应用中，抗肿瘤药物为神经胶质瘤抗肿瘤药物。
[0024]所述的应用中，神经胶质瘤抗肿瘤药物中脑胶质瘤特异性靶向分子为CTX。
[0025]本发明采用CTX做为携带广谱抗癌药物DOX的靶体，通过载体偶联上的多肽CTX的靶向性，可以运输抗癌药物有选择性到达肿瘤部位，并减少副作用。
【专利附图】
【附图说明】
[0026]图1是CTX-G0/D0X合成模式图。
[0027]图2A是本发明中用于抗肿瘤药物转运CTX靶向的氧化石墨烯纳米材料(G0-C00H)的透射电镜图像。
[0028]图2B是本发明中用于抗肿瘤药物转运CTX靶向的氧化石墨烯纳米材料(G0-C00H)的原子力显微镜图像。
[0029]图3是本发明中用于抗肿瘤药物转运CTX靶向的氧化石墨烯纳米材料的傅里叶红外(FTIR)谱图。
[0030]图4是本发明中用于抗肿瘤药物转运CTX靶向的氧化石墨烯纳米材料的XRD谱图。
[0031]图5是本发明中用于抗肿瘤药物转运CTX靶向的氧化石墨烯纳米材料静电吸附DOX的紫外可见光谱。[0032]图6是本发明中用于抗肿瘤药物转运CTX靶向的氧化石墨烯纳米材料静电吸附DOX的荧光图谱。
[0033]图7是本发明中用于抗肿瘤药物转运CTX靶向的氧化石墨烯纳米材料在pH7.0和
5.4情况下DOX释放实验
[0034]图8是本发明中用于抗肿瘤药物转运CTX靶向的氧化石墨烯纳米材料在不同浓度下与C6胶质瘤细胞共同孵育24小时后的细胞生存率。
[0035]图9是本发明中用于抗肿瘤药物转运CTX靶向的氧化石墨烯纳米材料与C6胶质瘤细胞用同一浓度的DOX (2.5 μ g.mL—1)共培养24小时后的光学显微镜图像。培养C6细胞的培养基含有(A)空白对照；(B)GO ； (C)CTX-GO ； (D)G0/D0X ； (E) CTX-G0/D0X ； (F)游离的DOX。
[0036]图10 使用游离 DOX，G0/D0X 和 CTX-G0/D0X 相同的 I，2.5 和 5 μ gm.L-1 的 DOX 浓
度，同C6细胞共培养24小时进行流式荧光定量。
[0037]图11使用共焦显微镜直接观察C6细胞内本发明中用于抗肿瘤药物转运CTX靶向的氧化石墨烯纳米材料的定位和分布。培养C6细胞的培养基含有(A)游离阿霉素，(B)G0/D0X和(OCTX-G0/D0X，三者偶联的阿霉素浓度相当于(0.5 μ g/毫升)，在6孔板内培养24h，紧接着与H0echst33258孵化10分钟后通过共焦显微镜观察。(i)DOX的荧光(实际为红色)；(ii)Hoechst33258标记 的细胞核(实际为蓝色)；(iii)Hoechst33258标记的细胞核与DOX荧光重叠；(iv)Hoechst33258标记的细胞核与DOX荧光重叠与细胞明场重叠；比例尺为10 μ m。
【具体实施方式】
[0038]本发明的说明书中所出现的缩略语分别为:
[0039]GO (Graphene oxide)氧化石墨烯；
[0040]XRD (X-ray diffraction) X 线衍射分析；
[0041]UV-VIS (Ultraviolet - visible spectroscopy)紫外可见吸收光谱；
[0042]AFM (AtomicForceMicroscope)原子力显微镜；
[0043]EDC (l-ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimide hydrochloride)l_ 乙基-3-(3- 二甲基氨丙基)-碳化二亚胺；
[0044]NHS (N-hydroxysuccinimide) N-羟基玻拍酸亚胺；
[0045]DOX (Doxorubicin)阿霉素；
[0046]CCK-8kit (Cell counting kit_8) CCK-8 细胞增殖 / 毒性检测试剂盒；
[0047]CTX (Chlorotoxin)竭氣毒素；
[0048]PBS (Phosphate buffered saline)憐酸盐缓冲液；
