经修饰的人类血浆多肽或Fc骨架和其用途

经修饰的人类血浆多肽或Fc骨架和其用途
【专利摘要】本发明提供经修饰的人类血浆多肽或Fc和其用途。
【专利说明】经修饰的人类血浆多肽或Fc骨架和其用途
[0001] 分案说明
[0002] 本申请案是申请日为2007年9月7日，申请号为200780033084. 7 (国际申请号为 PCT/US2007/019528)，发明名称为经修饰的人类血浆多肽或Fc骨架和其用途的专利申请 的分案申请。

【技术领域】
[0003] 本发明涉及经修饰以包含至少一个非天然编码氨基酸的人类血浆多肽或Fc分 子。

【背景技术】
[0004] 人类血浆包含多种执行多种功能的蛋白质。血浆的蛋白质组分是密 集研究的焦点。关于人类血楽的已知蛋白质组分的描述，例如参见Anderson 等人，Molecular&Cellular Proteomics, 3. 4:311-326 (2004);和 Ping 等 人，Proteomics，5:3506-3519 (2005)。人类血浆中可见的最常见蛋白质是白蛋白。
[0005] 人类白蛋白（也称为血清白蛋白）是血浆中可见的多功能蛋白质。其由于有助于 形成血浆的胶体渗透压而成为血浆容量和组织液平衡调控中的重要因素。白蛋白也充当血 流中可见的其它分子的运载体。白蛋白通常占血浆蛋白的50-60%，且因相对较低的分子量 (66, 500道尔顿）而施加80-85%的血液的胶体渗透压。白蛋白调控跨血管流体通量且因此 调控血管内和血管外流体容量，且转运脂质和脂溶性物质。白蛋白溶液在某些类型的休克 或濒临休克的治疗中通常用于扩大血浆容量和维持心输出量，所述休克包括由灼伤、手术、 出血或其它外伤或存在循环容量不足的病状引起的休克。
[0006] 白蛋白具有约两周的血液循环半衰期且天生经设计为运载诸如脂质、肽以及 其它蛋白质等其它分子。疏水性结合口袋和游离硫醇半胱氨酸残基（Cys34)是赋予 这一功能的特征。Cys34因其低pKa(约7)而成为出现在人类血浆中的一个更具反应 性的硫醇基。白蛋白的Cys34也占血浆中硫醇浓度的主要部分（超过80% ) (Kratz 等人，J. Med. Chem.，45 (25) : 5523-33 (2002))。白蛋白通过其反应性硫醇充当运载体 的能力已用于治疗用途。举例来说，描述了使药物与白蛋白连接，从而改进药物的药 理学性质（Kremer 等人，Anticancer Drugs, 13: (6) :615-23(2002) ;Kratz 等人，J. Drug Target，8(5):305-18(2000) ;Kratz 等人，J. Med. Chem. ,45(25) :5523-33 (2002); Tanaka 等人，Bioconjug. Chem. ,2(4) :261-9(1991) ;Dosio 等人，J. Control. Release, 76(1-2) :107-17(2001) ;Dings 等人，Cancer Lett. ,194(1) :55-66(2003); Wunder 等人，J.Immunol. ,170(9) :4793-801(2003) ;Christie 等人，Biochem. Pharma col.，36(20):3379-85(1987))。也描述了使肽和蛋白质治疗剂与白蛋白连接（Holmes 等人，Bioconjug. Chem. ,11 (4) :439-44(2000) ;Leger 等人，Bioorg.Med. Chem. Lett.，13 (20) : 3571-5 (2003) ;Paige 等人，Pharm. Res.，12 (12) : 1883-8 (1995))。也进行了 白蛋白与干扰素 a (Albuferon?)和白蛋白与人类生长激素（Albutropin?)以及白蛋白与 白细胞介素-2 (Albuleukin?)的结合。所属领域也描述使用标准重组分子生物学技术来产 生白蛋白-蛋白质融合物（美国专利第6, 548, 653号，其以引用的方式并入本文中）。所 有结合物（与白蛋白形成的最后一种结合物除外）都涉及使用外源白蛋白的离体结合物形 成。使用外源白蛋白的潜在缺点是污染或免疫原性反应。
[0007] 也描述了治疗剂与白蛋白的活体内连接，例如其中选定肽在给予之前经修饰以允 许白蛋白与肽结合。这种方法是使用二肽基肽酶IV抗性胰高血糖素样肽-l(GLP-l)类 似物来描述（Kim等人，Diabetes, 52 (3) :751-9 (2003))。使特异性连接子（[2-[2-[2-马 来酰亚胺基-丙酰胺基_(乙氧基）_乙氧基]-乙酰胺）连接到肽上所添加的羧基末 端赖氨酸以使得白蛋白的半胱氨酸残基能够与肽结合。其它人已研究使特异性标签连 接到肽或蛋白质以增加其活体内与白蛋白的结合（Koehler等人，Bioorg Med. Chem. Lett.，12 (20) : 2883-6 (2002) ;Dennis 等人，J. Biol. Chem.