专利名称：：血府逐瘀药物组合物在制备治疗关节炎药物中的应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种中成药的医药新用途，特别是涉及血府逐瘀药物组合物在制备治疗关节炎药物中的应用
背景技术：
：血府逐瘀胶囊是一种经典中成药，卫生部标准WS3-B-0928-91记载处方桃仁(炒)200g、当归150g、枳壳(麸炒)100g、川芎75g、柴胡50g、红花150g、牛膝150g、赤芍100g、地黄150g、桔梗75g、甘草50g制法以上十一味，将桃仁100g、当归、赤芍、枳壳、川芎、柴胡粉碎成细粉，过筛，混匀；其余红花等五味及桃仁100g加水煎煮三次，滤过，合并滤液，浓縮成相对密度为1.151.25(65。C7(TC)的稠膏；与上述粉末混匀，制成颗粒，烘干，粉碎，过筛，装入胶囊，即得。功能与主治活血祛瘀，行气止痛。用于瘀血内阻，胸痛或头痛，内热瞀闷，失眠多梦，心悸怔忡，急躁善怒。另有申请日2001.1.5，公开号CN1362075A"纳米血府逐瘀制剂药物及其制备方法"的专利记载处方纳米桃仁10-50份纳米当归8-60份纳米枳壳10-70份纳米川芎8-60份纳米柴胡10-60份纳米红花8-60份纳米牛膝8-50份纳米赤芍8-60份纳米地黄10-60份纳米桔梗5-50份纳米甘草5-30份功能与主治可用于头痛、眩晕、脑损伤后遗症、冠心病心绞痛等病症的治疗。中药药理与临床，1990，6(6)，第1-4页，彭泉郑有顺著"血府逐瘀汤的拆方研究一对微循环的药理作用"证明能够改善微循环，对因微血管阻力增加引起的血压升高有一定的抑制作用。另有申请日2005.3.17，公开号CN1726934A"血府逐瘀药物组合物在制备降血脂药物中的应用"的专利记载血府逐瘀血府逐瘀药物组合物有降血脂，治疗高脂血症、血管及外伤性头痛的适应症。目前尚未提到血府逐瘀血府逐瘀药物组合物治疗关节炎的适应症。
发明内容本发明的目的在于证明血府逐瘀组合物在制备治疗关节炎药物方面的新的医药用途。本发明的技术方案是血府逐瘀药物组合物在制备治疗关节炎药物的用途，其特在是下述药物组合物在制备治疗关节炎药物中的应用桃仁(炒)200g、当归150g、枳壳(麸炒)100g、川芎75g、柴胡50g、红花150g、牛膝150g、赤芍100g、地黄150g、桔梗75g、甘草50g;制法将桃仁(炒)200g、当归150g、赤芍100g、枳壳(麸炒)100g、川芎75g、柴胡50g药材粉碎为细粉(80目)，过筛，混匀，其余红花150g、牛膝150g、地黄150g、桔梗75g、甘草50g药材加水煎煮三次，第一次3小时，6倍量水；第二次2小时，5倍量水；第三次1小时，4倍量水，滤过，合并滤液，浓縮成稠膏，浸膏比重1.15-1.25，65°C-70°C，与上述粉末混匀，制成颗粒，烘干8(TC-9(TC,8小时，粉碎24目，过筛，装入硬胶囊，即得血府逐瘀胶囊。化脓性关节炎(SA)是由致病菌感染而引发的一系列炎症性关节炎，致残率高。其表现是以化脓性增生性滑膜炎为特点，逐渐导致关节软骨的破坏，最后造成关节功能的障碍。由于发病原因及发病机制尚不十分清楚，早期缺乏特异性的监测指标，致使诊断、治疗难以从早期开始进行阶段性治疗。目前常用非甾体抗炎药、皮质激素、免疫抑制剂等，但其疗效不甚理想且毒副作用较大。