一种可去聚乙二醇化的共装载阿霉素和siRNA载体及其合成方法
【专利摘要】一种可去聚乙二醇化的共装载阿霉素和siRNA载体及其合成方法，先对端甲氧基聚乙二醇进行胱胺化改性，得到胱胺化mPEG；接着利用碳二亚胺法将RAFT聚合链转移剂键接于胱胺化聚乙二醇链端，获得大分子RAFT链转移剂；随后实施RAFT聚合，得到端甲氧基聚乙二醇-聚(N-(3-二甲胺丙基)甲基丙烯酰胺)-聚(N-叔丁氧羰基丙烯酰肼)三嵌段共聚物；最后去除保护基(叔丁氧羰基)，得到端甲氧基聚乙二醇-聚(N-(3-二甲胺丙基)甲基丙烯酰胺)-聚丙烯酰肼三嵌段共聚物。该合成方法原料易得，且反应条件温和，得到的载体中各段聚合物分子量和链长度易控制，载阿霉素后能够自组装成纳米粒、药效高，实现了化疗药物和基因药物的共同装载。
【专利说明】一种可去聚乙二醇化的共装载阿霉素和siRNA载体及其合成方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物医用材料领域，具体涉及一种可去聚乙二醇化的共装载阿霉素和siRNA载体及其合成方法。
【背景技术】
[0002]化疗是临床肿瘤治疗的主要策略之一，它主要是利用循环系统将细胞毒性的化学药物递送至病变部位，同时不可避免地给身体中正常细胞带来毒副作用。化疗药物的疗效和毒副作用均与施用剂量密切相关。因此，如何提高化疗药物疗效并避免其毒副作用是始终是肿瘤化疗最关心的问题。目前，开发分子靶向药物和药物递送体系就成为研究热点。其中，分子靶向药物因开发困难和临床疗效远逊于预期等问题，进展相对缓慢；而基于生物材料的药物递送体系因载药量大、适用药物种类多、生物相容性好、可生物降解等优点，成为研究重点，已开发出纳米粒、纳米凝胶、聚合物-药物偶联物、纳米胶束等载体形式。在药物递送体系开发中，普遍通过聚乙二醇修饰载体，以避免载体在血液中循环时被免疫系统快速清除掉，利于载体在肿瘤区的富集。然而，聚乙二醇修饰也降低了载体与细胞相互作用，使载体经胞吞作用进入肿瘤细胞内或从内涵体内逃逸进入细胞质变得困难。可见，适时将载体上修饰的聚乙二醇去掉，将利于提高药物疗效。 [0003]阿霉素是临床上广泛应用的抗肿瘤药物，对肺癌、乳腺癌、膀胱癌等均有很好的疗效。与大多数药物一样，阿霉素水溶性和选择性均差，临床上多以其盐酸盐形式，存在生物利用度低、半衰期短、毒副作用明显等缺点，严重制约其临床疗效。因此，将其装载于各种形式的药物载体中，将可有效缓解/克服这些缺点。然而，这仍无法解决阿霉素的耐药性问题。耐药性的产生通常是因为肿瘤细胞表达某种蛋白如P-gp蛋白时将药物泵出细胞外以避免其毒性作用。近年来，基因治疗被视为提高化疗疗效和从根本上消除耐药性的有前景的方法，如siRNA法。它可以通过沉默肿瘤细胞产生的耐药性蛋白，实现化疗药物在肿瘤细胞内的聚集，发挥治疗作用。然而，基因药物的递送更是一个挑战性难题，因为它通常荷负电，极易被免疫系统清除而无法发挥治疗作用。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于提供一种可去聚乙二醇化的共装载阿霉素和SiRNA载体及其合成方法，该合成方法原料易得，且反应条件温和，得到的载体中各段聚合物分子量和链长度易控制，载阿霉素后能够自组装成纳米粒、药效高，实现了化疗药物和基因药物的共同装载。
[0005]为达到上述目的，本发明可去聚乙二醇化的共装载阿霉素和siRNA载体的合成方法，包括如下步骤:
[0006]I) mPEG大分子RAFT链转移剂的合成:
