专利名称：一种小麦胚芽抗肿瘤蛋白的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种抗肿瘤蛋白的制备方法，特别涉及一种小麦胚芽抗肿瘤蛋白的制备方法，属于小麦精深加工技术。
背景技术：
小麦胚芽是面粉加工的副产物，我国的小麦粉生产量巨大，因此小麦胚芽的产量也很可观。小麦胚芽除了含有较高的优质蛋白外，还含有维生素E、镁、泛酸、磷、硫胺素等，是一种难得的天然健康食品资源。人们从植物中发现了很多种抗肿瘤活性蛋白，国外有研究者从小麦胚芽发酵提取物中分离得到多肽类成分，并证明其具有抗肿瘤效果。小麦胚芽蛋白和多肽的抗氧化、抗衰老、抗疲劳等生理活性得到国内外学者的广泛关注，其抗肿瘤活性报道很少。有报道认为小麦胚芽水溶性提取物能明显抑制S-180肉瘤的生长，同时提高荷瘤小鼠免疫器官的重量，并可使荷瘤小鼠的腹腔巨噬细胞活性得到恢复，提高小鼠巨噬细的吞噬能力，且水提取物对MDA-MB231细胞生长有明显的抑制效应，但是究竟是何种成分起作用，并不清楚。由于脂溶性提取物、盐溶性提取物及发酵提取物中不可避免的溶剂残留和活性成分不明确，给以小麦胚芽为原料开发抗肿瘤保健食品或药物带来一定的不确定性，并且不能高效地实现小麦胚芽资源的增值转化。
发明内容
本发明的目的主要在于提供一种小麦胚芽抗肿瘤蛋白的制备工艺，其以水作为提取液，天然健康，不仅不会导致所获小麦胚芽蛋白中留存有毒有害物质，还有利于提升所获小麦胚芽蛋白的多种生理活性， 使其对人乳腺癌细胞株MDA-MB231的生长表现出显著增殖抑制活性以及对正常细胞细胞的低毒性，从而克服了现有技术中的不足。为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下:—种小麦胚芽抗肿瘤蛋白的制备工艺，包括:(I)取新鲜小麦胚芽进行低温脱脂、粉碎处理，而后以水作为溶剂进行提取操作；(2)去除步骤(I)所获混合提取液中的不溶物，并以硫酸铵对所获上清液进行分级沉淀，其后分离出沉淀物，再将沉淀物复溶于水中进行透析处理，之后依次进行浓缩、冷冻干燥处理，获得小麦胚芽水溶性蛋白；(3)将所述小麦胚芽水溶性蛋白溶于缓冲液中，并依次进行离子交换层析和凝胶过滤层析处理，获得目标产物。作为较为优选的实施方案之一，步骤(I)包括:以低温萃取方式对小麦胚芽进行脱脂处理至小麦胚芽柏中的残油值在2.0wt %以下；所述低温萃取包括超临界二氧化碳萃取、四号溶剂加压萃取或有机溶剂低温萃取。所述有机溶剂可选自但不限于正己烷、石油醚或丙酮。
所述低温是指温度在40°C以下。作为较为优选的实施方案之一，步骤(I)包括:将脱脂后的小麦胚芽柏粉碎后过80-100目筛获得脱脂麦胚粉，其后按照10: I (v/w)的液料比将水与脱脂麦胚粉混合，并搅拌提取，形成混合提取液。作为较为优选的实施方案之一，步骤(2)包括:对步骤(I)所获混合提取液进行离心处理，分离出其中的不溶物，同时收集上清液，并分步缓慢加入硫酸铵至上清液中停止析出沉淀物，而后离心分离出所述沉淀物，再将沉淀物复溶于水中，之后依次进行透析、浓缩和冷冻干燥处理。前述的“分步”是指先缓慢添加硫酸铵至相对较低的饱和度状态，将盐析出的蛋白分离除去，然后再添加硫酸铵达到相对较高的饱和度状态，再离心分离出盐析蛋白，藉此得到比较纯的目标蛋白，剔除杂蛋白，这也是分步阶梯盐析。尤为优选的，步骤(2)还包括:将所述不溶物再次以水进行提取操作，其后再次离心分离出不溶物，并再次收集上清液，之后加入硫酸铵进行分步分级沉淀，所述分步分级沉淀的过程包括:室温条件下，加入硫酸铵到上清液至15-20%饱和度，析出蛋白，离心弃之，收集上清液再加入硫酸铵至20-40 %饱和度，收集所得析出蛋白组分。