[0049]DMEM/F12 (Dulbeco，s modified agle，s medium/F12)改良的 Eagle/F12 培养基。
[0050]本发明提供的用于抗肿瘤药物转运CTX靶向的氧化石墨烯纳米材料，可以通过下述方法得到:
[0051]I)将5g石墨、IOOmL H2SO4-HClO4混合置于冰浴中，搅拌Ih使其充分混合，在冰浴中放置24h，移入40°C温水浴中继续搅拌24小时。120°C加热4个小时去酸，用蒸熘水将反应液稀释至800~1000ml后离心，后加适量0.1mNaOH混合90°C搅拌2小时，趁热过滤，用5%HC1和蒸馏水充分洗涤至接近中性，反复过滤，洗涤。在_40°C下真空冷冻干燥，得到氧化石墨稀(GO)样品。
[0052]2)150毫克的GO分散在20毫升PBS (0.1Μ，ρΗ=6.0)中，加入的4毫克NHS和6毫克EDC活化，室温反应。混合物调整pH值为8.0，在PBS中和15mgCTX反应48h。当反应完成后，获得的产物6000G离心，然后去离子水洗涤，反复重复上述步骤几次，在-40°C下真空冷冻干燥，得到CTX偶联的氧化石墨烯样品。
[0053]所述的CTX靶向的石墨烯纳米材料，其中CTX-GO显示为褶皱般片状的石墨烯薄片，横向宽度200nm。
[0054]本发明提供的制备用于抗肿瘤药物转运CTX靶向的氧化石墨烯纳米材料的方法，先将石墨氧化成氧化石墨烯，在其表面获得大量羧基，再将CTX通过EDC活化偶联到氧化石墨烯上，获得用于抗肿瘤药物转运CTX靶向的氧化石墨烯纳米材料。
[0055]具体地，其主要步骤为:
[0056]I)将5g石墨、IOOmL H2SO4-HClO4混合置于冰浴中，搅拌Ih使其充分混合，在冰浴中放置24h，移入40°C温水浴中继续搅拌24小时。120°C加热4个小时去酸，用蒸熘水将反应液稀释至800~1000ml后离心，后加适量0.1mNaOH混合90°C搅拌2小时，趁热过滤，用5%HC1和蒸馏水充分洗涤至接近中性，反复过滤，洗涤。在_40°C下真空冷冻干燥，得到氧化石墨稀(GO)样品。
[0057]2)将步骤I)制备的150毫克的GO分散在20毫升PBS(0.1Μ，ρΗ=6.0)中，加入的4毫克NHS和6毫克EDC活化 ，室温反应。混合物调整pH值为8.0，在PBS中和15mgCTX反应48h。当反应完成后，获得的产物6000G离心，然后去离子水洗涤，反复重复上述步骤几次，在-40°C下真空冷冻干燥，得到CTX偶联的氧化石墨烯样品。
[0058]本发明的用于抗肿瘤药物转运CTX靶向的氧化石墨烯纳米材料，脑胶质瘤特异性靶向分子为CTX。
[0059]本发明的CTX靶向的氧化石墨烯纳米材料用于脑胶质瘤靶向转运抗癌药物阿霉素。
[0060]本发明采用氧化石墨烯键合脑胶质瘤特异性靶向分子，制备出用于抗肿瘤药物转运CTX靶向的氧化石墨烯纳米材料。CTX偶联的GO可以被用于抗肿瘤药物阿霉素的转运。实验证明了阿霉素分子通过非共价相互作用，可以有效地装载在CTX-GO上，阿霉素从CTX-GO上释放是PH依赖的。细胞毒性研究表明，CTX-G0/D0X同游离DOX和G0/D0X相比可以高效诱导神经胶质瘤细胞的死亡，这是因为CTX偶联到GO上提高了阿霉素在神经胶质瘤细胞内的累积。
[0061]本发明的CTX (Chlorotoxin)祀向氧化石墨烯(GO)纳米材料,从实验证明了阿霉素分子通过非共价相互作用，可以有效地装载在CTX-GO上，阿霉素从CTX-GO上释放是pH依赖的。细胞毒性研究表明，CTX-G0/D0X同游离DOX和G0/D0X相比可以高效诱导神经胶质瘤细胞的死亡，这是因为CTX偶联到GO上提高了阿霉素在神经胶质瘤细胞内的累积。本发明的CTX-GO可以作为一个靶向胶质瘤的强有力、潜在的药物输送平台。
[0062]本发明首先采用靶向胶质瘤的靶体CTX共价偶联氧化石墨烯纳米材料的方法，先将石墨氧化成氧化石墨烯，在其表面获得大量羧基，再将CTX通过EDC活化偶联到氧化石墨烯上，获得用于抗肿瘤药物转运CTX靶向的新型氧化石墨烯纳米材料。
