可完全解离型聚乙二醇-聚(L-谷氨酸-γ-苄酯)-聚乙烯亚胺共聚物及其合成方法和应用的制作方法
【专利摘要】可完全解离型聚乙二醇-聚(L-谷氨酸-γ-苄酯)-聚乙烯亚胺共聚物及其合成方法和应用，先对端甲氧基聚乙二醇进行胱胺化改性，利用其端氨基引发γ-苄酯-L-谷氨酸-N-羧基环内酸酐开环聚合反应，接着利用2,2'-二硫代二乙基异氰酸酯通过加成反应将开环聚合反应得到的产物与聚乙烯亚胺连接起来，得到目标产物。本发明方法合成的共聚物具有两亲性，可自组装形成纳米粒；该共聚物用作药物载体能够同时装载化疗药物和基因药物；且能够响应谷胱甘肽等还原性物质而完全解离崩溃，既利于载体从内涵体向细胞质逃逸，又能快速释放药物，提高治疗效果。本发明方法可控制嵌段共聚物中各段分子量和长度，反应条件温和，适用药物种类多。
【专利说明】可完全解离型聚乙二醇-聚(L-谷氨酸-Y -苄酯)-聚乙烯亚胺共聚物及其合成方法和应用
【技术领域】
[0001]本发明属于生物医用材料领域，具体涉及可完全解离型聚乙二醇-聚(L-谷氨酸-Y -苄酯)-聚乙烯亚胺共聚物及其合成方法和应用。
【背景技术】
[0002]恶性肿瘤是人类健康的主要威胁之一，对其治疗是世界性的难题。化疗，与外科手术和放疗一样，是目前恶性肿瘤治疗的主要手段。化疗是利用细胞毒药物杀死肿瘤细胞达到治疗目的的方法。然而，细胞毒药物，如阿霉素、紫杉醇、表阿霉素和多西紫杉醇等，通常水溶性差且无选择性，生物利用度低，可导致严重的毒副作用。况且，化疗过程中肿瘤细胞易产生多药耐药性，疗效不够理想。据美国癌症协会估计，90%以上的肿瘤患者死于不同程度的多药耐药性。这些已成为肿瘤化疗成功的主要障碍。因此，如何有效解决肿瘤治疗中多药耐药性和严重毒副作用问题是肿瘤化疗成功的关键因素。近些年的许多研究表明，利用高分子材料作为细胞毒药物的载体，将细胞毒药物装载于高分子材料内部形成各种形式的微纳米颗粒，尤其是纳米颗粒，可显著提高细胞毒药物的溶解能力，实现血液中长循环，并经肿瘤组织特有的“增强的渗透和治疗效应”的被动靶向作用富集于肿瘤组织中，从而提高肿瘤细胞对细胞毒药物或药物-载体复合体的摄取，有效提高药物效果和降低毒副作用。
[0003]随着肿瘤生物学和细胞生物学研究的不断发展，人们逐渐认识到恶性肿瘤是一种多因素多途径参与调控的复杂体系的结果，仅靠单一种药剂治疗恶性肿瘤几乎不可能取得理想的治疗效果，而基于不同作用机制和不同结构的药物联合治疗肿瘤受到广泛关注。从根本上讲，恶性肿瘤 更是一种基因病。因此，利用基因物质治疗恶性肿瘤被寄予更高的希望，近年得到快速发展。基因治疗是指将外源性基因物质(DNA或RNA)按照一定方式导入目标细胞，以纠正缺陷基因或促进/抑制特定基因/蛋白表达，从而达到治疗疾病目的的。目前，制约基因治疗临床应用的瓶颈问题是缺乏安全有效的体内递送载体。基因递送载体主要分为病毒类载体和非病毒类载体两类。其中，病毒类载体的突出优点是转染效率高，但这类载体存在潜在致病风险、免疫反应、基因装载量小、制备和纯化困难等问题。相比之下，非病毒类载体则具有制备简单、易化学改性、基因装载量大等优点。尽管非病毒类载体目前仍存在转染效率不够高，呈现分子量依赖性的转染效率和毒性问题，仍被认为是更为理想的基因递送载体，用于替代病毒类载体。