，277 (38) : 35035-35043 (2002); Smith等人，Biocon jug. Chem.，12:750-756(2001))。已使用一种利用小分子药物的类似方 法，其中药物的衍生物经特定设计以具有与白蛋白的半胱氨酸残基结合的能力。举例来说， 这种前药策略已用于阿霉素（doxorubicin)衍生物，其中阿霉素衍生物在位置34的半胱氨 酸残基处与内源白蛋白结合（Cys34 ;Kratz 等人，J Med. Chem.，45 (25) : 5523-33 (2002))。 治疗剂与白蛋白的活体内连接相对于上述离体方法具有优势，这是因为使用内源白蛋白， 从而避免与外源白蛋白的污染或免疫原性反应相关的问题。然而，药物与内源白蛋白的结 合物的活体内形成的现有技术方法涉及药物与白蛋白之间的永久性共价键。为达到可使所 述键可裂解或可逆的程度，从结合物释放的药物或肽应呈最初化合物的修饰形式。
[0008] 人类血清白蛋白已在包括酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae) (Etcheverry等 人，（1986)BioTechnology 8:726 和 EPA 123 544)、毕赤酵母（Pichia pastoris)(EPA 344 459)以及克鲁维酵母（Kluyveromyces) (Fleer 等人，（1991)BioTechnology 9:968-975) 的酵母宿主细胞和大肠杆菌（E. coli)中表达（Latta等人，（1987)BioTechnology 5:1309-1314)，所述参考文献以引用的方式并入本文中。
[0009] 天然产生的抗体（Ab)是由两个相同免疫球蛋白（Ig)重链和两个相同轻链组成的 四聚物结构。免疫球蛋白是含有通过双硫键结合在一起的多肽链的分子，所述多肽链通常 具有两个轻链和两个重链。在各链中，一个域（V)具有视分子的抗体特异性而定的可变氨 基酸序列。其它域（C)具有相同种类的分子所共有的相当恒定的序列。
[0010] Ab的重链和轻链由不同域组成。各轻链具有一个可变域（VL)和一个恒定域（CL)， 而各重链具有一个可变域（VH)和三个或四个恒定域（CH)。由约110个氨基酸残基组成的 各域是折叠成由两个彼此堆叠的β_折叠形成的特征性β_夹层结构，即免疫球蛋白折叠。 VL域各自具有三个互补决定区（⑶R1-3)且VH域各自具有多达四个互补决定区（⑶R1-4)， 所述互补决定区为在域的一端连接β链的环或转角。轻链和重链的可变区通常对抗原特 异性有贡献，但个别链对特异性的贡献不必相同。抗体分子已发展到通过使用随机CDR环 与大量分子结合。
[0011] Ab的功能子结构可通过蛋白水解和通过重组方法制备。所述子结构包括包含通过 单一链间双硫键连接的重链的VH-CH1域和轻链的VL-CL1域的Fab片段和仅包含VH和VL 域的Fv片段以及包含分子的非抗原结合区的Fc部分。在一些情况下，单一 VH域保留显著 的对抗原的亲和力（Ward等人，1989, Nature341，554-546)。也已显示某种单体κ轻链将 特异性结合其抗原（L.Masat等人，1994, PNAS 91:893-896)。发现分离的轻链或重链有时 也保留某种抗原结合活性（Ward等人，1989, Nature 341，554-546)。
[0012] 另一功能子结构是包含经由肽连接子共价连接的免疫球蛋白重链和轻链的可 变区的单链 Fv (scFv) (S_z Hu 等人，1996, Cancer Research, 56, 3055-3061)。这些小 (Mr25, 000)蛋白质通常保留对单一多肽中的抗原的特异性和亲和力且可对较大的抗原特 异性分子提供便利的结构单元。在多种情况下，scFv在循环中的短半衰期限制其治疗效用。
[0013] 使用Ig VH域的一部分作为模板，设计出称为"微抗体"的小蛋白质骨架（Pessi等 人，1993, Nature 362, 367-369)。通过使对应于VH的CDR1和CDR2的环随机化，且然后使 用噬菌体呈现方法选择突变体而鉴别出对白细胞介素-6具有高亲和力（解离常数（K d)为 约 1(Γ7Μ)的微抗体（Martin 等人，1994, EMBO J. 13, 5303-5309)。
[0014] 当分析来自骆驼血清的IgG样物质时，骆驼通常缺乏可变轻链域，这提示足够的 抗体特异性和亲和力可能仅源自VH域（三个或四个CDR环）。已制备出具有高亲和力的 "骆驼化" VH域，且通过仅随机化⑶R3可产生高特异性。
[0015] "微抗体"的替代物为"双功能抗体"。双功能抗体是具有两个抗原结合位点的小 型二价且具双特异性的抗体片段。所述片段包含连接到同一多肽链上的轻链可变域（\)的 重链可变域（ν Η) (νΗ-')。双功能抗体的大小与Fab片段类似。通过使用太短而不允许在同 一链上的两个域之间配对的连接子，迫使所述域与另一链的互补域配对并产生两个抗原结 合位点。这些二聚抗体片段或"双功能抗体"是二价的且具双特异性。参见P.Holliger等 人，PNAS 90:6444-6448(1993)。