[0063]以下结合附图和具体实施例对本发明作详细说明。
[0064]实施例1
[0065]I)氧化石墨烯的制备
[0066]根据相关文献,适当改进氧化石墨’烯的制备，将5g石墨、IOOmL (3:1体积比)H2S04-HC104混合置于冰浴中，搅拌Ih使其充分混合，在冰浴中放置24h，移入40°C温水浴中继续搅拌24小时。120°C加热4个小时去酸，用蒸熘水将反应液稀释至800~1000ml后离心，后加适量0.1mNaOH混合90°C搅拌2小时，趁热过滤，用5%HC1和蒸馏水充分洗涤至接近中性，反复过滤，洗涤。在_40°C下真空冷冻干燥，得到氧化石墨烯样品。
[0067]2) CTX偶联的石墨烯的合成
[0068]150晕克的GO分散在20毫升PBS (0.1M, pH=6.0)中，加入的4晕克NHS和6晕克EDC活化，室温反应。混合物调整pH值为8.0，在PBS中和15mgCTX反应48h。当反应完成后，获得的产物6000G离心，然后去离子水洗涤，反复重复上述步骤几次，在-40°C下真空冷冻干燥，得到CTX偶联的氧化石墨烯样品。
[0069]3) DOX非共价结合石墨烯和CTX修饰的石墨烯
[0070]通过石墨烯表面羧基和阿霉素氨基之间的静电吸引共价吸附DOX到石墨烯上。具体来说，石墨烯和CTX修饰的石墨烯和阿霉素按照一定比例加热到40°C避光混合在水中搅拌8小时。然后混合物在_40°C下真空冷冻干燥获得G0/D0X和G0-CTX/D0X，合成模式如图1o
[0071]本发明制备的用于抗肿瘤药物转运CTX靶向的氧化石墨烯纳米材料的透射电镜，原子力显微镜图像，傅里叶红外，X射线衍射的表征见图2、图3、图4。
`[0072]从图2中可以看出，电镜观察到氧化石墨烯为褶皱般片状的石墨烯薄片，横向宽度200nm ;通过AFM测量G0-C00H厚度，厚度剖面大约3nm。
[0073]从图3中可以看出，CTX被成功键合到氧化石墨烯表面。
[0074]从图4中可以看出，石墨烯基平面存在羧基集团。
[0075]实施例2
[0076]氧化石墨烯装载效率的测定:
[0077]将实施例1中制备所得氧化石墨烯和CTX修饰的氧化石墨烯悬浮液与阿霉素混合，二者质量比为1:1。为加快阿霉素加载速度，加热到40°C摇床振荡8小时。每个样品检测阿霉素含量，测量的吸光度在480nm，计算阿霉素的加载百分比。从图5中可以得出每克GO-CTX的DOX载药量大约是570mg。
[0078]实施例3
[0079]氧化石墨烯荧光猝灭实验
[0080]将实施例1中制备所得ImgCTX-GO悬浮液与10微克阿霉素混合。紫外可见光谱通过JASCO V-550UV/vis光谱仪得到CTX-GO和DOX荧光光谱，激发波长480nm，吸收波长520nm，所有的测试都在室温下进行。从图6中所示固定在GO-CTX上的DOX出现了荧光强度急剧减少的情况(大约降低70%)。
[0081]实施例4
[0082]将实施例1中制备所得CTX-GO分别于与DOX按质量比1:10混合，样品I加入高浓度磷酸盐缓冲液调节PH值为5.4，样品2加入高浓度磷酸盐缓冲液调节pH值为7.0。在预定时间点分次取样5ml，离心取上清。同时补加等量的PBS5ml，总体积保持100ml。取上清液测定释放溶液中DOX含量。测量的吸光度在480nm，计算阿霉素的释放效率。图7描述了从G0-CTX/D0X上释放阿霉素的过程。可以看到从G0-CTX/D0X的释放是pH值依赖的。
[0083]实施例5[0084]细胞毒性:
[0085]I)细胞培养:C6胶质瘤细胞采用DMEM培养基(含10%胎牛血清，100U/ml青霉素，100U/ml链霉素)，在37° C含5%C02的保湿培养箱中培养24小时。