SA的滑膜病变具有类肿瘤样生长的特点，表现为滑膜组织的肥厚增生，血管翳形成，对关节周围的组织产生侵蚀和破坏。在滑膜类肿瘤病变的发展过程中有多种炎性因子和生长因子的参与，其中有许多炎症因子通过直接或间接的通路影响VEGF和TGF-pi的表达，血管内皮因子(VEGF)又称为血管通透因子(vasularpermeabilityfactor,VPF)VEGF被认为是滑膜血管翳的形成过程中起关键作用的因子，它是联系各种炎性因子的枢纽，作为炎性因子的最后通路，特异性的作用于皮内细胞，促进滑膜新生血管的形成，增强血管的通透性，导致关节滑膜组织的病理改变；转化生长因子P(transforminggrowthfactor-13)TGF-pl是一种对细胞生长、分化具有双重作用的多肽因子，是最早被描述的TGF-(3家族成员，其主要功能有:(I)促进滑膜增生；(2)增强炎症细胞趋化；(3)促进细胞外基质合成；(4)加速血管翳形成和促进血管新生；(5)抑制免疫反应等；其中血清肿瘤坏死因子TNF-a(TumorNecrosisFactor-a)和VEGF、TGF-pl等对滑膜炎症的发展及滑膜血管翳的形成具有十分重要的作用。这些因子可能形成复杂的网络，相互作用、相互影响，共同促进炎症的发生、滑膜血管翳的形成及血管新生的发展。祖国传统医学对于痹症的发病及机理有明确的论述。将SA归属于"痹症"、"顽痹"等范畴。其主要临床表现为肢体关节疼痛、麻木、重着、甚至屈伸不利和功能障碍，这些表现与血瘀证候存在很大的相关性。西医学对SA的病因机理的认识尚不明确，近年来，由于内分泌学、酶学、组织化学，特别是免疫病理学的发展，对深入讨论SA的病因和发病奠定了基础，目前国内外学者大量研究结果表明，本病属炎症性疾病，其发病可能与感染、自身免疫及内分泌失调等因素有关。随着对SA病理机制认识的不断深入，治疗药物和方法也不断出现，从一开始单纯限于镇痛消炎治疗，到后来使用改变病理作用的药物，现在发展到应用针对其发病相关的生物制剂。SA病情的改善不仅与关节破坏之前炎症控制的程度有关，而且还与控制关节滑膜出现过多的新生血管相关。随着SA发病机制的研究进展，大量文献报道中医药治疗SA具有一定的疗效，通过辨证论治，运用温经通络、清热利湿、活血化瘀等不同治则与方药不仅能起到消炎、镇痛的功效，还具有免疫调节等方面的作用。说明中药具有抗炎镇痛，免疫抑制，减轻组织损伤，恢复机体生理功能等综合作用。中医学还认为，在多数SA发病过程中，"血瘀"贯穿始终，部分研究提示血瘀的发生可能是SA发生的始动因子之一。为进一步阐述"瘀"在痹症病机中的关键作用，综合两种医学对于SA的发病机制的认识，结合异常血管新生的血瘀两种病理机制理论，拟采用弗氏完全佐剂诱发化脓性关节炎血管新生的动物模型，通过观察血府逐瘀胶囊提取物干预整个病理过程，以此阐发在SA大鼠关节病变过程中活血化瘀法的作用机理。SA大鼠为炎症反应模型，后期在炎症基础上出现滑膜的血管新生，这与人类SA的发病机制和病理特征基本一致。接近于中医经络闭塞，气血不通以致血瘀化热型痹症。血府逐瘀胶囊是清代名医王清任的《医林改错》中的经典名方血府逐瘀汤结合现代科学技术提炼精制而成，无论在临床应用方面还是在实验研究方面都已做了大量的工作，但当前研究较多的是运用其对心肌缺血再灌注，抗缺氧，以及对脑动脉硬化等方面的研究，而在运用其对关节炎滑膜血管新生的研究方面未见报导。