[0016] 抗体片段包括除全长形式以外的抗体的任何形式。本文中的抗体片段包括为 存在于全长抗体内的较小组分的抗体和已经工程化的抗体。抗体片段包括（但不限 于）Fv、Fc、Fab以及（Fab'） 2、单链Fv(scFv)、双功能抗体、三功能抗体、四功能抗体、 双功能杂交抗体、⑶R1、⑶R2、⑶R3、⑶R的组合、可变区、构架区、恒定区等（Maynard 和 Georgiou，2000, Annu. Rev. Biomed. Eng. 2:339-76 ; Hudson, 1998, Cur r. Op in. Biotechnol. 9:395-402)。
[0017] 已制备出CDR肽和有机CDR模拟物（Dougall等人，1994，Trends Biotechnol. 12, 372-379)。⑶R肽是对应于抗体的⑶R环的氨基酸序列的通常为环状的短 肽。⑶R环会引起抗体-抗原相互作用。已显示⑶R肽和有机⑶R模拟物保留某种结合亲 和力（Smyth 和 von Itzstein, 1994, J. Am. Chem.Soc. 116, 2725-2733)。已在不损失亲和 力的情况下将小鼠 CDR移植到人类Ig构架上（Jones等人，1986, Nature 321，522-525 ; Riechmann 等人，1988)。
[0018] 在体内，从大型文库选择特异性Ab并使其扩增（亲和力成熟）。这些过程可在活 体外使用组合文库技术重现。Ab片段在噬菌体表面上的成功呈现使得有可能产生和筛选大 量 CDR 突变（McCafferty 等人，1990, Nature 348,552-554 ;Barbas 等人，1991，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 7978-7982 ;Winter 等人，1994, Annu. Rev. Immunol. 12, 433-455)。通过 这种技术产生数目增加的Fab和Fv(和其衍生物）。这种组合技术可与Ab模拟技术组合。
[0019] 多个可潜在充当蛋白质骨架的蛋白质域已表达为与噬菌体衣壳蛋白的融合物。 综述见于 Clackson 和 Wells, Trends Biotechnol. 12:173-184(1994)中。已使用这些蛋 白质域中的数种作为呈现随机肽序列的骨架，所述蛋白质域包括牛胰腺胰蛋白酶抑制剂 (Roberts 等人，PNAS 89:2429-2433 (1992))、人类生长激素 （Lowman 等人，Biochemistry 30:10832-10838(1991) ;Venturini 等人，Protein Peptide Letters 1:70-75(1994))以 及链球菌的 IgG结合域（O'Neil 等人，Techniques in Protein Chemistry V(Crabb，L编）， 第517-524页，Academic Press, San Diego (1994))。这些骨架已呈现单一随机化环或 区。已使用淀粉酶抑肽（tendamistat)作为丝状噬菌体M13上的提呈骨架（presentation scaffold)(McConnell 和 Hoess, 1995, J. Mol. Biol. 250:460-470)。
[0020] 免疫球蛋白的Fc部分包括（但不限于）通过从抗体中去除两个抗原结合区（Fab 片段）获得的抗体片段。一种去除Fab片段的方法是用木瓜蛋白酶消化免疫球蛋白。因 此，Fc部分是由来自两个重链的恒定区的大小近似相等的片段形成，所述片段通过非共价 相互作用和双硫键缔合。Fc部分可包括铰链区且延伸穿过抗体的CH2和CH3域到达C-末 端。人类和小鼠免疫球蛋白的代表性铰链区可见于Antibody Engineering, A Practical Guide, Borrebaeck，C. A. K.编，W.H. Freeman and Co. ,1992 中，其教不以引用的方式并入本 文中。Fc部分可进一步包括一个或一个以上糖基化位点。所属领域中熟知多种含有铰链 区、CH2和CH3域以及一个N-糖基化位点的代表性Fc蛋白的氨基酸序列。
[0021] 存在五种类型的具有不同效应功能和药物动力学性质的人类免疫球蛋白Fc区： IgG、IgA、IgM、IgD以及IgE。IgG是血清中最丰富的免疫球蛋白。IgG还具有任何免疫球蛋 白中最长的血清半衰期（23天）。不同于其它免疫球蛋白，IgG在与Fc受体结合后可有效 地再循环。存在四个IgG亚类G1、G2、G3以及G4,其各自具有不同的效应功能。G1、G2以及 G3能结合Clq和固定补体，而G4则不能。虽然G3能够比G1有效地结合Clq，但G1在介导 补体导向的细胞溶解中更有效。G2以极低效率固定补体。IgG中的Clq结合位点位于CH2 域的羧基末端区。
