专利名称：一种定点修饰n-末端的聚乙二醇化生长激素拮抗剂及其制备方法
技术领域：
本发明涉及生物医药领域，具体地，本发明涉及一种定点修饰N-末端的聚乙二醇(PEG)化生长激素拮抗剂，以及其制备方法。
背景技术：
生长激素的主要作用在于促进生长，涉及调节身体的生长，以及调节蛋白质、碳水化合物和脂类的代谢。生长激素的代谢作用由胰岛素样生长因子-1 (IGF-1)介导。垂体生长激素腺瘤是常见的垂体肿瘤之一，由于生长激素(GH)过度分泌、IGF-1浓度增高，导致巨人症和肢端肥大症，其病亡率可高达20%-30%。目前的治疗方法主要是减少或抑制生长激素的分泌，以降低生长激素的水平，防止生长激素的过度分泌，但是治疗效果不佳。生长激素拮抗剂(GHA)可通过阻止生长激素与其受体(GHR)的结合，阻止后续的信号转导，降低血浆IGF-1的水平，从而达到治疗的目的。GHA是通过置换人生长激素(hGH)的8个氨基酸残基，并用基因工程的方法表达出来的一种蛋白质。这8个氨基酸残基在人生长激素第I结合位点内，对生长激素与GHR的结合功能特别重要。其中，第18位天冬氨酸取代组氨酸(H18D)、第21位天冬酰胺取代组氨酸(H21N)、第167位天冬酰胺取代精氨酸(R167N)、第168位丙氨酸取代赖氨酸(K168A)、第171位丝氨酸取代天冬氨酸(D171S)、第172位精氨酸取代赖氨酸(K172R)、第174位丝氨酸取代谷氨酸(E174S)和第179位苏氨酸取代异亮氨酸(I179T)。通过 氨基酸的置换，使第I结合位点与GHR的亲和力大为增加。此外，B2036是一种人生长激素的9个氨基酸残基被置换的蛋白质。除了置换上述8个氨基酸残基以外，还有第I结合位点的第120位甘氨酸取代赖氨酸(G120K)。然而，B2036分子与GHR 二聚体的亲和力却与人生长激素相当。这是由于尽管B2036的第I结合位点与GHR的亲和力有所增加，但第2结合位点几乎失去了与GHR的结合能力，从而能够抑制生长激素的生物学功能。由于B2036在体内的血浆半衰期短，仅为15-20分钟，所以不能持续阻断生长激素的功能。在临床使用时需要加大给药量和给药次数，并带来一定的毒副作用，增加了病人的痛苦与经济负担。聚乙二醇(PEG)修饰被认为是一种能有效克服蛋白质药物血浆半衰期短的方法之一。这是因为PEG自身有着巨大的优势，它是一种线性的、在溶液中可自由卷曲且不带电荷的聚合物，具有无毒、微弱的抗原性和良好的生物相容性，已被美国FDA批准用于人体。目前已有多种PEG修饰的蛋白质药物被美国FDA批准上市，如PEG修饰的干扰素a 2a(Pegasys, Roche公司)等。使用PEG共价修饰蛋白质,可以延长蛋白质的体内循环半衰期，降低蛋白质的免疫原性，增加蛋白质的溶解性以及改变蛋白质在人体内的生物学分布。PEG修饰蛋白质和多肽主要是氨基修饰(包括N端氨基的酰化修饰、赖氨酸侧链氨基的酰化修饰、N端氨基的烷基化修饰)、羧基修饰以及巯基修饰等。其中，定点修饰主要包括N-末端修饰和半胱氨酸残基修饰。N-末端修饰是通过PEG醛与一定量的还原剂如氰基硼氢化钠(NaCNBH3)在偏酸的环境下进行的还原烷基化反应。