[0007]将胱胺化端甲氧基聚乙二醇溶于无水有机溶剂中，然后在氮气氛保护下向其中加入带一个羧基的RAFT链转移剂、4- 二甲氨基吡啶以及二环己基碳二亚胺，再在室温反应24小时~72小时，得到反应液；向反应液中加入冷乙醚使反应液中析出固体，将反应液中的固体分离后收集，即得mPEG大分子RAFT链转移剂；其中，胱胺化端甲氧基聚乙二醇、带一个羧基的RAFT链转移剂、4-二甲氨基吡啶和二环己基碳二亚胺的摩尔比为1:(2~20):1:(4 ~40)；
[0008]2) mPEG-S-S-PDMAPMA-CTA 的合成:
[0009]将mPEG大分子RAFT链转移剂、N_(3_ 二甲胺丙基)甲基丙烯酰胺和引发剂溶于无水无氧有机溶剂中，然后于60°C~65°C反应24小时~48小时，得到反应液；反应液经浓缩后用冷乙醚沉淀，再将沉淀分离并真空干燥，得到mPEG-S-S-PDMAPMA-CTA ;其中，mPEG大分子RAFT链转移剂和N-(3- 二甲胺丙基)甲基丙烯酰胺的摩尔比为10: (100~600)；
[0010]3) N-叔丁氧羰基丙烯酰肼的合成:
[0011]将叔丁氧羰基肼溶于O~4°C的水中，然后在搅拌下滴加丙烯酰氯有机溶液，同时调节PH值至8~9，并在室温反应4~10小时，最后将得到的产物用二氯甲烷萃取、重结晶并真空干燥，得到N-叔 丁氧羰基丙烯酰肼；其中，叔丁氧羰基肼与丙烯酰氯有机溶液中的丙烯酰氯的摩尔比为1:1.1;
[0012]4) mPEG-S-S-PDMAPMA-PBocAAH-CTA 的合成:
[0013]将mPEG-S-S-PDMAPMA-CTA、N-叔丁氧羰基丙烯酰肼和引发剂溶于无水无氧有机溶剂中，然后于60°C~65°C反应24小时~48小时，得到反应液；反应液经浓缩后用冷乙醚沉淀，再将沉淀分离并真空干燥，得到mPEG-S-S-PDMAPMA-PBocAAH-CTA ;其中，mPEG-S-S-PDMAPMA-CTA与N-叔丁氧羰基丙烯酰肼的摩尔比为5: (100~500)；
[0014]5)将mPEG-S-S-PDMAPMA-PBocAAH-CTA上的叔丁氧羰基保护基脱除，即得到可去聚乙二醇化的共装载阿霉素和siRNA载体。
[0015]所述的胱胺化端甲氧基聚乙二醇采用如下步骤合成:
[0016]a)将分子量为800~4000Da的端甲氧基聚乙二醇、二月桂酸二丁基锡和2，2’-二硫代二乙基异氰酸酯溶于无水甲苯中，在氮气氛下于85°C反应48小时，然后用无水正己烷沉淀出固体，收集固体真空干燥，得到2，2’ - 二硫代二乙基异氰酸酯改性的mPEG ;其中，端甲氧基聚乙二醇、二月桂酸二丁基锡以及2，2’-二硫代二乙基异氰酸酯的摩尔比为1:(0.02 ~0.08): (3 ~8)；
[0017]b)将2，2’ - 二硫代二乙基异氰酸酯改性mPEG溶于蒸馏水中，然后在60°C反应6小时，最后将得到的反应液经透析和冻干，得到胱胺化端甲氧基聚乙二醇。
[0018]所述的步骤I)中带一个羧基的RAFT链转移剂为S-1-十二烷基-S’_(α，α’-二甲基-α "-乙酸)三硫代碳酸酯、4-氰基_4-[(十二烷基硫烷基硫羰基)硫烷基]戊酸、4-氰基-4-(硫代苯甲酰)戊酸或4-氰基戊酸二硫代苯甲酸。
[0019]所述的步骤I)中每升无水有机溶剂中溶解5g~40g胱胺化端甲氧基聚乙二醇，步骤2)中每升无水无氧有机溶剂中溶解50g~150g的mPEG大分子RAFT链转移剂，步骤
4)中每升无水无氧有机溶剂溶解50g~200g的mPEG-S-S-PDMAPMA-CTA。
[0020]所述的步骤2)中N-(3_ 二甲胺丙基)甲基丙烯酰胺与引发剂的摩尔比为(100~600):1，步骤4)中N-叔丁氧羰基丙烯酰肼与引发剂的摩尔比为(100~500):1。
[0021]所述的步骤2)和步骤4)中无水无氧有机溶剂为无水无氧二氧六环、无水无氧四氢呋喃或无水无氧二甲基甲酰胺。