[0022] 所有IgG亚类都能够结合Fc受体（CD16、CD32、CD64)，其中G1和G3比G2和G4 有效。IgG的Fc受体结合区是由位于CH2域的铰链区和羧基末端区中的残基形成。
[0023] IgA可以单体形式和通过J-链结合在一起的二聚物形式存在。IgA是血清中第二 丰富的Ig，但其半衰期仅为6天。IgA具有三种效应功能。其结合巨噬细胞和嗜酸性粒细 胞上的IgA特异性受体，所述受体分别驱动吞噬作用和脱粒作用。其也可经由未知的替代 途径固定补体。
[0024] IgM是表达为通过J-链结合在一起的五聚物或六聚物。IgM具有5天的血清半衰 期。其经由位于CH3域中的结合位点微弱地结合Clq。IgD具有3天的血清半衰期。尚不 清楚哪些效应功能是归因于这种Ig。IgE是单体Ig且具有2. 5天的血清半衰期。IgE结合 驱动脱粒作用且引起促发炎剂释放的两种Fc受体。
[0025] 本发明的多肽可含有上述同种型中的任一种，或可含有补体和/或Fc受体结合功 能已改变、变化或消除的突变Fc区。本发明的多肽可含有上述同种型中的任一种，或可含 有效应功能已改变、变化或消除的突变Fc区。因此，本发明的多肽可含有免疫球蛋白的整 个Fc部分、免疫球蛋白的Fc部分的片段或其类似物。
[0026] 本发明的多肽可由单链蛋白质组成或呈多链多肽形式。可产生两个或两个以上Fc 蛋白，以致其通过天然形成于Fc区之间的双硫键相互作用。这些多聚物就共轭分子来说可 为同源的，或其可在融合蛋白的Fc部分的N-末端含有不同的共轭分子。
[0027] Fc或Fc样区可用于延长与其融合的化合物的活体内血浆半衰期。因为由蛋白水 解所产生的IgG的Fc区具有与完整IgG分子相同的活体内半衰期且Fab片段快速降解，所 以认为用于延长半衰期的相关序列驻留在CH2和/或CH3域中。另外，文献中已显示不结合 高亲和力Fc受体或Clq的IgG变异体的分解代谢率与亲本野生型抗体的清除速率很难区 分，表明分解代谢位点不同于参与Fc受体或Clq结合的位点。[Wawrzynczak等人，（1992) Molecular Immunology 29:221]。使用鼠类IgGl Fc区的定点诱变研究提示，控制分解代 谢率的IgGl Fc区的位点位于CH2-CH3域的界面处。Fc区可在分解代谢位点处经修饰以优 化融合蛋白的半衰期。用于本发明的融合蛋白的Fc区可源自IgGl或IgG4 Fc区，且可含 有CH2和CH3区（包括铰链区）。
[0028] 可产生包含Fc和一个或一个以上其它分子（包括（但不限于）多肽）的嵌合分 子。嵌合分子可含有Fc的特异性区或片段和其它分子。任何所述片段都可由蛋白质通过 标准生物化学方法来制备，或通过表达编码所述片段的多核苷酸来制备。多肽或其片段可 以包含人类血清白蛋白（HSA)、Fc或其部分的融合蛋白形式产生。可通过融合多肽与a)免 疫球蛋白的Fc部分、b)免疫球蛋白的Fc部分的类似物以及c)免疫球蛋白的Fc部分的片 段来产生融合物。
[0029] 最近，已报导蛋白质科学中的一种全新技术，其有希望克服与蛋白质的位点特异 性修饰相关的许多限制。具体来说，已向原核生物大肠杆菌（Escherichia coli，E.coli) (例如 L. Wang 等人，(2001). Science 292:498-500)和真核生物酿酒酵母（Sacchromyces cerevisiae，S. cerevisiae)(例如 J. Chin 等人,Science 301:964-7 (2003) ;Drabkin 等人，（1996)Mol. Cell. Biol.，16:907)以及哺乳动物细胞（Sakamoto 等人，（2002) Nucleic AcidsRes. 30:4692)的蛋白质生物合成机构中添加新颖组件，所述组件使得 能够将非遗传编码氨基酸在活体内并入蛋白质中。已使用这种方法响应琥珀密码子 TAG将多种具有新颖化学、物理或生物性质的新颖氨基酸有效且高保真地并入大肠杆 菌和酵母中的蛋白质中，所述氨基酸包括光亲和标记（photoaffinity label)和光致异 构化氨基酸、光交联氨基酸（例如参见Chin, J.W.等人，(2002)Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 99:11020-11024 ；和 Chin, J. W.等人，（2002) T. Am. Chem. Soc. 124:9026-9027)、 酮基氨基酸、含重原子的氨基酸以及糖基化氨基酸。例如参见J. W. Chin等 人,(2002), Tournalof the American Chemical Society 124:9026-9027 ；J.ff. Chin 和 P. G. Schultz, (2002). ChemBioChem 3(11):1135-1137 ;J. W. Chin 等人，(2002). PNAS United States of America99:11020-11024 ;以及 L. Wang 和 P. G. Schultz, (2002)，Chem. Comm.，1:1-11。所有参考文献都以全文引用的方式并入本文中。这些研究已证明有可能 选择性和常规地引入诸如酮基、炔基以及叠氮部分等化学官能团，其在蛋白质中未见，对20 种常见的遗传编码氨基酸中可见的所有官能团来说都具有化学惰性且可用于有效地且选 择性反应以形成稳定共价键。