Kopchick 等(Endocr.Rev.2002，23:623-646)将 B2036 分子共价修饰上 4 6个分子量为5kDa的PEG分子，得到的生长激素类似物称为PEG-B2036，即培维索孟(Pegvisomant)。由于Pegvisomant第168位和172位都不是赖氨酸残基,所以PEG化对Pegvisomant的第I结合位点的影响小于PEG_hGH(G120K)。而Pegvisomant第120位为赖氨酸残基，可被PEG化,进一步降低了它与第2结合位点的亲和力。Pegvisomant于2003年获得美国FDA的批准上市，用于治疗垂体生长激素腺瘤引起的肢端肥大症，商品名索马沃(Somavert)0目前,欧洲也已将其用于肢端肥大症的临床治疗。但是，由于Pegvisomant是在B2036分子上接上4飞个分子量为5kDa的PEG分子。这种修饰产物不均一，修饰位点随机性强，每种成分无法定量、也无法进行分离，使得批次间的重复性较差，不同批次间的产物生物活性或有差别，不利于产品的质量控制和临床应用。Ross等(J.Clin.Endocrinol.Metab.2001, 86:1716-1723)的研究也表明Pegvisomant与GHR 二聚体的亲和力要低于人生长激素。Pegvisomant与GHR 二聚体的亲和力为PEG-hGH (G120K)的6.6倍，但只有人生长激素的1/40。因此，Pegvisomant的浓度要远高于人生长激素才能达到拮抗的目的。这可能是因为在B2036分子的8个赖氨酸残基及N-末端残基上修饰4 6个5kDa的PEG分子后，降低了 Pegvisomant第I结合位点与GHR的亲和力。
发明内容
针对上述问题，本发明提出了一种PEG修饰GHA的方法。分别采用分子量为20kDa和40kDa的PEG醛定点修饰GHA的N-末端的α -氨基，制备分子量均一的定点修饰N-末端的PEG化GHA，即每个GHA分子的N-末端结合I个PEG分子。最终修饰产物成分单一，易于分离纯化，产物收率高，预期能减少GHA生物活性的损失。本发明的另一个目的还在于解决PEG修饰后GHA的半衰期增加而其药效降低的问题。通过比较分子量为20kDa和40kDa的PEG修饰产物对血浆IGF-1的抑制作用，探讨不同链长PEG对GHA生物活性的影响，寻找PEG修饰GHA的药代动力学与药效动力学间的平衡点。在实施方案中发现，20kDa的PEG修饰 产物(M-P20K-GHA)表现出较高的药效，而40kDa的PEG修饰产物(M-P40K-GHA)的药效几乎消失。因此，20kDa的PEG醛为优选的PEG用于修饰GHA。本发明制备N-末端PEG单修饰的生长激素拮抗剂的方法，包括以下步骤:(I)确定M-P20K-GHA的制备条件:将GHA置换到50mM NaAc-HAc缓冲液(ρΗ5.5)中。调整GHA浓度为2.2mg/mL (0.1mM)，按GHA:PEG醛(20kDa)=NaCNBH3的不同摩尔比例，于4°C分别反应过夜Γ16小时)。以Superdex200凝胶过滤柱(IcmX 30cm)检测PEG修饰产物，洗脱液为20mM磷酸缓冲液(pH7.2)。(2)修饰产物M-P20K-GHA的纯化及鉴定:根据步骤I所述，选择GHA:PEG醛(20kDa) =NaCNBH3 摩尔比 1:8:80 用于制备 M-P20K-GHA。以 Superdex200 凝胶过滤柱(1.6cmX60cm)对修饰产物进行分离纯化，洗脱液为20mM磷酸缓冲液(pH7.2)。收集修饰产物的洗脱峰，浓缩后用SDS-PAGE和凝胶过滤色谱对修饰产物进行鉴定。(3)确定M-P40K-GHA的制备条件:将GHA置换到50mM NaAc-HAc缓冲液(ρΗ5.5)中。调整GHA浓度为2.2mg/mL (0.1mM)，按GHA:PEG醛(40kDa):NaCNBH3的不同摩尔比例，于4°C分别反应过夜Γ16小时)。