[0022]所述的步骤2)和步骤4)中引发剂为偶氮二异丁腈或4，4’-偶氮双(氰基戊酸)。
[0023]所述的步骤5)将mPEG-S-S-PDMAPMA-PBocAAH-CTA上的叔丁氧羰基保护基脱除的方法为:
[0024]将mPEG-S-S-PDMAPMA-CTA溶于无水有机溶剂中，于(TC滴加到体积比为1:1的三氟乙酸和二氯甲烷混合溶剂中，然后升至室温反应5小时；减压蒸馏去除溶剂，再向得到的固体中加入碳酸氢钠水溶液进行中和处理，接着装入截留分子量为3500Da的透析袋中对质量浓度为0.25%的氨水透析48小时，最后冻干，即得到可去聚乙二醇化的共装载阿霉素和siRNA载体；其中，mPEG-S-S-PDMAPMA-CTA和三氟乙酸的摩尔比为1: (15~40)。
[0025]所述的步骤I)以及步骤5)中的无水有机溶剂为无水二氯甲烷、无水氯仿、无水二氧六环或无水四氢呋喃。
[0026]一种所述的方法合成的可去聚乙二醇化的共装载阿霉素和siRNA载体，化学名称为端甲氧基聚乙二醇-聚(N-(3-二甲胺丙基)甲基丙烯酰胺)_聚丙烯酰肼三嵌段共聚物，结构式为:
[0027]
【权利要求】
1.一种可去聚乙二醇化的共装载阿霉素和SiRNA载体的合成方法，其特征在于，包括如下步骤: DmPEG大分子RAFT链转移剂的合成: 将胱胺化端甲氧基聚乙二醇溶于无水有机溶剂中，然后在氮气氛保护下向其中加入带一个羧基的RAFT链转移剂、4- 二甲氨基吡啶以及二环己基碳二亚胺，再在室温反应24小时~72小时，得到反应液；向反应液中加入冷乙醚使反应液中析出固体，将反应液中的固体分离后收集，即得mPEG大分子RAFT链转移剂；其中，胱胺化端甲氧基聚乙二醇、带一个羧基的RAFT链转移剂、4- 二甲氨基吡啶和二环己基碳二亚胺的摩尔比为1: (2~20):1:(4 ~40)； 2)mPEG-S-S-PDMAPMA-CTA 的合成: 将mPEG大分子RAFT链转移剂、N_(3_ 二甲胺丙基)甲基丙烯酰胺和引发剂溶于无水无氧有机溶剂中，然后于60°C~65°C反应24小时~48小时，得到反应液；反应液经浓缩后用冷乙醚沉淀，再将沉淀分离并真空干燥，得到mPEG-S-S-PDMAPMA-CTA ;其中，mPEG大分子RAFT链转移剂和N-(3- 二甲胺丙基)甲基丙烯酰胺的摩尔比为10: (100~600)； 3)N-叔丁氧羰基丙烯酰肼的合成: 将叔丁氧羰基肼溶于0°C~4°C的水中，然后在搅拌下滴加丙烯酰氯有机溶液，同时调节pH值至8~9，并在室温反应4小时~10小时，最后将得到的产物用二氯甲烷萃取、重结晶并真空干燥，得到N-叔丁氧羰基丙烯酰肼；其中，叔丁氧羰基肼与丙烯酰氯有机溶液中的丙烯酰氯的摩尔比为1:1.1 ;
4)mPEG-S-S-PDMAPMA-PBocAAH-CTA 的合成: 将mPEG-S-S-PDMAPMA-CTA、N-叔丁氧羰基丙烯酰肼和引发剂溶于无水无氧有机溶剂中，然后于60°C~65°C反应24小时~48小时，得到反应液；反应液经浓缩后用冷乙醚沉淀，再将沉淀分离并真空干燥，得到mPEG-S-S-PDMAPMA-PBocAAH-CTA ;其中，mPEG-S-S-PDMAPMA-CTA与N-叔丁氧羰基丙烯酰肼的摩尔比为5: (100~500)； 5)将mPEG-S-S-PDMAPMA-PBocAAH-CTA上的叔丁氧羰基保护基脱除，即得到可去聚乙二醇化的共装载阿霉素和siRNA载体。