[0086]2)细胞毒性:将C6胶质瘤细胞以I X IO5的细胞密度接种于96孔板，孵育24小时。将实施例1中所制备的G0/D0X和CTX-G0/D0X与游离D0X，配制成DOX浓度等效为1.0,2.5和5.0 μ g.πιl1的溶液。与CTX-G0/D0X和G0/D0X有等效质量的CTX-G0和GO为对照组。细胞被继续培养24h，CCK-8KIT法进行了测定。简单地说，原有的细胞培养基被弃掉，然后每孔加入无血清的DMEM(含CCK-8KIT0.1mg.πιl1)。继续培养I小时，使用酶标仪在450nm进行吸光度测量，计算所得的细胞生存率见图8。
[0087]从图7中可以看出，GO(GO或者CTX-G0)和负载DOX的G0(G0/D0X或者CTX-G0/DOX)的毒性都是剂量依赖。配体(CTX)结合到载体(GO)表面，同单独的载体相比，能够增强对C6细胞的毒性。由载体携带的DOX比游离DOX在绝对数量上被细胞摄取的更多。因而在GO表面存在CTX的帮助下，GO可携带更多的DOX进入细胞。
[0088]实施例6
[0089]实施例1中制备所得的石墨烯对细胞形态的改变:
[0090]C6细胞被种植到六孔板中，每个孔细胞密度为IXlO5细胞为佳。培养后24小时后，细胞培养基换成新鲜培养基，其含有不同剂量的实施例1中制备所得的G0/D0X和CTX-G0/D0X和游离D0X，对应等效的DOX浓度为2.5 μ g.ml' CTX-G0/D0X和G0/D0X中等效质量的CTX-GO和GO为对照组。细胞被继续培养24h，使用光学显微镜照相，对细胞生存情况进行观察。
[0091]如图9所示，细胞和GO或者CTX-GO在一起共培养24h后，细胞密度和形态上并无明显的差异。因此，这证实了 GO的生物相容性。相反，用G0/D0X、CTX-G0/D0X或者游离的DOX和细胞共培养，可导致细胞形态的改变，比如从培养皿上脱离，细胞皱缩和出现外观圆形的细胞。在CTX-G0/D0X和细胞共培养情况下同G0/D0X或者游离DOX相比可导致更显著的细胞形态的改变和细胞死亡。这些结果同实施例5获得的结论相一致。
[0092]实施例7
[0093]C6细胞摄取石墨烯能力:
[0094]I) C6细胞被种植到六孔板中，每个孔细胞密度为I X IO5细胞为佳。培养后24小时后，细胞培养基换成新鲜培养基，其含有实施例1中制备所得的G0/D0X和CTX-G0/D0X以及游离D0X，对应等效的DOX浓度为1.0,2.5和5.0 μ g.πιl1，继续培养24h。培养结束后，细胞被PBS洗两次，胰酶消化，然后1000G离心5分钟，分离获得的细胞沉淀重悬在PBS中。激发波长488nm处检测单个细胞DOX荧光强度，流式细胞计数分析。
[0095]如图10所示，随着DOX量的增加，发现C6细胞表现出更高的平均荧光强度(MFI)，这表明细胞摄取阿霉素数量是随着DOX浓度增加而增加。同时，与没有配体结合的GO相比，共价结合CTX到GO能提高细胞摄取DOX的数量，这与经实施例5获得的CTX-G0/D0X对C6细胞毒性的增加结果相一致。然而CTX_G0/D0X、G0/D0X和游离DOX之间DOX细胞摄取量差异的趋势同实施例5获得的细胞毒性趋势是相反的。这可能由于GO激发态分子内能量传递，未从GO上释放的阿霉素其荧光被GO所猝灭。可见实施3的结果揭示了这种差异，从GO上释放出的阿霉素很有限，但偶联在GO上被猝灭了荧光的阿霉素实际上数量更多，所以导致G0/D0X的MFI显著下降，尽管其可能同游离的DOX相比，细胞会摄取更多的阿霉素。
[0096]2) C6细胞被种植到六孔板24X 24mm盖玻片上，每个孔细胞密度为I X IO5细胞为佳。培养后24小时后，细胞培养基换成新鲜培养基，其含有不同剂量的游离DOX、GO/DOX和CTX-G0/D0X,对应等效的DOX浓度为1.0,2.5和5.0 μ g.ι?1,继续培养24h。培养结束后，细胞被PBS洗两次，甲醇固定10分钟，空气中稍微晾干。上共聚焦显微镜前，用 0.5 μ g.mr1Hoechst33258染色10分钟以标记细胞核，PBS洗涤三次，使用共聚焦显微镜观察，H0echst33258激发波长是346nm，而DOX激发波长在51 Inm处，C6细胞高倍数图像使用60倍油镜获得。