非病毒类载体主要包括阳离子脂质体和阳离子聚合物，相对于前者，后者具有更高的基因装载能力和更加稳定的载体-基因复合物，已成为非病毒基因载体的主要研究对象。常见的非病毒基因载体主要包括聚乙烯亚胺、聚酰胺-胺、壳聚糖衍生物、聚赖氨酸、带伯胺/仲胺/叔胺基团的丙烯酰胺类聚合物等。其中，聚乙烯亚胺因具有高的基因压缩能力和高的转染效率，已成为非病毒基因载体的黄金标准。聚乙烯亚胺的基因转染效率随分子量增加而增大。但分子量的增加，其不可降解的烷基骨架结构将明显增加细胞毒性。因此，如何既提高聚乙烯亚胺的转染效率又呈现低的细胞毒性就成为研究的重点。目前，大多采用可响应肿瘤细胞特殊的还原性酸性微环境的化学键对低分子量聚乙烯亚胺进行交联，通过提高分子量增加基因转染效率，同时又能在肿瘤细胞内降解为低分子量的产物，避免高分子量聚乙烯亚胺显著的细胞毒性问题。如申请号为201110327109.2的中国专利，公开了一种利用二元醛交联聚乙烯亚胺用作基因载体的方法，其中醛基和聚乙烯亚胺的氨基形成对酸敏感的亚胺键，以期在载体进入肿瘤细胞后响应酸性环境而降解。但这些亚胺键无法保证基因载体稳定性，可能在达到肿瘤组织进入细胞前已解离，转染效果难以保证。
[0004]临床恶性肿瘤中多采用序贯联合治疗方法，以克服单一药剂不满意的治疗效果。然而，这种联合治疗不能在微观水平上实现联合，需要重复多次用药，给病人带来不必要的麻烦。同时，这种联合治疗方法难以保证同一地点的联合用药，协同抗肿瘤治疗效果不易体现，临床疗效不够理想。为此，基于同一药物递送载体的联合治疗将可克服这一缺点，已成为目前药物递送体系开发的重点。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于提供可完全解离型聚乙二醇-聚(L-谷氨酸-Y-苄酯)_聚乙烯亚胺共聚物及其合成方法和应用，该方法能够灵活控制各聚合物组分分子量大小和链长度、反应条件温和、原料易得，合成的可完全解离型聚乙二醇-聚(L-谷氨酸-Y -苄酯)-聚乙烯亚胺共聚物能够同时装载化疗药物和基因药物，而且还能提高药效，降低毒副作用。
[0006]为了达到上述目的，本发明的可完全解离型聚乙二醇-聚(L-谷氨酸-Y-苄酯)_聚乙烯亚胺共聚物的合成方法，包括如下步骤: [0007]I)端甲氧基聚乙二醇-聚(L-谷氨酸-Y -苄酯)嵌段共聚物的合成:
[0008]向除水后的胱胺化端甲氧基聚乙二醇中加入无水有机溶剂，然后在氮气氛下加入
Y-苄酯-L-谷氨酸-N-羧基环内酸酐，接着于25°C~40°C反应48小时~72小时，反应所得的产物用冷乙醚沉淀和洗涤，得到端甲氧基聚乙二醇-聚(L-谷氨酸-Y-苄酯)嵌段共聚物；其中，除水后的胱胺化端甲氧基聚乙二醇和Y-苄酯-L-谷氨酸-N-羧基环内酸酐的质量比为(I:1)~(I:4)；
[0009]2)异氰酸酯化mPEG-PBLG嵌段共聚物的合成:
[0010]将除水后的端甲氧基聚乙二醇-聚(L-谷氨酸-Y-苄酯)嵌段共聚物溶于无水有机溶剂中，接着在氮气氛下加入2，2’ - 二硫代二乙基异氰酸酯，然后回流反应15小时~40小时后浓缩，将浓缩得到的反应液用干燥冷乙醚沉淀，收集沉淀并真空室温干燥后得到异氰酸酯化mPEG-PBLG嵌段共聚物；其中，除水后的端甲氧基聚乙二醇-聚(L-谷氨酸-Y-苄酯)嵌段共聚物与2，2’ - 二硫代二乙基异氰酸酯的摩尔比为1: (10~40)；