以Superdex200凝胶过滤柱(IcmX 30cm)检测PEG修饰产物，洗脱液为20mM磷酸缓冲液(pH7.2)。(4)修饰产物M-P40K-GHA的纯化及鉴定:根据步骤3所述，选择GHA:PEG醛(40kDa) =NaCNBH3 摩尔比 1:4:80 用于制备 M-P40K-GHA。以 Superdex200 凝胶过滤柱(1.6cmX60cm)对修饰产物进行分离纯化，洗脱液为20mM磷酸缓冲液(pH7.2)。收集产物的洗脱峰，浓缩后用SDS-PAGE和凝胶过滤色谱进行产物鉴定。(5)M-P20K-GHA 和 M-P40K-GHA 的修饰位点鉴定:将 GHA、M-P20K-GHA 及M-P40K-GHA置换到含2.0M脲的NH4HCO3 (0.05M，pH8.3)溶液中，将蛋白浓度调整为1.0mg/mL。将胰蛋白酶和蛋白以质量比为1:100的比例，于37°C下孵育10小时，酶解产物使用反相HPLC柱(Proteonavi,0.46cmX25cm)进行酶切片段的分离和鉴定。(6)M-P20K-GHA与M-P40K-GHA的药效动力学:选取250 300克雄性SD大鼠20只，随机分为4组。其中，第I组为对照组，皮下注射0.15M的NaCl (500 μ I);第2_4组分别为 GHA、M-P20K-GHA 及 M-P40K-GHA 组。注射剂量为 2mg GHA/kg SD 大鼠，共注射 500 μ I。经皮下注射后，于第1、4、24、48、72、96、120和144小时进行眼眶采血，离心收集血浆。用ELISA试剂盒测定血浆中IGF-1的含量。与传统的GHA修饰策略相比，本发明的优势在于提供了一种将不同分子量的PEG醛修饰在GHA的N-末端的方法，从而得到均一且定点的PEG单修饰产物，使GHA的活性中心不被PEG修饰，减少GHA生物活性的损失。以M-P20K-GHA及M-P40K-GHA为例，通过比较不同分子量的PEG醛单修饰产物，考察其对血浆IGF-1的抑制作用，探讨不同链长PEG对GHA生物活性的影响，确定修饰GHA的最佳PEG链长。
图1分子量为20kDa的PEG醛修饰GHA的凝胶过滤色谱图。使用的是Superdex200凝胶过滤柱(lcmX30cm), 洗脱液流速为0.5ml/min,洗脱缓冲液为20mM磷酸缓冲液(pH7.2)。样品为不同反应比例下制备的PEG修饰产物。图2分子量为40kDa的PEG醛修饰GHA的凝胶过滤色谱图。使用的是Superdex200凝胶过滤柱(lcmX30cm),洗脱液流速为0.5ml/min,洗脱缓冲液为20mM磷酸缓冲液(pH7.2)。样品为不同反应比例下制备的PEG修饰产物。图3凝胶过滤柱分离纯化PEG修饰产物。使用的是Superdex200凝胶过滤柱(1.6cmX 60cm)，洗脱液流速为1.0ml/min，洗脱缓冲液为20mM磷酸缓冲液(pH7.2)。收集箭头所示的洗脱峰，即对应于纯化的M-P20K-GHA和M-P40K-GHA。图4PEG修饰产物的纯度鉴定。凝胶过滤色谱图使用的是Superdex200凝胶过滤柱(lcmX 30cm)，洗脱液流速为0.5ml/min，洗脱缓冲液为20mM磷酸缓冲液(pH7.2)。插图是SDS-PAGE分析结果。第I泳道是标准蛋白，第2泳道是GHA，第3泳道是M-P20K-GHA，第4 泳道是 M-P40K-GHA。图5PEG修饰位点的鉴定图谱。使用反相HPLC柱(Proteonavi,0.46cmX25cm)进行酶切肽段分离。图6SD大鼠血浆中IGF-1的浓度变化曲线。SD大鼠经皮下注射PEG修饰产物，血浆中IGF-1的含量由IGF-1 ELISA定量试剂盒测定。