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尤为优选的，步骤(2)中的离心操作均采用低温离心操作，所述低温离心操作的条件包括:转速为8000r/min以上，温度在O 4°C，时间为20min以上。作为较为优选的实施方案之一，步骤(3)包括:将所述小麦胚芽水溶性蛋白溶于Tris-HCl缓冲液中，并依次过DEAE-Sepharose FF离子交换层析柱和Superdex20010/300_GL凝胶过滤层析柱，获得目标产物。作为较为优选的实施方案之一，步骤(3)中所述离子交换层析处理及凝胶过滤层析处理的条件包括:以缓冲液作为洗脱液，并且所述洗脱液的流速分别为1.0 2.0mL/min、0.2 0.5mL/min。作为较为优选的实施方案之一，所述小麦胚芽抗肿瘤蛋白的制备工艺具体包括:(I)取除杂后的新鲜小麦胚芽进行低温脱脂，再将脱脂后的小麦胚芽柏风干后过60 80目筛，除去附着的细粉，而后粉碎过80 100目筛，获得脱脂麦胚粉；(2)按8: I 12: I (v/w)的液料比将水与脱脂麦胚粉混合，以180 220r/min的速度振荡提取3h以上，其后低温离心，收集上清液，并将分离出的固形物与水按照4:1 6:1的液料比提取Ih以上，之后再次低温离心，合并上清液，并分步缓慢加入硫酸铵至达到饱和状态，而后静置3h以上，低温离心出沉淀，加水复溶后装入透析袋中，置于4°C以下的水中透析24h以上，浓缩后冷冻干燥，制得小麦胚芽水溶性蛋白；(3)将小麦胚芽水溶性蛋白溶解于pH值7.4 8.0、10 20mmol/LTris-HCl缓冲液中，且使形成的小麦胚芽水溶性蛋白溶液的浓度为5 10mg/mL，再上样于经过上样缓冲液平衡的DEAE-Sepharose FF阴离子交换柱，并以含O 0.8mol/LNaCl的pH值7.4
8.0、10 20mmol/LTris-HCl缓冲液为洗脱剂按照1.0 2.0mL/min的流速进行洗脱，收集洗脱物置于4°C以下的水中透析24h以上，冷冻干燥，分离得到抗肿瘤活性组分；(4)将抗肿瘤活性组分溶解于？!1值7.4、含有50 150臟01/1似(:1，30 60臟01/L磷酸盐缓冲液，且使形成的抗肿瘤活性组分溶液的浓度为以2 4mg/mL上样于经过平衡的superdex20010/300GL凝胶柱,用缓冲液按照0.4mL/min的流速洗脱,获得目标产物。作为较为优选的实施方案之一，步骤⑵中0°C下硫酸铵的饱和度为20wt% 40wt %。与现有技术相比，本发明至少具有如下有益效果:(1)本发明以水作为溶剂，天然健康，不仅不会导致所获小麦胚芽蛋白中留存毒有害物质，还有利于提升所获小麦胚芽蛋白的多种生理活性，并且 本发明工艺简单，成本低廉，易于规模化应用；(2)采用本发明制备得到的产品为白色絮状，单一组分，对人乳腺癌细胞株MDA-MB231的生长具有显著的增值抑制活性，IC50值为22.33 μ g/mL,而且对正常细胞的毒性很小。(3)本发明为小麦胚芽的深度开发和利用提供了有效途径。
