专利名称：重组乳铁蛋白二肽、表达载体及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属生物技术领域，涉及一种重组乳铁蛋白二肽、表达载体及其应用，具体涉及一种根据毕赤酵母密码子的偏好性优化重组的乳铁蛋白二肽和包含该重组乳铁蛋白二肽的表达载体及其构建，以及将该重组乳铁蛋白二肽作为一种新型绿色饲料添加剂在动物饲料中的应用。
背景技术：
抗生素作为抗菌促生长添加剂加到饲料中由来以久，但其广泛和大量使用导致动物性食品中药物残留等问题愈来愈令人担忧。限制抗生素的使用已不可逆转，如何寻找抗生素的替代品已成为各国动物营养学家最为关注的焦点。因此寻找一种安全、环保的新型饲料添加剂已成为当务之急。近年来，乳铁蛋白(Lactoferrin，简称LF)成为当今乳品界和食品界最为关注的“热点”之一。大量研究表明:乳铁蛋白具有抗菌、抑菌、抗病毒、抗氧化和调节机体免疫等作用，可用于开发 新型的保健食品和绿色饲料添加剂。乳铁蛋白活性多肽是乳铁蛋白在酸性条件下的降解产物，其抗菌活性明显提高。牛乳铁蛋白肽(LfcinB)是从乳铁蛋白的N-端(17_41)被胃蛋白酶水解下来的25个氨基酸残基的小肽，分子量3100Da，序列为FKCRR WQffRM KKLGA PSITC VRRAF。其中的11个氨基酸残基(RR WQWRM KKL)具有与完整的LfcinB相同的抗菌活性，11个氨基酸残基中的6个(RR WQffR)是LfcinB的活性中心。另一种乳铁蛋白活性多肽Lactoferrampin (Lfampin)来源于乳铁蛋白N端的第265-284位氨基酸，序列为DLIWKLLSKAQEKFGKNKSR，分子量2389Da，研究表明其具有与LF、LfcinB相似的生物学活性，即抗菌、抗病毒、抑制癌细胞生长、消炎及参与免疫反应等。近年来，研究发现小分子多肽乳铁蛋白二肽Lfchimera (由LFcinB17_30和LFampin265-284 组合而成，序列为 N-FKCRRWQWRMKKLG-K-RSKNKGFKEQAKSLLKWILD-N，分子量4422Da)具有比LFcinB 17-30、LFampin265_284及其1:1混合物更强的抑菌活性，同时作用时间更短(<15min),也能耐受更高的盐度OlOOmM NaCl)0随着多肽化学合成技术日趋完善，利用多肽自动合成仪可以准确合成一定氨基酸顺序的多肽，该技术用于少量合成Lfcin及其多种衍生物，是研究Lfcin活性与结构关系、明确Lfcin作用机制、调节Lfcin的功能以及开发具有特定功能与性质的Lfcin衍生物的重要方法与手段。但该方法合成的Lfcin价格十分昂贵，仅使用于实验室的小量制备。利用基因工程生产乳铁蛋白活性多肽具有广阔的应用前景，利用DNA合成仪直接合成编码该多肽的DNA，并构建表达载体，在乳腺反应器或微生物中高效表达具可行性。但由于乳铁蛋白活性多肽抗菌谱广，宿主表达的活性多肽可能会对微生物宿主本身产生反馈性抑制作用，达不到高效表达的理想结果；因此构建表达体系的同时，要考虑筛选具有一定抗性的宿主微生物，这虽然增加了基因工程生产的难度，但因生物技术的迅速发展，仍不失为实现乳铁蛋白活性多肽产业化最有希望的途径之一。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种优化后的高活性重组乳铁蛋白二肽、表达载体及其应用。为了使乳铁蛋白二肽基因Lfchimera在重组毕赤酵母表达系统中更高效的转录、翻译、表达，本发明根据毕赤酵母密码子的偏好性，将现有的乳铁蛋白二肽Lfchimera(GenBank:X54801.1, SEQ ID N0.1)中的酵母低频密码子优化成高频密码子，进行引物设计，并经PCR扩增进行人工合成。经序列测定，优化后的重组乳铁蛋白二肽Lfchimera的碱基序列如SEQ ID N0.2所不，其编码的蛋白质的氣基酸序列如SEQ ID N0.3所不。其中，所设计的引物序列如下:上游引物P1: 5 ’ -GGCGAATTCTTTAAGTGTCGACGATGGCAATGGA-3，下游引物P2:5 ’ -GGCGCGGCCGCATCCAAAATCCACTTAAGAAGAGAC-3，将上述人工合成的重组乳铁蛋白二肽的基因片段和克隆载体pMD19T连接，构建得重组质粒pMD19T-Lfchimer·a，转化大肠杆菌DH5 α感受态细胞。