具体实施例方式实施例1M-P20K-GHA制备条件的确定将GHA 置换到 50mM NaAc-HAc 缓冲液(ρΗ5.5)中。调整 GHA 浓度为 2.2mg/mL(即 0.1mM),按 GHA:PEG 醛(20kDa):NaCNBH3 摩尔比为 1:4:40、1:4:80、1:6:80、1:6:60、1:6:120、1:8:40、1:8:80 以及 1:8:160，4°C分别反应过夜Γ16 小时)。以 Superdex200 凝胶过滤柱(lcmX30cm)对修饰产物进行检测，洗脱液为20mM磷酸缓冲液(pH7.2)。20kDaPEG醛修饰GHA的结果如图1所示，以M-P20K-GHA的峰面积与总的峰面积比值大小来衡量产率。随着20kDa PEG醛和NaCNBH3反应比例的提高，M-P20K-GHA的产率也随之提高。但是，随着反应比例的增加，出现了多修饰的GHA，即D-P20K-GHA，并随着反应比例的增加而增力卩。此外，随着反应比例的增加，GHA的残留量显著下降；当6撤:PEG醛=NaCNBH3W摩尔比为1:8:160时，GHA基本反应完全。虽然GHA:PEG醛:NaCNBH3的摩尔比为1:8:160时，能够得到较多的GHA修饰产物，但是由于D-P20K-GHA的产率较多，因而GHA =PEG醛=NaCNBH3的摩尔比为1:8:160时，M-P20K-GHA的产率要低于摩尔比为1:8:8θΓ75%)。因此，选择GHA:PEG 醛(20kDa) =NaCNBH3 摩尔比 1:8:80 用于制备 M-P20K-GHA。实施例2M-P40K-GHA制备条件的确定将GHA 置换到 50mM NaAc-HAc 缓冲液(ρΗ5.5)中。调整 GHA 浓度为 2.2mg/mL (BP0.1mM)，按 GHA:PEG 醛(40kDa):NaCNBH3 摩尔比为 1:4:40、1:4:80、1:6:60、1:6:120、1:8:40以及1:8:80,4°C分别反应过夜( 16小时)。以Superdex200凝胶过滤柱(IcmX 30cm)对得到的结合产物进行检测，洗脱液为20mM磷酸缓冲液(pH7.2)。如图2所示，与20kDa的PEG醛修饰GHA的情况基本相同，采用40kDa的PEG醛修饰GHA，随着GHA =PEG醛(40kDa):NaCNBH3摩尔比例的增加，M-P40K-GHA的产率增加，GHA残量逐渐减少。虽然GHA:PEG醛(40kDa):NaCNBH3的摩尔比为1:8:80时，能够得到较多的GHA修饰产物，但是由于D-P40K-GHA的产率较多，因而GHA:PEG醛:NaCNBH3的摩尔比为1:8:80时，M-P40K-GHA的产率要低于摩尔比为 1:4:80( 71%)。因此，选择 GHA:PEG 醛:NaCNBH3 摩尔比 1:4:80 用于制备 M-P40K-GHA。实施例3M-P20K-GHA与M-P40K-GHA的分离纯化及鉴定根据实施例1所述，选择GHA:PEG醛(20kDa):NaCNBH3摩尔比1:8:80用于制备M-P20K-GHA。根据实施例2所述，选择GHA =PEG醛(40kDa):NaCNBH3摩尔比1:4:80用于制备M-P40K-GHA。以Superdex200凝胶过滤柱(1.6cmX60cm)对修饰产物进行分离纯化,洗脱液为20mM磷酸盐缓冲液(pH7.2)。