[0030] 在蛋白质中并入非遗传编码氨基酸的能力允许引入可提供天然存在的官能团的 有价值替代物的化学官能团，诸如赖氨酸的ε -NH2、半胱氨酸的巯基-SH、组氨酸的亚氨基 等。已知本文中所述的某些化学官能团（诸如羰基、炔以及叠氮部分）对20种常见的遗传 编码氨基酸中可见的官能团来说都具有惰性，但其干净且有效地反应以形成稳定键。


【发明内容】

[0031] 本发明提供人类血楽蛋白（human plasma protein, hPP)家族成员，包括（但 不限于）充当其它分子的运载体的血浆蛋白。可适用于本发明的hPP包括（但不限 于）下列公开文献中所列的那些蛋白质，这些公开文献以全文引用的方式并入本文 中：Anderson 等人，Molecular&Cellular Proteomics, 3. 4:311-326(2004);和 Ping 等 人，Proteomics，5:3506-3519(2005)。一些已知的hPP包括（但不限于）α 1-抗胰凝乳蛋 白酶、抗胰蛋白酶、α?-抗胰蛋白酶、前白蛋白、人类白蛋白（人类血清白蛋白）、α?-脂 蛋白、A-γ球蛋白、α 2-巨球蛋白、α 1-微球蛋白、α 2-微球蛋白、β 2-微球蛋白、本-周 蛋白（Bence Jones protein)、胆汁分泌组分、补体蛋白3、胆固醇酯转移蛋白、脂肪酸结合 蛋白、铁蛋白、铁蛋白Η链、纤维蛋白原、抑胃肽（gastricinhibitory peptide)、球蛋白、 结合球蛋白、血红蛋白、血红蛋白A、血红蛋白A1C、血红蛋白F、糖化血红蛋白、盘状血红蛋 白（pan hemoglobin)、乳铁蛋白、脂肪酶、溶菌酶、mutY、肌红蛋白、心脏肌红蛋白、血清类 粘蛋白（orosmucoid)、类风湿因子、胰泌素（secretin)、血清素（serotonin)、甲状腺球蛋 白、甲状腺素、甲状腺素结合球蛋白、三碘甲状腺原氨酸（triiodothyronine)、转移蛋白 (transferring)、维生素 D结合蛋白以及其包含一个或一个以上非天然编码氨基酸的变异 体形式。本发明还提供包含一个或一个以上非天然编码氨基酸的人类Fc (hFc)。
[0032] 在一些实施例中，hPP或hFc包含一个或一个以上翻译后修饰。在一些实施例中， hPP或hFc与连接子、聚合物或生物活性分子连接。在一些实施例中，hPP或hFc与双功能 或多功能聚合物、双功能或多功能连接子或至少一个其它生物活性分子连接。
[0033] 在一些实施例中，非天然编码氨基酸与水溶性聚合物连接。在一些实施例中，水溶 性聚合物包含聚（乙二醇）部分。在一些实施例中，非天然编码氨基酸经由连接子与水溶 性聚合物连接，或直接与水溶性聚合物键结。在一些实施例中，聚（乙二醇）分子是双功能 或多功能聚合物。在一些实施例中，双功能或多功能聚合物与第二多肽连接。在一些实施 例中，第二多肽是生物活性分子。
[0034] 在一些实施例中，hPP或hFc包含至少两个与水溶性聚合物、连接子或生物活性分 子连接的氨基酸。在一些实施例中，至少一个氨基酸是非天然编码氨基酸。
[0035] 在一些实施例中，包含一个或一个以上非天然编码氨基酸的hPP是人类白蛋白 (hA)，其在所属领域中也称为人类血清白蛋白。hA可在多肽序列的582个位置中的一个或 一个以上位置处经一个或一个以上非天然编码氨基酸取代，包括（但不限于）下列位置中 的一个或一个以上位置：位置1( S卩，在N-末端）之前、17、34、55、56、58、60、81、82、86、92、 94、111、114、116、119、129、170、172、173、276、277、280、297、300、301、313、317、321、362、 363、364、365、368、375、397、439、442、495、496、498、500、501、505、515、538、541、542、560、 562、564、574、581以及位置582(即，在蛋白质的羧基末端）之后（SEQ ID N0:1)。
[0036] hFc可在多肽序列的一个或一个以上位置处经一个或一个以上非天然编码氨基酸 取代，包括（但不限于）位置1(即，在N-末端）之前和N-末端（SEQ ID N0:22)。
[0037] 在一些实施例中，hPP或hFc包含调节hPP或hFc对hPP或hFc受体或结合搭配物 的亲和力的取代、添加或缺失，所述搭配物包括（但不限于）蛋白质、脂质、糖类、多肽、小分 子或核酸。在一些实施例中，hPP或hFc包含当与无取代、添加或缺失的相应hPP或hFc的 稳定性相比时增加 hPP或hFc的稳定性的取代、添加或缺失。在一些实施例中，hPP或hFc 包含当与无取代、添加或缺失的相应hPP或hFc的免疫原性相比时调节hPP或hFc的免疫 原性的取代、添加或缺失。在一些实施例中，hPP或hFc包含当与无取代、添加或缺失的相 应hPP或hFc的血清半衰期或循环时间相比时调节hPP或hFc的血清半衰期或循环时间的 取代、添加或缺失。