以重组质粒pMD19T-Lfchimera为模板经PCR扩增、酶切得到目的基因片段Lfchimera，将其与真核载体pPICZ a A连接，构建得表达载体pPICZ a A-Lfchimera0将上述表达载体pPICZ a A-Lfchimera经限制性内切酶Sac I线性化后经电击转化法转化到毕赤酵母SMDl 168中，筛选能在MD和丽上生长良好的Mut+菌落，然后经抗生素Zeocin筛选获得阳性转化子。将上述筛选获得的阳性转化子接种于BMGY液体培养基中，28 °C 200r/min培养至0D_=2.0-8.0,离心收集菌体，后转入新鲜的BMMY液体培养基中添加甲醇(0.1-1%)进行诱导表达。诱导结束后，离心收集上清并进行SDS-PAGE，得到与预期大小一致的约为4.5kDa的目的条带。经平板溶圈法检测，表达产物具有明显的抑菌活性。最后，将上述重组乳铁蛋白二肽作为添加剂应用于动物饲料中，结果表明，实验组和药物对照组的综合生产性能明显高于空白对照组，同时本发明的重组乳铁蛋白二肽实验组达到了药物对照组的效果，具有替代抗生素药物的前景。有益效果:本发明根据毕赤酵母密码子的偏好性，对现有的乳铁蛋白二肽进行优化合成，得到一种高性能的重组乳铁蛋白二肽，并进一步构建包含该重组乳铁蛋白二肽的表达载体pPICZ a Α-Lfchimera,然后利用毕赤酵母表达系统生产重组乳铁蛋白二肽,可作为动物饲料添加剂，在补充饲料蛋白的同时起到杀菌的作用，可有效的防治、控制猪牛等的胃肠道疾病，以生产出无抗生素残留的高品质畜产品。
图1为优化前后的乳铁蛋白二肽的序列对比图，其中Lfchimera为现有的乳铁蛋白二肽基因序列，Lfchimera(P)为本发明优化后的乳铁蛋白二肽基因序列。图2为重组表达载体pPICZ a A-Lfchimera的结构示意图。图3为抗菌活性分析，其中A为大肠杆菌，B为金黄色葡萄球菌；1为阴性对照，2为发酵液添加量50 μ L时的效果图，3为发酵液添加量100 μ L时的效果图。
具体实施例方式以下结合具体实施例进一步详细描述本发明的技术方案。但是应当说明的是，以下实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围中。实施例1乳铁蛋白二肽基因的优化与人工合成为了使乳铁蛋白二肽基因Lfchimera在重组毕赤酵母表达系统中更高效的转录、翻译、表达，本发明根据如下表I所示的毕赤酵母密码子的偏好性，将现有的乳铁蛋白二肽基因Lfchimera (GenBank:X54801.1, SEQ ID N0.1)中的酵母低频密码子优化成高频密码子，进行引物设计，并人工合成。其中，上游引物P1: 5 ’ -GGCGAATTCTTTAAGTGTCGACGATGGCAATGGA-3 ’下游引物P2:5 ’ -GGCGCGGCCGCATCCAAAATCCACTTAAGAAGAGAC-3 ’PCR 扩增采用 Taq 酶进行扩增，体系组成为:DNA5 μ L，10XPCR Buffer (Mg2+Plus)
5μ L,dNTPs (2mmol/L)5 μ L,P1 (10 μ mol/L)2μ L，P2 (10 μ mol/L)2μ L,Taq polymerase (5U/ μ L) 0.5 μ L，加 ddH20 至总体系为 50 μ L。PCR 扩增条件:95 °C 预变性 5min ;95 °C 变性 30sec，55°C 退火 30sec，72°C 延伸30sec，循环 30 次；72°C延伸 IOmin。表I毕赤酵母密码子偏好性
权利要求
1.一种重组乳铁蛋白二肽Lfchimera,其碱基序列如SEQ ID N0.2所示。
2.包含权利要求1所述的重组乳铁蛋白二肽的表达载体pPICZa A-Lfchimera0
3.权利要求1所述的重组乳铁蛋白二肽的应用，其特征在于，所述的重组乳铁蛋白二肽用于制备抗菌材料。
4.权利要求3所述的重组乳铁蛋白二肽的应用，其特征在于，所述细菌为大肠杆菌和金黄色葡萄球菌。
5.权利要求1所述的重组乳铁蛋白二肽的应用，其特征在于，所述重组乳铁蛋白二肽作为 绿色添加剂应用于动物饲料中。
全文摘要
本发明公开了一种重组乳铁蛋白二肽、表达载体及其应用。所述重组乳铁蛋白二肽的碱基序列如SEQ ID No.2所示，将包含有该重组乳铁蛋白二肽的表达载体pPICZαA-Lfchimera经限制性内切酶Sac I线性化后经电击转化法转化到毕赤酵母SMD1168中，可成功获得表达。经平板溶菌圈法检测，表达产物具有明显的抑菌活性，进而将其作为绿色添加剂应用于动物饲料中，具有替代抗生素药物的前景。
文档编号C07K19/00GK103145848SQ20131004743
公开日2013年6月12日 申请日期2013年2月6日 优先权日2013年2月6日
发明者朱登高, 蒋正芳, 钟诚 申请人:上海高龙生物科技有限公司