[0097]如图11所示，显而易见，D0X、G0/D0X和CTX-G0/D0X在C6细胞里展现出明显不同的分布格式。CTX-G0/D0X处理过的C6细胞同G0/D0X相比，观察到更明亮和更聚集的颗粒，荧光颗粒均一分布在细胞核内。同样情况也出现在细胞质内，这表明CTX在提高纳米粒被靶细胞摄取能力和增强CTX-G0/D0X对特定靶细胞细胞毒性中扮演重要角色。CTX靶向的GO迅速被C6细胞摄取，这是由于CTX特异性和分布在细胞膜表面的受体反应所致，同以前CTX靶向肿瘤细胞的结果相类似。
[0098]另一方面，由于纳米颗粒的荧光和细胞核的荧光共定位在同一部位，游离DOX处理的细胞呈现淡色的细胞核，表明游离DOX主要分布在细胞核内，然而从GO释放的DOX更多分布在整个细胞，少量DOX留在细胞浆，这是源于没有从GO释放的D0X。
【权利要求】
1.一种蝎氯毒素靶向的氧化石墨烯纳米材料，通过下述方法得到: 1)按5g石墨和IOOmLH2SO4-HClO4混合溶液的比例，于冰浴中搅拌混合，再于温水浴中继续搅拌，加热至100-120°C去酸，稀释至800~1000ml后离心，加碱溶液混合沉淀，于70-90°C搅拌并趁热过滤，洗涤至接近中性，_40°C下真空冷冻干燥，得到氧化石墨烯；
H2SO4-HClO4 体积比为 3:1 ; 2)按150毫克氧化石墨烯和20毫升磷酸盐缓冲液的比例，加入4毫克的N-羟基丁二酰亚胺和6毫克的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐于室温活化反应；调整混合物的PH值为7.0-8.0，加入15mg的氯毒素反应，获得的产物离心、洗涤，_40°C下真空冷冻干燥，得到氯毒素靶向的氧化石墨烯纳米材料。
2.根据权利要求1所述氯毒素靶向的氧化石墨烯纳米材料，其中，氯毒素偶联的氧化石墨烯纳米材料为褶皱般片状的石墨烯薄片，横向宽度200nm。
3.根据权利要求1所述氯毒素靶向的氧化石墨烯纳米材料，其中，步骤I)中于冰浴中搅拌混合后放置24h，再于40°C温水浴中继续搅拌。
4.根据权利要求1所述氯毒素偶靶向的氧化石墨烯纳米材料，其中，步骤I)中是用0.1mNaOH溶液混合沉淀；用5%HC1和蒸馏水洗涤至接近中性。
5.一种制备权利要求1所述氯毒素靶向的氧化石墨烯纳米材料的方法，其步骤为: 1)按5g石墨和IOOmLH2SO4-HClO4混合溶液的比例，于冰浴中搅拌混合，再于温水浴中继续搅拌，加热至100-120°C去酸，稀释至800~1000ml后离心，加碱溶液混合沉淀，于70-90°C搅拌并趁热过滤，洗涤至接近中性，-40°C下真空冷冻干燥，得到氧化石墨烯；H2SO4-HClO4 体积比为 3:1 ； 2)按150毫克氧化石墨烯和20毫升磷酸盐缓冲液的比例，加入4毫克的N-羟基丁二酰亚胺和6毫克的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐于室温活化反应；调整混合物的PH值为7.0-8.0，加入15mg的氯毒素反应，获得的产物离心、洗涤，_40°C下真空冷冻干燥，得到氯毒素靶向的氧化石墨烯纳米材料。
6.根据权利要求5所述的方法，其中，步骤I)中于冰浴中搅拌混合后放置24h，再于40°C温水浴中继续搅拌。
7.根据权利要求5所述的方法，其中，步骤I)中是用0.1mNaOH溶液混合沉淀；用5%HC1和蒸馏水洗涤至接近中性。
8.权利要求1所述CTX祀向的氧化石墨烯纳米材料作为祀向抗肿瘤药物输送平台的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其中，抗肿瘤药物为神经胶质瘤抗肿瘤药物。
10.根据权利要求9所述的应用，其中，神经胶质瘤抗肿瘤药物中脑胶质瘤特异性靶向分子为蝎氯毒素。
【文档编号】A61K47/42GK103623419SQ201310631193
【公开日】2014年3月12日 申请日期:2013年11月28日 优先权日:2013年11月28日
【发明者】徐群渊, 王昊, 顾微, 叶玲, 肖宁 申请人:首都医科大学