[0011]3)可完全解离型聚乙二醇-聚(L-谷氨酸-Y-苄酯)_聚乙烯亚胺共聚物的合成:
[0012]将除水后的聚乙烯亚胺用无水有机溶剂溶解，然后加入除水后的聚乙烯亚胺质量2~6倍的异氰酸酯化mPEG-PBLG嵌段共聚物，接着回流反应18小时~36小时，反应液经浓缩后用冷乙醚沉淀，收集沉淀并真空干燥，得到可完全解离型聚乙二醇-聚(L-谷氨酸-Y -苄酯)-聚乙烯亚胺共聚物。
[0013]所述的胱胺化mPEG由如下步骤合成:
[0014]I)将分子量为800-40000&的端甲氧基聚乙二醇、二月桂酸二丁基锡和2，2’-二硫代二乙基异氰酸酯溶于无水甲苯中，在氮气氛下于85°C反应48小时，然后将得到的反应体系在无水正己烷中沉淀，收集沉淀并真空干燥，得到2，2’-二硫代二乙基异氰酸酯改性的mPEG;其中，端甲氧基聚乙二醇、二月桂酸二丁基锡以及2，2’-二硫代二乙基异氰酸酯的摩尔比为 I: (0.02 ~0.08): (3 ~8)；
[0015]2)将2，2’ - 二硫代二乙基异氰酸酯改性mPEG溶于蒸馏水中，于60°C反应6小时，反应体系在蒸馏水中透析、冻干后得到胱胺化mPEG。
[0016]所述的2，2’ - 二硫代二乙基异氰酸酯由以下步骤合成:
[0017]I)将3，3’ - 二硫代二丙酸、乙醇和对甲苯磺酸加入甲苯中，回流反应8小时后除去溶剂；接着除去溶剂后的剩余物中加入质量浓度为85%的水合肼水溶液，回流反应4小时，然后用体积比为2:8的水和乙醇混合溶液重结晶，得到3，3’ - 二硫代二丙酰肼；其中，3，3’-二硫代二丙酸、对甲苯磺酸以及水合肼水溶液中水合肼的摩尔比1:0.005:30 ；
[0018]2)将3，3’ - 二硫代二丙酰肼溶于浓度为lmol/L的盐酸中，在冰盐水浴冷却下滴加亚硝酸钠水溶液，滴完后室温反应6小时，然后加入与盐酸等体积的苯，搅拌后分出苯相；苯相经干燥后在70°C下回流反应4小时，除去溶剂后即得2，2’ - 二硫代二乙基异氰酸酯；其中，3，3’ - 二硫代二丙酰肼与亚硝酸钠水溶液中的亚硝酸钠的摩尔比为1:10。
[0019]所述的步骤I)除水后的胱胺化端甲氧基聚乙二醇、步骤2)除水后的端甲氧基聚乙二醇-聚(L-谷氨酸-Y-苄酯)嵌段共聚以及步骤3)除水后的聚乙烯亚胺均是氮气气氛下采用甲苯共沸除水的方式得到的，且共沸除水时的回流温度为110°C~120°C，共沸除水时的回流时间为2小时~6小时。
[0020]所述的Y-苄酯-L-谷氨酸-N-羧基环内酸酐由以下步骤合成:将L-谷氨酸-Y -苄酯加入无水四氢呋喃中，接着在氮气氛下加入三光气，随后于50°C反应至形成澄清溶液后浓缩，最后将浓缩后得到的反应体系在无水正己烷中沉淀、重结晶，得到Y-苄酯-L-谷氨酸-N-羧基环内酸酐；其中，L-谷氨酸-Y-苄酯与三光气的摩尔比为1:(0.35 ~0.4)。
[0021]所述的无水有机溶剂为无水二氯甲烷、无水氯仿、无水二氧六环或无水四氢呋喃。
[0022]所述的步骤3)中除水后的聚乙烯亚胺的分子量为600~2000Da。