[0038] 在一些实施例中，hPP或hFc包含当与无取代、添加或缺失的相应hPP或hFc的水 溶性相比时增加 hPP或hFc的水溶性的取代、添加或缺失。在一些实施例中，hPP或hFc包 含当与无取代、添加或缺失的相应hPP或hFc的溶解性相比时增加宿主细胞中所产生的hPP 或hFc的溶解性的取代、添加或缺失。在一些实施例中，hPP或hFc包含当与无取代、添加 或缺失的相应hPP或hFc的表达或合成相比时增加 hPP或hFc在宿主细胞中的表达或增加 hPP或hFc的活体外合成的取代、添加或缺失。包含这种取代的hPP或hFc保留激动活性且 保留或提高宿主细胞中的表达水平。在一些实施例中，hPP或hFc包含当与无取代、添加或 缺失的相应hPP或hFc的蛋白酶抗性相比时增加 hPP或hFc的蛋白酶抗性的取代、添加或 缺失。
[0039] 在一些实施例中，hPP或hFc中的氨基酸取代可为经天然存在或非天然存在的氨 基酸取代，只要至少一个取代是经非天然编码氨基酸取代即可。
[0040] 在一些实施例中，非天然编码氨基酸包含羰基、乙酰基、氨氧基、肼基、酰肼基、氨 基脲基（semicarbazide group)、叠氮基、炔基、苯胺氨基或糖部分。
[0041] 在一些实施例中，非天然编码氨基酸包含羰基。在一些实施例中，非天然编码氨基 酸具有如下结构：
[0042]

【权利要求】
1. 一种hPP或hA多肽，其包含一个或一个以上非天然编码氨基酸。
2. 根据权利要求1所述的hPP或hA多肽，其中所述hPP或hA多肽包含一个或一个以 上翻译后修饰。
3. 根据权利要求1所述的hPP或hA多肽，其中所述多肽与连接子、聚合物或生物活性 分子连接。
4. 根据权利要求3所述的hPP或hA多肽，其中所述多肽与水溶性聚合物连接。
5. 根据权利要求1所述的hPP或hA多肽，其中所述多肽与双官能聚合物、多官能聚合 物、双官能连接子、多官能连接子或至少一个生物活性分子连接。
6. 根据权利要求5所述的hPP或hA多肽，其中所述连接子或聚合物与第二种多肽连 接。
7. 根据权利要求6所述的hPP或hA多肽，其中所述第二种多肽为生物活性分子。
8. 根据权利要求4所述的hPP或hA多肽，其中所述水溶性聚合物包含聚（乙二醇）部 分。
9. 根据权利要求4所述的hPP或hA多肽，其中所述水溶性聚合物与所述hPP或hA多 肽中存在的非天然编码氨基酸连接。
10. 根据权利要求1所述的hA多肽，其中所述非天然编码氨基酸是在选自由以下残基 组成的群组的位置处经取代：SEQ ID ΝΟ:1 的 17、34、55、56、58、60、81、82、86、92、94、111、 114、116、119、129、170、172、173、276、277、280、297、300、301、313、317、321、362、363、364、 365、368、375、397、439、442、495、496、498、500、501、505、515、538、541、542、560、562、564、 574、581。
11. 根据权利要求1所述的hPP或hA多肽，其中所述hPP或hA多肽包含一个或一个以 上调节所述hPP或hA的至少一种生物活性的氨基酸取代、添加或缺失。
12. 根据权利要求1所述的hPP或hA多肽，其中所述hPP或hA多肽包含一个或一个以 上增加所述hPP或hA多肽的稳定性或溶解性的氨基酸取代、添加或缺失。
13. 根据权利要求1所述的hPP或hA多肽，其中所述hPP或hA多肽包含一个或一个以 上增加所述hPP或hA多肽在重组宿主细胞中的表达或活体外合成的所述hPP或hA多肽的 氨基酸取代、添加或缺失。
14. 根据权利要求1所述的hPP或hA多肽，其中所述hPP或hA多肽包含一个或一个以 上增加所述hPP或hA多肽的蛋白酶抗性的氨基酸取代、添加或缺失。
15. 根据权利要求1所述的hPP或hA多肽，其中所述非天然编码氨基酸与不与所述多 肽中的20种常见氨基酸中的任一种反应的连接子、聚合物或生物活性分子反应。
16. 根据权利要求1所述的hPP或hA多肽，其中所述非天然编码氨基酸包含羰基、氨氧 基、餅基、醜餅基、氣基脈基、置氣基或块基。
17. 根据权利要求16所述的hPP或hA多肽，其中所述非天然编码氨基酸包含羰基。
18. 根据权利要求17所述的hPP或hA多肽，其中所述非天然编码氨基酸具有如下结 构：
其中η为0-10况为烷基、芳基、经取代烷基或经取代芳基；R2为Η、烷基、芳基、经取代 烷基以及经取代芳基；且R3为Η、氨基酸、多肽或氨基末端修饰基团；且R4为Η、氨基酸、多 肽或羧基末端修饰基团。
19. 根据权利要求16所述的hPP或hA多肽，其中所述非天然编码氨基酸包含氨氧基。