如图3所示，经洗脱后出现了三个洗脱峰，分别对应于PEG的二修饰产物(每个GHA结合2个PEG)、PEG的单修饰产物(每个GHA结合I个PEG)和未修饰的GHA。分别收集两种PEG修饰的单修饰产物，浓缩后用SDS-PAGE和凝胶过滤色谱鉴定。收集修饰产物的洗脱液，浓缩后用于后续的产品鉴定。实施例4M-P20K-GHA 与 M-P40K-GHA 的鉴定用SDS-PAGE和凝胶过滤色谱鉴定M-P20K-GHA与M-P40K-GHA。如图4插图所示，M-P20K-GHA与M-P40K-GHA在SDS-PAGE电泳图上均表现出一条带，这表明这两种PEG修饰产物具有较高的纯度。M-P40K-GHA电泳带的迁移速率要慢于M-P20K-GHA，而M-P20K-GHA要慢于GHA。这表明PEG修饰能增加GHA的分子量 ，且M-P40K-GHA的分子量要高于M-P20K-GHA。如图4所示，经缓冲液洗脱后，M-P20K-GHA与M-P40K-GHA分别在Superdex200凝胶过滤柱(1.0cmX30cm)出现I个单一的洗脱峰。其中，M-P20K-GHA的出峰时间要快于M-P40K-GHA,而要慢于GHA。这表明M-P20K-GHA与M-P40K-GHA具有较高的纯度，且分子量要大于GHA。 实施例5PEG修饰位点的鉴定将GHA、M-P20K-GHA 与 M-P40K-GHA 经含 2.0M 脲的 NH4HCO3 (0.05M, ρΗ8.3)的缓冲液中充分透析，而后调节浓度至1.0mg/mL。取胰蛋白酶,用超纯水配置浓度为1.0mg/mL的储液。按照胰蛋白酶和蛋白的质量比为1:100的比例，分别加入胰蛋白酶储液，于37°C孵育10小时。使用反相HPLC柱(Proteonavi,0.46cmX25cm)进行酶切肽段分离。反相HPLC柱使用95%的溶液A (含0.1 %三氟乙酸的超纯水)和5%的溶液B (含0.1 %三氟乙酸的乙腈)充分平衡，流速为0.5mL/min。采用线性洗脱方式于IOOmin从5%溶液B升至50%溶液B，检测流出液在214nm的吸收值。结果如图5所示，胰蛋白酶可以将GHA及其PEG修饰产物切成不同的肽段。其中以T2肽段作为对照，M-P20K-GHA和M-P40K-GHA与未修饰的GHA相比，由8个氨基酸残基组成且N-末端所在的Tl肽段(FPTIPLSR)消失，这是因为Tl段经PEG修饰后，出峰位置发生改变，这说明了 M-P20K-GHA和M-P40K-GHA的修饰位点均在N-末端的α -氨基。除此之夕卜，其它酶切片段与GHA相比无显著变化。这表明PEG能特异性地修饰GHA的N末端。实施例6M-P20K-GHA和M-P40K-GHA的药效动力学评价选取25(Γ300克雄性SD大鼠20只，随机分为4组。其中，第I组为对照组，皮下注射 0.15mol/L 的 NaCl (500 μ I);第 2-4 组分别为 GHA、M-P20K-GHA 及 M-P40K-GHA 组。注射剂量为2mg GHA/kg 30大鼠，注射50(^1，经皮下注射后，于1、4、24、48、72、96、120和144小时进行眼眶采血，离心收集血 浆。以IGF-1浓度高低作为评价GHA药效的指标。血浆中IGF-1的含量由IGF-1 ELISA定量试剂盒(R&D Systems, Inc.，USA)测定。如图6所示，对照组、GHA组和M-P40K-GHA组的IGF-1水平相差不大，而M-P20K-GHA的IGF-1水平比对照组约低30 43%。