Fgf9在制备促进骨关节炎软骨修复的药物中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了FGF9在制备促进骨关节炎软骨修复的药物中的应用，研究发现，FGF9在处于炎症环境的关节软骨细胞中可发挥阻滞关节软骨细胞异常分化的作用，在小鼠骨关节炎模型中能缓解关节软骨的降解，抑制关节软骨降解的关键酶MMP-13，减缓关节软骨的肥大化过程，可用于制备促进骨关节炎软骨修复的药物，在骨关节炎治疗领域具有潜在良好的应用前景。
【专利说明】FGF9在制备促进骨关节炎软骨修复的药物中的应用
【技术领域】
[0001]本发明属于生物医药【技术领域】，涉及一种细胞生长因子在制药领域的新用途。
【背景技术】
[0002]骨关节炎为一种退行性病变，系由于增龄、肥胖、劳损、创伤、关节先天性异常、关节畸形等诸多因素引起的关节软骨退化损伤、关节边缘和软骨下骨反应性增生，又称骨关节病。关节软骨损伤是骨关节炎的主要病理改变。关节软骨损伤后没有或很少有自我修复能力，这与关节软骨内无血管、神经及淋巴管支配有关。目前关节软骨损伤修复的主要治疗措施包括局部用药、软骨细胞移植、手术(关节置换)等，虽然可在一定程度上缓解症状，但由于未能充分激活关节软骨本身的修复机制，修复往往不完全，甚至可能引发周围组织发生降解，出现继发性骨关节炎。因此，关节软骨损伤修复成为骨科领域重要问题。
[0003]成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor,FGF)是由垂体和下丘脑分泌的多肽。FGF家族至少包括23个成员(FGF1?FGF23)，作为胞间信号分子，它们在硫酸乙酰肝素蛋白多糖协同下与成纤维细胞生长因子受体(fibroblast growth factor receptor,FGFR)结合，使受体二聚化活化，自身酪氨酸残基磷酸化，与含有SH2的信号分子结合，通过各种信号途径传递信号，参与动物发育过程中多个复杂反应，广泛地调节细胞活性，包括细胞的增殖、迁移、分化以及存活率。FGF9作为FGF家族成员之一，广泛分布于人体的脑、肾、运动神经元和发育中的骨组织中，已被证明参与了包括骨骼，睾丸，肺，心脏和眼睛在内的各种器官和组织的发育成熟过程。目前已发现FGFR家族由五个成员(FGFR1?FGFR5)组成，FGF9主要与FGFR2和FGFR3结合。在骨骼发育早期，FGF9能促进软骨细胞肥大；在骨骼发育后期，其主要调节生长板的血管化和成骨过程。FGFR2主要表达于成骨细胞系，FGF9活化FGFR2可能促进膜内成骨和提高骨密度；FGFR3主要表达于软骨细胞系，FGF9与FGFR3结合后可能抑制软骨内成骨。然而，FGF9对关节软骨损伤修复的影响和作用尚不清楚。
【发明内容】
[0004]有鉴于此，本发明的目的在于研究FGF9对关节软骨损伤修复的影响和作用，进而扩展其在制药领域中的应用。
[0005]经研究，本发明提供如下技术方案:
[0006]FGF9在制备促进骨关节炎软骨修复的药物中的应用。
[0007]进一步，所述促进骨关节炎软骨修复的药物为抑制关节软骨降解和软骨肥大化的药物。
[0008]本发明的有益效果在于:本发明研究发现，FGF9在处于炎症环境的关节软骨细胞中可发挥阻滞关节软骨细胞异常分化的作用，在小鼠骨关节炎模型中能缓解关节软骨的降解，抑制关节软骨降解的关键酶MMP-13，减缓关节软骨的肥大化过程，可用于制备促进骨关节炎软骨修复的药物，在骨关节炎治疗领域具有潜在良好的应用前景。
【专利附图】
【附图说明】
[0009]为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明:
[0010]图1表示在IL-1 β处理的原代关节软骨细胞中，用FGF9处理的软骨细胞比未用FGF9处理的软骨细胞ΜΜΡ13和Collagen X(肥大软骨细胞的标志物)表达明显下调。**表示与空白对照组相比P〈0.01。
[0011]图2表示DMM手术后，关节内注射FGF9的小鼠的膝关节软骨破坏程度较未注射FGF9的小鼠明显降低。Sham control是没有行使DMM手术的左膝关节，saline为行使了DMM手术但只注射未含FGF9的溶液，FGF9为行使了 DMM手术且注射含FGF9的溶液。组织切片采用藏红固绿染色。
[0012]图3表示DMM手术后，小鼠关节软骨的MMP13和Collagen X表达上调，而术后注射FGF9，小鼠关节软骨的MMP13和Collagen X表达又下调。
【具体实施方式】
[0013]下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。
[0014]一、FGF9处理对炎症环境中的关节软骨细胞的MMP13和Collagen X表达的影响
[0015]人类原代关节软骨组织标本取自行关节置换手术后切除的仍然正常的人类膝关节软骨，将其分离、消化、接种后培养至合适的细胞密度，先用10ng/ml FGF9处理30分钟(对照不处理)，再加入10ng/ml IL-1 β处理24小时(FGF9仍然存在于培养基中，对照不处理)，接着采用Trizol法提取原代软骨细胞总mRNA，反转录成cDNA，最后荧光实时定量PCR检测MMP-13和Collagen X的表达。各样本目的基因的表达强度利用其对应的内参基因(GADPH)的量进行校正，每次均设3个复孔。PCR引物序列为:
[0016]GADPH 基因上游引物:5，-catggagaaggctggggctc-3，(SEQ ID N0.1)；
[0017]GADPH 基因下游引物:5，-atgaggtccaccaccctgtt-3’ (SEQ ID N0.2)；
[0018]MMP-13 基因上游引物:5’ -cttcttcttgttgagctggactc-3’ (SEQ ID N0.3)；
[0019]MMP-13 基因下游引物:5，-ctgtggaggtcactgtagact-3，(SEQ ID N0.4)；
[0020]Collagen X 基因上游引物:5，-gcagcattacgacccaagat-3’ (SEQ ID N0.5)；
[0021]Collagen X 基因下游引物:5，_catgattgcactccctgaag_3，(SEQ ID N0.6)；
[0022]PCR 扩增条件为:95°C 30s ；95°C 5s，57。。20s，72。。15s，共 40 个循环；95°C 30s,57°C 30s,95°C 30s。
[0023]结果如图1所示，在未用FGF9处理的关节软骨细胞中，经IL-1 β处理的细胞比未经IL-1 β处理的细胞其ΜΜΡ13和Collagen X表达上调，提示经IL-1 β处理的关节软骨细胞处于一个炎症环境之中，从而模拟了骨关节炎的软骨细胞环境。而在用IL-Ιβ处理的关节软骨细胞中，经FGF9处理的细胞比未经FGF9处理的细胞其ΜΜΡ13和Collagen X表达明显下调。提示FGF9在处于炎症环境的关节软骨细胞中起阻滞关节软骨细胞异常分化的作用。
[0024]二、FGF9处理对小鼠骨关节炎模型的影响
[0025]1、DMM模型建立
[0026]内侧半月板胚骨韧带切断后将导致内侧半月板(Destabilizat1n of the medialmeniscus, DMM)的不稳定。采用显微外科技术实施DMM手术构建小鼠膝关节炎模型。手术主要步骤如下:将小鼠固定、消毒后，用显微刀片切开髌骨韧带内侧，暴露关节腔，钝性分离股骨髁间的脂肪垫，暴露髁间区域，用显微刀片挑断内侧半月板胫骨韧带，缝合组织与皮肤。术中注意避免损伤关节软骨，术后不固定手术肢体，笼内自由活动，腹腔注射青霉素预防感染。对照组小鼠不做处理。
[0027]2、FGF9 处理
[0028]手术2周后，麻醉小鼠行FGF9关节腔内注射实验。注射分两步:先把FGF9溶液(2.5 μ g粉剂溶解在5 μ I生理盐水中)或者生理盐水(对照，5 μ I)与纤维蛋白原溶液混合(3 μ g/μ I)后注射在关节腔中；接着注射I μ I凝血酶(0.2unit)使纤维蛋白原转变为纤维蛋白。于手术第5周时处死小鼠，取小鼠膝关节进行组织切片。
[0029]3、藏红固绿染色观测膝关节软骨情况
[0030]取小鼠膝关节组织切片，采用藏红固绿染色，显微镜下观察软骨组织学特征并进行评价。
[0031]结果如图2所示，相比行使了 DMM手术但只注射未含FGF9溶液的小鼠，DMM手术后注射了 FGF9的小鼠的膝关节软骨破坏程度明显降低，提示FGF9可以使骨关节炎模型小鼠的软骨降解过程延迟。
[0032]4、免疫组化检测关节软骨MMP13和Collagen X表达情况
[0033]取小鼠膝关节组织切片，用二甲苯脱蜡，梯度浓度的酒精复水，3% H2O2消除内源性过氧化氢酶的活性，胰酶孵育修复抗原，山羊血清封闭，然后用兔MMP13多克隆抗体(1:50 稀释；ProteinTech 公司)或兔 Collagen X 多克隆抗体(1: 20 稀释；Calb1chemMerck公司)孵育过夜，磷酸盐缓冲液洗净切片，再用辣根过氧化物酶标记的二抗孵育，最后用二氨基联苯胺显色，甲基绿复染，观察MMP13和Collagen X在小鼠关节软骨的表达情况。
[0034]结果如图3所示，DMM手术后小鼠关节软骨的MMP13和Collagen X表达上调，说明在关节炎进程中关节软骨降解增加并发生过度软骨肥大化，而术后注射FGF9，MMP13和Collagen X的表达又下调，提示FGF9对关节软骨降解和软骨肥大化具有抑制作用。
[0035]最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。
【权利要求】
1.FGF9在制备促进骨关节炎软骨修复的药物中的应用。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述促进骨关节炎软骨修复的药物为抑制关节软骨降解和软骨肥大化的药物。
【文档编号】A61K38/18GK104162148SQ201410341118
【公开日】2014年11月26日 申请日期:2014年7月17日 优先权日:2014年7月17日
【发明者】陈林, 唐浚洲, 苏楠, 杜晓兰 申请人:中国人民解放军第三军医大学第三附属医院