20. 根据权利要求16所述的hPP或hA多肽，其中所述非天然编码氨基酸包含酰肼基。
21. 根据权利要求16所述的hPP或hA多肽，其中所述非天然编码氨基酸包含肼基。
22. 根据权利要求16所述的hPP或hA多肽，其中所述非天然编码氨基酸残基包含氨基 脈基。
23. 根据权利要求16所述的hPP或hA多肽，其中所述非天然编码氨基酸残基包含叠氮 基。
24. 根据权利要求23所述的hPP或hA多肽，其中所述非天然编码氨基酸具有如下结 构：
其中η为0-10成为烷基、芳基、经取代烷基、经取代芳基或不存在；X为0、N、S或不存 在；m为0-10 ;R2为H、氨基酸、多肽或氨基末端修饰基团；且R3为H、氨基酸、多肽或羧基末 端修饰基团。
25. 根据权利要求16所述的hPP或hA多肽，其中所述非天然编码氨基酸包含炔基。
26. 根据权利要求25所述的hPP或hA多肽，其中所述非天然编码氨基酸具有如下结 构：
其中η为0-10成为烷基、芳基、经取代烷基或经取代芳基；X为0、N、S或不存在；m为 0-10 ;馬为!1、氨基酸、多肽或氨基末端修饰基团；且馬为!1、氨基酸、多肽或羧基末端修饰基 团。
27. 根据权利要求4所述的hPP或hA多肽，其中所述水溶性聚合物具有约0. lkDa与约 lOOkDa之间的分子量。
28. 根据权利要求27所述的hPP或hA多肽，其中所述水溶性聚合物具有约0. lkDa与 约50kDa之间的分子量。
29. 根据权利要求4所述的hPP或hA多肽，其是通过使包含含羰基的氨基酸的hPP或 Μ多肽与包含氨氧基、肼基、酰肼基或氨基脲基的水溶性聚合物反应来制备。
30. 根据权利要求29所述的hPP或hA多肽，其中所述氨氧基、肼基、酰肼基或氨基脲基 通过酰胺键与所述水溶性聚合物连接。
31. 根据权利要求4所述的hPP或hA多肽，其是通过使包含羰基的水溶性聚合物与包 含包含氨氧基、肼基、酰肼基或氨基脲基的非天然编码氨基酸的多肽反应来制备。
32. 根据权利要求4所述的hPP或hA多肽，其是通过使包含含炔的氨基酸的hPP或hA 多肽与包含叠氮部分的水溶性聚合物反应来制备。
33. 根据权利要求4所述的hPP或hA多肽，其是通过使包含含叠氮基的氨基酸的hPP 或Μ多肽与包含炔部分的水溶性聚合物反应来制备。
34. 根据权利要求17所述的hPP或hA多肽，其中所述叠氮基或炔基通过酰胺键与水溶 性聚合物连接。
35. 根据权利要求4所述的hPP或hA多肽，其中所述水溶性聚合物为分支或多臂聚合 物。
36. 根据权利要求35所述的hPP或hA多肽，其中所述水溶性聚合物的各分支具有约 lkDa与约lOOkDa之间的分子量。
37. 根据权利要求1所述的hPP或hA多肽，其中所述非天然编码氨基酸包含糖部分。
38. 根据权利要求3所述的hPP或hA多肽，其中所述连接子、聚合物或生物活性分子经 由糖部分与所述多肽连接。
39. -种编码SEQ ID N0:1中所述的氨基酸序列的经分离多核苷酸分子，其包含选 择密码子，其中所述选择密码子是选自由琥珀密码子、赭石密码子、蛋白石密码子（opal codon)、独特密码子、稀有密码子以及四个碱基的密码子组成的群组。
40. -种制备根据权利要求3所述的hPP或hA多肽的方法，所述方法包含使包含非天 然编码氨基酸的经分离hPP或hA多肽与包含与所述非天然编码氨基酸反应的部分的连接 子、聚合物或生物活性分子接触。
41. 根据权利要求40所述的方法，其中所述聚合物包含选自由水溶性聚合物和聚（乙 二醇）组成的群组的部分。
42. 根据权利要求40所述的方法，其中所述非天然编码氨基酸包含羰基、氨氧基、酰肼 基、餅基、氣基脈基、置氣基或块基。
43. 根据权利要求40所述的方法，其中所述非天然编码氨基酸包含羰基部分且所述连 接子、聚合物或生物活性分子包含氨氧基、肼、酰肼和氨基脲部分。
44. 根据权利要求43所述的方法，其中所述氨氧基、肼、酰肼或氨基脲部分通过酰胺键 与所述连接子、聚合物或生物活性分子连接。
45. 根据权利要求40所述的方法，其中所述非天然编码氨基酸包含炔部分且所述连接 子、聚合物或生物活性分子包含叠氮部分。
46. 根据权利要求40所述的方法，其中所述非天然编码氨基酸包含叠氮部分且所述连 接子、聚合物或生物活性分子包含炔部分。
47. 根据权利要求41所述的方法，其中所述叠氮部分或炔部分通过酰胺键与连接子、 聚合物或生物活性分子连接。
48. 根据权利要求41所述的方法，其中所述聚（乙二醇）部分具有约O.lkDa与约 lOOkDa之间的平均分子量。
49. 根据权利要求41所述的方法，其中所述聚（乙二醇）部分为分支或多臂聚合物。
50. -种组合物，其包含根据权利要求1所述的hPP或hA多肽和医药学上可接受的载 剂。
51. 根据权利要求50所述的组合物，其中所述非天然编码氨基酸与水溶性聚合物连 接。
52. -种治疗患有由hPP或hA调节的病症的患者的方法,所述方法包含向所述患者给 予治疗有效量的根据权利要求50所述的组合物。