图1是本发明一较佳实施方案中一种小麦胚芽抗肿瘤蛋白的制备工艺流程图；图2是本发明一较佳实施方案中WGWSP的DEAE-S印harose FF层析图谱，其中:WGWSPl 是 Omol/L NaCl 洗脱峰，WGWSP2 是 0.3mol/L NaCl 洗脱峰，WGWSP3 是 0.8mol/L NaCl洗脱峰；图3是本发明一较佳实施方案中Superdex20010/300GL凝胶过滤层析图谱。图4是本发明一较佳实施方案中WGWSP11高效液相图谱；图5是本发明一较佳实施方案中所获WGWSP11的SDS-PAGE考马斯亮蓝染色图，其中I为加疏基乙醇，M为标准蛋白，2为不加疏基乙醇。
具体实施例方式本发明的一个方面旨在提供一种小麦胚芽抗肿瘤蛋白的制备工艺，其可以包括:以新鲜小麦胚芽为原料，通过低温萃取(如，超临界二氧化碳萃取，四号溶剂加压萃取，有机溶剂低温萃取)脱脂，粉碎，震荡水提取，离心分离，收集上清液，加硫酸铵分级沉淀，离心分离，收集沉淀，复溶，透析，冷冻干燥得到小麦胚芽水溶性蛋白质(WGWSP)，WGffSP溶解于缓冲液中上DEAE-S印harose FF离子交换层析住，分离得到抗肿瘤活性组分(WGWSPl)，(WGffSPl)溶解于缓冲液中上Superdex20010/300GL凝胶过滤层析柱，得到目标产物(抗肿瘤活性组分，WGffSP11)。作为较佳的具体应用方案之一，参阅图1-图5，该制备工艺可以包括:(I)小麦胚芽水溶性蛋白质WGWSP的制备:除杂后的新鲜小麦胚芽加入正己烷浸泡脱脂，间隔2小时更换一次正己烷，直至滴在滤纸上的上清液风干后无油印为止。将脱脂后的麦胚风干后过筛除去附着的细粉，经摇摆式高速中药粉碎机粉碎过筛得到细粉即为脱脂麦胚粉。(2)以水为提取溶剂，料液比1: 10，在气浴振荡器上以180 220r/min的速度提取3h，然后低温离心，残渣用一半的水提取lh，相同条件离心，合并上清液，缓缓向其中加入硫酸铵固体进行分步分级沉淀，然后低温离心，沉淀加水复溶，然后将其装入透析袋中，置于4°C水中透析24h，浓缩后冷冻干燥，制得WGWSP ；
(3) DEAE-SepharoseFF离子交换层析及各层析组分的抗肿瘤活性检测小麦胚芽水溶性蛋白冷冻干燥样品WGWSP溶解于pH8.0, 20mmol/LTris-HCl缓冲液中，WGffSP浓度为5 10mg/mL，通过0.22 μ m的微孔滤膜后，上样于经过上样缓冲液平衡的 DEAE-Sepharose FF 阴离子交换柱，依次用 0、0.3、0.8mol/LNaCl 的 pH8.0、20mmol/LTris-HCl缓冲液为洗脱剂进行洗脱，流速为1.6mL/min, HD-5检测器检测，检测波长280nm,自动收集器5min收集一管。得到3个组分WGWSPl、WGWSP2、WGWSP3，置于4°C水中透析24h脱盐，冷冻干燥，分离得到抗肿瘤活性组分WGWSPl ；抗肿瘤活性检测:采用人乳腺癌细胞株MDA-MB231作为受试细胞株，MTT法测定WGffSPU WGffSP2, WGffSP3的抗肿瘤活性，经检测可知，WGffSPl对人乳腺癌细胞株MDA-MB231有较强的增殖抑制活性。(4) Superdex20010/300GL凝胶过滤层析及各层析组分的抗肿瘤活性检测将WGWSPl 以 2 4mg/mL 溶解于 ρΗ7.4，含有 150mmol/LNaCl，50mmol/L 磷酸盐缓冲液，通过0.22 μ m的微孔滤膜后，上样于经过平衡的AKTApurifierlO蛋白纯化系统上的superdex20010/300GL凝胶柱,用缓冲液洗脱,流速0.4mL/min,收集各峰检测其抗肿瘤活性得到活性峰WGWSP12。