[0023]所述的方法合成的可完全解离型聚乙二醇-聚(L-谷氨酸-Y-苄酯)_聚乙烯亚胺共聚物，包括聚乙二醇段、聚(L-谷氨酸-Y-苄酯)段以及阳离子聚乙烯亚胺段，且聚乙二醇段与聚(L-谷氨酸-Y-苄酯)段之间、聚(L-谷氨酸-Y-苄酯)段与阳离子聚乙烯亚胺段之间分别通过二硫键连接，其化学结构式为:
[0024]
【权利要求】
1.可完全解离型聚乙二醇-聚(L-谷氨酸-Y-苄酯)-聚乙烯亚胺共聚物的合成方法，其特征在于，包括如下步骤: 1)端甲氧基聚乙二醇-聚(L-谷氨酸-Y-苄酯)嵌段共聚物的合成: 向除水后的胱胺化端甲氧基聚乙二醇中加入无水有机溶剂，然后在氮气氛下加入Y-苄酯-L-谷氨酸-N-羧基环内酸酐，接着于25°C~40°C反应48小时~72小时，反应所得的产物用冷乙醚沉淀和洗涤，得到端甲氧基聚乙二醇-聚(L-谷氨酸-Y-苄酯)嵌段共聚物；其中，除水后的胱胺化端甲氧基聚乙二醇和Y-苄酯-L-谷氨酸-N-羧基环内酸酐的质量比为(I:1)~(I:4)； 2)异氰酸酯化mPEG-PBLG嵌段共聚物的合成: 将除水后的端甲氧基聚乙二醇-聚(L-谷氨酸-Y-苄酯)嵌段共聚物溶于无水有机溶剂中，接着在氮气氛下加入2，2’ - 二硫代二乙基异氰酸酯，然后回流反应15小时~40小时后浓缩，将浓缩得到的反应液用干燥冷乙醚沉淀，收集沉淀并真空室温干燥后得到异氰酸酯化mPEG-PBLG嵌段共聚物；其中，除水后的端甲氧基聚乙二醇_聚(L-谷氨酸-Y -苄酯)嵌段共聚物与2，2’ - 二硫代二乙基异氰酸酯的摩尔比为1: (10~40)； 3)可完全解离型聚乙二醇-聚(L-谷氨酸-Y-苄酯)_聚乙烯亚胺共聚物的合成: 将除水后的聚乙烯亚胺用无水有机溶剂溶解，然后加入除水后的聚乙烯亚胺质量2~6倍的异氰酸酯化mPEG-PBLG嵌段共聚物，接着回流反应18小时~36小时，反应液经浓缩后用冷乙醚沉淀 ，收集沉淀并真空干燥，得到可完全解离型聚乙二醇-聚(L-谷氨酸-y -苄酯)-聚乙烯亚胺共聚物。
2.根据权利要求1所述的可完全解离型聚乙二醇-聚(L-谷氨酸-Y-苄酯)-聚乙烯亚胺共聚物的合成方法，其特征在于，所述的胱胺化mPEG由如下步骤合成: 1)将分子量为800-4000Da的端甲氧基聚乙二醇、二月桂酸二丁基锡和2，2’-二硫代二乙基异氰酸酯溶于无水甲苯中，在氮气氛下于85°C反应48小时，然后将得到的反应体系在无水正己烷中沉淀，收集沉淀并真空干燥，得到2，2’ - 二硫代二乙基异氰酸酯改性的mPEG ；其中，端甲氧基聚乙二醇、二月桂酸二丁基锡以及2，2’-二硫代二乙基异氰酸酯的摩尔比为 1: (0.02 ~0.08): (3 ~8)； 2)将2，2’- 二硫代二乙基异氰酸酯改性mPEG溶于蒸馏水中，于60°C反应6小时，反应体系在蒸馏水中透析、冻干后得到胱胺化mPEG。