53. -种细胞，其包含根据权利要求39所述的核酸。
54. 根据权利要求53所述的细胞，其中所述细胞包含正交tRNA合成酶或正交tRNA。
55. -种制备包含非天然编码氨基酸的hPP或hA多肽的方法，所述方法包含在允许所 述包含非天然编码氨基酸的hPP或hA多肽表达的条件下培养包含一种或一种以上编码hPP 或Μ多肽的包含选择密码子、正交RNA合成酶和正交tRNA的多核苷酸的细胞；和纯化所述 hPP或hA多肽。
56. -种调节hPP或hA多肽的血清半衰期或循环时间的方法，所述方法包含用一个或 一个以上非天然编码氨基酸取代所述hPP或hA多肽中的任何一个或一个以上天然存在氨 基酸。
57. -种由具有SEQ ID ΝΟ:1中所示的序列的多核苷酸编码的hPP或hA多肽，其中所 述多核苷酸包含选择密码子且其中所述多肽包含至少一种非天然编码氨基酸。
58. 根据权利要求57所述的hPP或hA多肽，其中所述非天然编码氨基酸与连接子、聚 合物、水溶性聚合物或生物活性分子连接。
59. 根据权利要求58所述的hPP或hA多肽，其中所述水溶性聚合物包含聚（乙二醇） 部分。
60. 根据权利要求57所述的hA多肽，其中所述非天然编码氨基酸是在选自由以下残 基组成的群组的位置处经取代：SEQ ID ΝΟ:1 的 17、34、55、56、58、60、81、82、86、92、94、111、 114、116、119、129、170、172、173、276、277、280、297、300、301、313、317、321、362、363、364、 365、368、375、397、439、442、495、496、498、500、501、505、515、538、541、542、560、562、564、 574、581和其任何组合。
61. 根据权利要求57所述的hPP或hA多肽，其中所述非天然编码氨基酸包含羰基、氨 氧基、醜餅基、餅基、氣基脈基、置氣基或块基。
62. 根据权利要求59所述的hPP或hA多肽，其中所述聚（乙二醇）部分具有约0. lkDa 与约lOOkDa之间的分子量。
63. 根据权利要求59所述的hPP或hA多肽，其中所述聚（乙二醇）部分为分支或多臂 聚合物。
64. 根据权利要求63所述的hPP或hA多肽，其中所述聚（乙二醇）部分具有约lkDa 与约lOOkDa之间的分子量。
65. -种组合物，其包含根据权利要求57所述的hPP或hA多肽和医药学上可接受的载 剂。
66. -种hPP或hA多肽，其包含一个或一个以上增加所述hPP或hA多肽在重组宿主细 胞中的表达的氨基酸取代、添加或缺失。
67. -种包含一个或一个以上非天然编码氨基酸的hPP或hA多肽，其中所述非天然编 码氨基酸与选自由小有机分子、以化学方式合成的肽、用核糖体合成的多肽、聚合物和连接 子组成的群组的分子键结。
68. -种hPP或hA多肽，其包含在单个氨基酸处通过共价键与所述hPP或hA多肽连接 的水溶性聚合物。
69. 根据权利要求68所述的hPP或hA多肽，其中所述水溶性聚合物包含聚（乙二醇） 部分。
70. 根据权利要求68所述的hPP或hA多肽，其中所述与所述水溶性聚合物共价连接的 氨基酸为非天然编码氨基酸。
71. 根据权利要求70所述的hPP或hA多肽，其中所述非天然编码氨基酸是在选自如下 群组的位置处经取代：对应于 SEQ ID ΝΟ:1 的 17、34、55、56、58、60、81、82、86、92、94、111、 114、116、119、129、170、172、173、276、277、280、297、300、301、313、317、321、362、363、364、 365、368、375、397、439、442、495、496、498、500、501、505、515、538、541、542、560、562、564、 574、581。
72. -种包含至少一个连接子、聚合物或生物活性分子的hPP或hA多肽，其中所述连接 子、聚合物或生物活性分子通过经核糖体并入所述多肽中的非天然编码氨基酸的官能团与 所述多肽连接。
73. 根据权利要求1所述的hPP或hA多肽，其中所述hPP或hA多肽包含一个或一个以 上调节所述hPP或hA多肽的免疫原性的氨基酸取代、添加或缺失。
74. 根据权利要求1所述的hPP或hA多肽，其中所述hPP或hA多肽包含一个或一个以 上调节生物活性分子的血清半衰期或循环时间的氨基酸取代、添加或缺失。
75. -种调节生物活性分子的免疫原性的方法，所述方法包含用一个或一个以上非天 然编码氨基酸取代所述hPP或hA多肽中的任何一个或一个以上天然存在氨基酸。
【文档编号】A61P43/00GK104193815SQ201410302933
【公开日】2014年12月10日 申请日期:2007年9月7日 优先权日:2006年9月8日
【发明者】约瑟夫·谢菲尔, 席雅·诺曼, 理查D.·戴马基, 斯蒂芬妮·周, 安娜-玛丽亚·A.·海斯·普特南, 田锋, 丹尼斯·克拉维兹, 曹豪崇 申请人:Ambrx公司