抗肿瘤活性检测:采用人乳腺癌细胞株MDA-MB231作为受试细胞株，MTT法测定WGffSP 11、WGffSP 12、WGffSP 13、WGffSP 14的抗肿瘤活性，经检测可知，WGWSP11对人乳腺癌细胞株MDA-MB231有较强的增殖抑制活性，通过对正常细胞人胚肾细胞HEK-293的增殖抑制活性测定，发现WGWSPlI对正常细胞IC5tl为191.719 μ g/mL,远远大于对MDA-MB231的IC5tl值22.33 μ g/mL。(5) WGWSPl I 纯度鉴定采用SEC-HPLC进 行WGWSP12的纯度鉴定，使用了 Hitachi高效液相系统和ShodexKW-804蛋白柱。柱子的洗脱极限为1，000, OOODa,分离柱效大于20，OOODa,流动相为50mmol / L的磷酸盐缓冲液(pH7.0)，洗脱速率为lml/min，洗脱液在280nm处检测，色谱柱温为室温。经验证得知，WGffSP12为一个对称峰，其保留时间为11.84min。(6)WGWSP12的分子量分布情况采用还原和非还原的聚丙烯酰胺凝胶电泳对WGWSP11的分子量进行鉴定，证明WGffSP12为单一的条带，为电泳纯蛋白，分子量约为41kDa。以下结合若干较佳实施例对本发明的技术方案作进一步说明。实施例1将400mL水加入盛有40g脱脂麦胚粉的500mL三角瓶中，在气浴振荡器上以200r/min的速度提取3h，然后10000r/min，4°C，20min离心得到上清液，将残渣用200mL对应溶剂提取lh，相同条件下离心，合并上清液，向其中加入固体硫酸铵63.6g，至饱和度20%，再搅拌40min,静置3h,然后10000r/min, 4 , 20min离心,收集上清,继续添加固体硫酸铵72g，至饱和度40%，搅拌40min，静置3h，然后10000r/min，4°C，20min离心，弃去上清液收集沉淀，沉淀加少量水复溶，然后将其装入透析袋中，置于4°C水中透析24h，浓缩后冷冻干燥，制的WGWSP。取220mg小麦胚芽水溶性蛋白冷冻干燥样品(WGWSP)，溶解于IOmLTris-HCl缓冲液中，加入到DEAE-Sepharose FF离子交换柱中，依次用pH8.0、20mmol/LTris_HCl缓冲液、含0.3mol/LNaCl的Tris-HCl缓冲液和含0.8mol/LNaCl的Tris-HCl缓冲液为洗脱剂进行洗脱，流速为1.6mL/min，收集组分I (WGWSPl)双蒸水透析脱盐，冷冻干燥。取5mgWGffSPl溶解于2mL磷酸盐缓冲液中,加入到Superdex_200凝胶过滤柱中,用磷酸盐缓冲液进行洗脱，收集组分3，双蒸水透析脱盐，冷冻干燥，制备得到WGWSPlI。通过此方法制得的小麦胚芽抗肿瘤蛋白WGWSP11白色絮状，相对分子质量约为41kDa，对人乳腺癌细胞株MDA-MB231的生长有显著的增殖抑制活性，IC50值为22.33 μ g/mL，对正常细胞人胚肾细胞毒性很小，人胚肾细胞的IC50值为191.72 μ g/mL。