3.根据权利要求1或2所述的可完全解离型聚乙二醇-聚(L-谷氨酸-Y-苄酯)-聚乙烯亚胺共聚物的合成方法，其特征在于，所述的2，2’ - 二硫代二乙基异氰酸酯由以下步骤合成: 1)将3，3’-二硫代二丙酸、乙醇和对甲苯磺酸加入甲苯中，回流反应8小时后除去溶剂；接着除去溶剂后的剩余物中加入质量浓度为85%的水合肼水溶液，回流反应4小时，然后用体积比为2:8的水和乙醇混合溶液重结晶，得到3，3’ - 二硫代二丙酰肼；其中，3，3’-二硫代二丙酸、对甲苯磺酸以及水合肼水溶液中水合肼的摩尔比1:0.005:30 ； 2)将3，3’- 二硫代二丙酰肼溶于浓度为lmol/L的盐酸中，在冰盐水浴冷却下滴加亚硝酸钠水溶液，滴完后室温反应6小时，然后加入与盐酸等体积的苯，搅拌后分出苯相；苯相经干燥后在70°C下回流反应4小时，除去溶剂后即得2，2’ - 二硫代二乙基异氰酸酯；其中，3，3’ - 二硫代二丙酰肼与亚硝酸钠水溶液中的亚硝酸钠的摩尔比为1:10。
4.根据权利要求1所述的可完全解离型聚乙二醇-聚(L-谷氨酸-Y-苄酯)-聚乙烯亚胺共聚物的合成方法，其特征在于:所述的步骤I)除水后的胱胺化端甲氧基聚乙二醇、步骤2)除水后的端甲氧基聚乙二醇-聚(L-谷氨酸-Y-苄酯)嵌段共聚以及步骤3)除水后的聚乙烯亚胺均是氮气气氛下采用甲苯共沸除水的方式得到的，且共沸除水时的回流温度为110°C~120°C，共沸除水时的回流时间为2小时~6小时。
5.根据权利要求1所述的可完全解离型聚乙二醇-聚(L-谷氨酸-Y-苄酯)-聚乙烯亚胺共聚物的合成方法，其特征在于，所述的Y -苄酯-L-谷氨酸-N-羧基环内酸酐由以下步骤合成:将L-谷氨酸-Y -苄酯加入无水四氢呋喃中，接着在氮气氛下加入三光气，随后于50°C反应至形成澄清溶液后浓缩，最后将浓缩后得到的反应体系在无水正己烷中沉淀、重结晶，得到Y -苄酯-L-谷氨酸-N-羧基环内酸酐；其中，L-谷氨酸-Y -苄酯与三光气的摩尔比为I:(0.35~0.4)。
6.根据权利要求1所述的可完全解离型聚乙二醇-聚(L-谷氨酸-Y-苄酯)-乙烯亚胺共聚物的合成方法，其特征在于:所述的无水有机溶剂为无水二氯甲烷、无水氯仿、无水二氧六环或无水四氢呋喃。
7.根据权利要求1所述的可完全解离型聚乙二醇-聚(L-谷氨酸-Y-苄酯)-聚乙烯亚胺共聚物的合成方法，其特征在于:所述的步骤3)中除水后的聚乙烯亚胺的分子量为600 ~2000Da。
8.如权利要求1~7中任意一项权利要求所述的方法合成的可完全解离型聚乙二醇-聚(L-谷氨酸-Y-苄酯)-聚乙烯亚胺共聚物，其特征在于，包括聚乙二醇段、聚(L-谷氨酸-Y-苄酯)段以及阳离子聚乙烯亚胺段，且聚乙二醇段与聚(L-谷氨酸-Υ-苄酯)段之间、聚(L-谷氨酸-Y-苄酯)段与阳离子聚乙烯亚胺段之间分别通过二硫键连接，其化学结构式为: υO、如0h人~s、r^ Yf1、."'~、~H， 丨1 5 ° S
11 气mu ο*
O\=/O
9.权利要求8所述的可完全解离型聚乙二醇-聚(L-谷氨酸-Y-苄酯)-聚乙烯亚胺共聚物作为装载化疗药物和基因药物的载体的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于:所述的化疗药物为阿霉素、紫杉醇或喜树碱，基因药物为Pgp siRNA、bcl-2siRNA或DNA。
【文档编号】A61K47/48GK104031270SQ201410267880
【公开日】2014年9月10日 申请日期:2014年6月16日 优先权日:2014年6月16日
【发明者】钱军民, 徐明辉, 胥伟军, 刘茸茸, 王红洁 申请人:西安交通大学