这说明M-P20K-GHA抑制了 IGF-1的水平，即M-P20K-GHA的药效要显著优于M-P40K-GHA。GHA组的IGF-1的水平与对照组差异不大，这是由于GHA在体内被快速消除，体内的循环半衰期为15 20分钟，未能有效降低IGF-1水平。对于M-P20K-GHA而言，PEG的链长较短，会部分屏蔽GHA分子上与GHR的结合位点，降低GHA的活性。然而M-P20K-GHA的半衰期延长能够抵消GHA生物活性的降低，从而能够显著降低IGF-1水平。对于M-P40K-GHA而言，由于将40kDa的PEG修饰在GHA的N-末端，高分子量的PEG能完全屏蔽GHA与GHR的结合位点，使GHA的活性几乎完全丧失。尽管M-P40K-GHA的半衰期显著延长，却无法弥补GHA的生物活性丧失。因此，M-P20K-GHA在延长GHA的半衰期的同时，能最大程度地保留GHA的生物活性。分子量为20kDa的PEG醛可作为优化的PEG用于修饰GHA。
权利要求
1.一种定点修饰N-末端的聚乙二醇(PEG)化生长激素拮抗剂(GHA)，其特征在于PEG化生长激素拮抗剂是由PEG共价修饰到生长激素拮抗剂的N-末端。
2.根据权利要求1所述的PEG化生长激素拮抗剂，其特征在于每个生长激素拮抗剂分子仅结合I个PEG分子。
3.根据权利要求1所述的PEG化生长激素拮抗剂，其中PEG是单甲氧基聚乙二醇(mPEG),包括单甲氧基聚乙二醇醛、单甲氧基聚乙二醇醛琥珀酸基琥珀酸酯、单甲氧基聚乙二醇醛琥珀酸基碳酸酯，其分子量在5kDa 40kDa之间。
4.根据权利要求3所述的PEG化生长激素拮抗剂，所述mPEG分子量是20kDa，所述的mPEG是单甲氧基聚乙二醇醛，结构为mPEG-R-CHO，其中R是碳数为1_10的烷基。
5.根据权利要求4所述的PEG化生长激素拮抗剂，所述单甲氧基聚乙二醇醛是单甲氧基聚乙二醇丙醛。
6.根据权利要求1所述的PEG化生长激素拮抗剂，其特征在于PEG与生长激素拮抗剂发生修饰反应的摩尔比为1-20。
7.根据权利要求1所述的PEG化生长激素拮抗剂，其特征在于PEG与生长激素拮抗剂发生修饰反应的摩尔比为4-8。
8.权利要求1所述的PEG化生长激素拮抗剂的制备方法，其特征在于PEG与生长激素拮抗剂发生修饰反应的反应时间为6-48小时，反应温度在4-37° C，反应pH为4.0-7.0,缓冲体系为20mM的磷酸缓冲液,用氰基硼氢化钠(NaCNBH3)作为还原剂。
9.根据权利要求8所述的PEG化生长激素拮抗剂的制备方法，其分离纯化条件为使用凝胶过滤色谱，其中 优选Superdex200凝胶过滤柱。
10.根据权利要求8所述的PEG化生长激素拮抗剂的制备方法，其特征在于发生修饰反应时NaCNBH3与生长激素拮抗剂的摩尔比为10-200，优选的摩尔比在80-160之间。
全文摘要
本发明涉及生物医药领域，具体地，本发明涉及一种定点修饰N-末端的聚乙二醇(PEG)化生长激素拮抗剂(GHA)，以及其制备方法。所述方法包括以下(1)以分子量为20kDa和40kDa的PEG醛分别定点修饰GHA的N末端；(2)用凝胶过滤色谱分离纯化上述两种PEG修饰产物；(3)两种PEG修饰产物的药效动力学的初步评价。其中，分子量为20kDa的PEG醛为优化的PEG，修饰产物具有较高的药效。
文档编号C07K14/61GK103087182SQ20131004704
公开日2013年5月8日 申请日期2013年2月6日 优先权日2013年2月6日
发明者胡涛, 吴玲, 苏志国, 马光辉 申请人:中国科学院过程工程研究所