实施例2将2000mL水加入盛有200g脱脂麦胚粉的2500mL三角瓶中，在气浴振荡器上以200r/min的速度提取3h，然后10000r/min，4°C，20min离心得到上清液，将残渣用IOOOmL对应溶剂提取Ih,相同条件下离心,合并上清液，向其中加入固体硫酸铵318g,至饱和度20%，再搅拌40分钟，静置3h，然后10000r/min，4°C，20min离心，收集上清，继续添加固体硫酸铵360g，至饱和度40%，再搅拌40分钟，静置3h，然后10000r/min，4°C，20min离心，弃去上清液收集沉淀，沉淀加少量水复溶，然后将其装入透析袋中，置于4°C水中透析24h，浓缩后冷冻干燥，制的WGWSP。取180mg小麦胚芽水溶性蛋白冷冻干燥样品(WGWSP)，溶解于5mLTris-HCl缓冲液中，加入到DEAE-Sepharose FF离子交换柱中，依次用pH8.0、20mmol/LTris-HCl 缓冲液、含 0.3mol/LNaCl 的 Tris-HCl 缓冲液和含 0.8mol/LNaCl 的 Tris-HCl 缓冲液为洗脱剂进行洗脱，流速为1.6mL/min，收集组分I (WGWSPl)双蒸水透析脱盐，冷冻干燥。取9mg WGffSPl溶解于3mL磷酸盐缓冲液中，加入到Superdex_200凝胶过滤柱中，用磷酸盐缓冲液进行洗脱，收集组分3，双蒸水透析脱盐，冷冻干燥，制备得到WGWSPlI。需要指出的是，以上所述仅为本发明的优选实施例，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、改进等，均应包括在本发明的保护范围之内。`
权利要求
1.一种小麦胚芽抗肿瘤蛋白的制备工艺，其特征在于，包括: (1)取新鲜小麦胚芽进行低温脱脂、粉碎处理，而后以水作为溶剂进行提取操作； (2)去除步骤(1)所获混合提取液中的不溶物，并以硫酸铵对所获上清液进行分级沉淀，其后分离出沉淀物，再将沉淀物复溶于水中进行透析处理，之后依次进行浓缩、冷冻干燥处理，获得小麦胚芽水溶性蛋白； (3)将所述小麦胚芽水溶性蛋白溶于缓冲液中，并依次进行离子交换层析和凝胶过滤层析处理，获得目标产物。
2.根据权利要求1所述的小麦胚芽抗肿瘤蛋白的制备工艺，其特征在于，步骤(I)包括:以低温萃取方式对小麦胚芽进行脱脂处理至小麦胚芽柏中的残油值在2.0wt %以下； 所述低温萃取包括超临界二氧化碳萃取、四号溶剂加压萃取或有机溶剂低温萃取。
3.根据权利要求1所述的小麦胚芽抗肿瘤蛋白的制备工艺，其特征在于，步骤(I)包括:将脱脂后的小麦胚芽柏粉碎后过80-100目筛获得脱脂麦胚粉，其后按照10: I (v/w)的液料比将水与脱脂麦胚粉混合，并搅拌提取，形成混合提取液。
4.根据权利要求1所述的小麦胚芽抗肿瘤蛋白的制备工艺，其特征在于，步骤(2)包括:对步骤(1)所 获混合提取液进行离心处理，分离出其中的不溶物，同时收集上清液，并分步缓慢加入硫酸铵至上清液中停止析出沉淀物，而后离心分离出所述沉淀物，再将沉淀物复溶于水中，之后依次进行透析、浓缩和冷冻干燥处理。
5.根据权利要求4所述的小麦胚芽抗肿瘤蛋白的制备工艺，其特征在于，步骤(2)还包括:将所述不溶物再次以水进行提取操作，其后再次离心分离出不溶物，并再次收集上清液，之后加入硫酸铵进行分步分级沉淀。
6.根据权利要求4或5所述的小麦胚芽抗肿瘤蛋白的制备工艺，其特征在于，步骤(2)中的离心操作均采用低温离心操作，所述低温离心操作的条件包括:转速为8000r/min以上，温度在O 4°C，时间为20min以上。