2.根据权利要求1所述的可去聚乙二醇化的共装载阿霉素和siRNA载体的合成方法，其特征在于，所述的胱胺化端甲氧基聚乙二醇采用如下步骤合成: a)将分子量为800~4000Da的端甲氧基聚乙二醇、二月桂酸二丁基锡和2，2’- 二硫代二乙基异氰酸酯溶于无水甲苯中，在氮气氛下于85°C反应48小时，然后用无水正己烷沉淀出固体，收集固体真空干燥，得到2，2’ - 二硫代二乙基异氰酸酯改性的mPEG ;其中，端甲氧基聚乙二醇、二月桂酸二丁基锡以及2，2’-二硫代二乙基异氰酸酯的摩尔比为1:(0.02~0.08): (3 ~8)； b)将2，2’- 二硫代二乙基异氰酸酯改性mPEG溶于蒸馏水中，然后在60°C反应6小时，最后将得到的反应液经透析和冻干，得到胱胺化端甲氧基聚乙二醇。
3.根据权利要求1所述的可去聚乙二醇化的共装载阿霉素和siRNA载体的合成方法，其特征在于:所述的步骤I)中带一个羧基的RAFT链转移剂为S-1-十二烷基-S’_(a, a’-二甲基-a"-乙酸)二硫代碳酸酯、4_氰基_4_[(十二烷基硫烷基硫擬基)硫烷基]戊酸、4-氰基-4-(硫代苯甲酰)戊酸或4-氰基戊酸二硫代苯甲酸。
4.根据权利要求1所述的可去聚乙二醇化的共装载阿霉素和siRNA载体的合成方法，其特征在于:所述的步骤I)中每升无水有机溶剂中溶解5g~40g胱胺化端甲氧基聚乙二醇，步骤2)中每升无水无氧有机溶剂中溶解50g~150g的mPEG大分子RAFT链转移剂，步骤4)中每升无水无氧有机溶剂溶解50g~200g的mPEG-S-S-PDMAPMA-CTA。
5.根据权利要求1所述的可去聚乙二醇化的共装载阿霉素和siRNA载体的合成方法，其特征在于:所述的步骤2)中N-(3-二甲胺丙基)甲基丙烯酰胺与引发剂的摩尔比为(100~600):1，步骤4)中N-叔丁氧羰基丙烯酰肼与引发剂的摩尔比为(100~500):1。
6.根据权利要求1所述的可去聚乙二醇化的共装载阿霉素和siRNA载体的合成方法，其特征在于:所述的步骤2)和步骤4)中无水无氧有机溶剂为无水无氧二氧六环、无水无氧四氢呋喃或无水无氧二甲基甲酰胺。
7.根据权利要求1所述的可去聚乙二醇化的共装载阿霉素和siRNA载体的合成方法，其特征在于:所述的步骤2)和步骤4)中引发剂为偶氮二异丁腈或4，4’ -偶氮双(氰基戊酸)。
8.根据权利要求1所述的可去聚乙二醇化的共装载阿霉素和siRNA载体的合成方法，其特征在于，所述的步骤5)将mPEG-S-S-PDMAPMA-PBocAAH-CTA上的叔丁氧羰基保护基脱除的方法为: 将mPEG-S-S-PDMAPMA-PBocAAH-CTA溶于无水有机溶剂中，于(TC滴加到体积比为1:1的三氟乙酸和二氯甲烷混合溶剂中，然后升至室温反应5小时；减压蒸馏去除溶剂，再向得到的固体中加入碳酸氢钠水溶液进行中和处理，接着装入截留分子量为3500Da的透析袋中对质量浓度为0.25%的氨水透析48小时，最后冻干，即得到可去聚乙二醇化的共装载阿霉素和siRNA载体；其中，mPEG-S-S-PDMAPMA-PBocAAH-CTA和三氟乙酸的摩尔比为1:(15 ~40)。
9.根据权利要求8所述的可去聚乙二醇化的共装载阿霉素和siRNA载体的合成方法，其特征在于:所述的步骤I)以及步骤5)中的无水有机溶剂为无水二氯甲烷、无水氯仿、无水二氧六环或无水四氢呋喃。
10.一种如权利要求1~9中任意一项权利要求所述的方法合成的可去聚乙二醇化的共装载阿霉素和siRNA载体，其特征在于，化学名称为端甲氧基聚乙二醇-聚(N-(3-二甲胺丙基)甲基丙烯酰胺)_聚丙烯酰肼三嵌段共聚物，结构式为:
【文档编号】A61K48/00GK104027816SQ201410268060
【公开日】2014年9月10日 申请日期:2014年6月16日 优先权日:2014年6月16日
【发明者】姚煜, 钱军民, 徐明辉, 胥伟军 申请人:西安交通大学