7.根据权利要求1所述的小麦胚芽抗肿瘤蛋白的制备工艺，其特征在于，步骤(3)包括:将所述小麦胚芽水溶性蛋白溶于Tris-HCl缓冲液中，并依次过DEAE-S印harose FF离子交换层析柱和SuperdeX20010/300GL凝胶过滤层析柱，获得目标产物。
8.根据权利要求7所述的小麦胚芽抗肿瘤蛋白的制备工艺，其特征在于，步骤(3)中所述离子交换层析处理及凝胶过滤层析处理的条件包括:以缓冲液作为洗脱液，并且所述洗脱液的流速分别为1.0 2.0mL/min、0.2 0.5mL/min。
9.根据权利要求1所述的小麦胚芽抗肿瘤蛋白的制备工艺，其特征在于，具体包括: (1)取除杂后的新鲜小麦胚芽进行低温脱脂，再将脱脂后的小麦胚芽柏风干后过60 80目筛，除去附着的细粉，而后粉碎过80 100目筛，获得脱脂麦胚粉； (2)按8: 1 12: 1 (v/w)的液料比将水与脱脂麦胚粉混合，以180 220r/min的速度振荡提取3h以上，其后低温离心，收集上清液，并将分离出的固形物与水按照4: I 6: I的液料比提取Ih以上，之后再次低温离心，合并上清液，并分步缓慢加入硫酸铵至达到饱和状态，而后静置3h以上，低温离心出沉淀，加水复溶后装入透析袋中，置于4°C以下的水中透析24h以上，浓缩后冷冻干燥，制得小麦胚芽水溶性蛋白； (3)将小麦胚芽水溶性蛋白溶解于pH值7.4 8.0、10 20mmol/LTriS-HCl缓冲液中，且使形成的小麦胚芽水溶性蛋白溶液的浓度为5 10mg/mL，再上样于经过上样缓冲液平衡的DEAE-Sepharose FF阴离子交换柱，并以含O 0.8mol/LNaCl的pH值7.4 8.0、10 20mmol/LTris-HCl缓冲液为洗脱剂按照1.0 2.0mL/min的流速进行洗脱，收集洗脱物置于4°C以下的水中透析24h以上，冷冻干燥，分离得到抗肿瘤活性组分； (4)将抗肿瘤活性组分溶解于pH值7.4、含有50 150mmol/LNaCl，30 60mmol/L磷酸盐缓冲液，且使形成的抗肿瘤活性组分溶液的浓度为以2 4mg/mL上样于经过平衡的superdex20010/300GL凝胶柱,用缓冲液按照0.4mL/min的流速洗脱,获得目标产物。
10.根据权利要求9所述的小麦胚芽抗肿瘤蛋白的制备工艺，其特征在于，步骤(2)中O°C下硫酸铵的饱和度为20wt % 40wt%。
全文摘要
一种小麦胚芽抗肿瘤蛋白的制备工艺，包括(1)取新鲜小麦胚芽进行低温脱脂、粉碎处理，而后以水作为溶剂进行提取操作；(2)去除步骤(1)所获混合提取液中的不溶物，并以硫酸铵对所获上清液进行分步分级沉淀，其后分离出沉淀物，再将沉淀物复溶于水中进行透析处理，之后依次进行浓缩、冷冻干燥处理，获得小麦胚芽水溶性蛋白；(3)将小麦胚芽水溶性蛋白溶于缓冲液中，并依次进行离子交换层析和凝胶过滤层析处理，获得目标产物。本发明以水作为提取液，天然健康，不会导致所获产物中留存有毒物质，利于提升所获产物的生理活性，且工艺简单，成本低廉，同时所获产品对人乳腺癌细胞株的生长具有显著的增值抑制活性，而对正常细胞的毒性很小。
文档编号C07K1/30GK103087169SQ201310046768
公开日2013年5月8日 申请日期2013年2月5日 优先权日2013年2月5日
发明者朱科学, 周会会, 郭晓娜, 周惠明, 彭伟 申请人:江南大学