故本实验以血府逐瘀胶囊提取物作为实验用药，通过观测其用药前后关节肿胀率、体征的改变，滑膜组织形态学及相关细胞因子的表达等指标的变化，探讨化学化瘀法对痹症的作用机理。为此，开展了血府逐瘀制剂提取物对SA大鼠血管新生干预作用的一系例实验大体观测指标外周血检测指标N0检测、外周血检测；镇痛指标扭体实验、舔足实验。我们进行了"血府逐瘀胶囊提取物对SA大鼠滑膜组织病理学及关节肿胀率、疼痛等的干预作用"通过观察SA大鼠滑膜组织形态学、关节炎肿胀、疼痛的变化，可见滑膜大量炎性细胞浸润，滑膜衬里层增生，大量新生血管生成。用药可以改善大鼠滑膜病理表现；血府逐瘀提取物可显著抑制SA大鼠关节肿胀率；血府逐瘀提取物可显著抑制大鼠关节局部疼痛。"血府逐瘀胶囊提取物对SA大鼠TNF-a和IL-IO及NO含量的影响"通过对SA大鼠TNF-a和白细胞介素IL(Interleukin)-10及一氧化氮(NO)含量的检测，可见增高的TNF-a、N0与降低的IL-IO协同作用下，致使微循环障碍，加重SA的血瘀症状；血府逐瘀胶囊可显著降低血清中TNF—a、NO，升高血清IL-10;血府逐瘀胶囊通过改善微循环，增加局部氧运，消除水肿，促进局部病变的吸收，抑制炎性因子的表达。"血府逐瘀胶囊提取物对关节炎大鼠滑膜VEGF和TGF-e1表达的影响"通过实验证明了VEGF与TGF-P1的高表达与血管新生显著相关，加速了血管新生的过程。血府逐瘀胶囊通过抑制关节炎大鼠滑膜组织TGF-31及VEGF的表达，减少血管新生。试验结果表明1.SA与血瘀证密切相关，为活动期SA病机环节之一。2.血府逐瘀胶囊通可通过调节血清中TNF-a、IL-10及N0水平，增强抗炎作用。3.血府逐瘀胶囊通过抑制滑膜中VEGF和TGF-e1的表达减少血管新生。4.血府逐瘀胶囊不仅可以改善全身及关节局部微循环以增强镇痛效果，还可以抑制病理性的血管新生，阻止关节的破坏过程，改善"血瘀"症状。本发明证明了血府逐瘀药物组合物可以治疗化脓性关节炎(是由致病菌感染而引发的一系列炎症性关节炎)的新的医药用途，即在制备治疗关节炎药物方面的用途。为血府逐瘀药物组合物增加了新的适应症。图1是各实验组SA大鼠1-14天关节肿胀率比较曲线图。图2是各实验组SA大鼠7、14天关节肿胀率对比示意图。图3是各组大鼠第1、7、14天舔足次数比较示意图。图4是扭体实验各组大鼠扭体次数比较示意图。图5是各组大鼠血象WBC对比示意图。图6是各组大鼠血象血小板聚集率(PLT)对比示意图。图7是各组大鼠血清TNF-a、IL-10含量比较示意图。图8是各组大鼠血清NO含量比较示意图。具体实施例方式实施例l:血府逐瘀提取物对SA大鼠滑膜组织病理学及关节肿胀率、疼痛等的干预作用目的化脓性关节炎大鼠(SA)模型是在大鼠患侧关节局部红、肿、热、痛基础上，进而出现化脓反应，并伴有滑膜组织因血管新生所致增生肥厚甚至关节炎变形性损伤。为探讨活血化瘀法对炎性疼痛的干预作用，我们采用此模型模拟中医血瘀热痹。通过观察SA大鼠滑膜组织形态学、关节炎肿胀、疼痛的变化，用以阐述血府逐瘀胶囊为的作用机理。(化脓性关节炎大鼠模型制备见参考材料1)方法SD大鼠，雄性，平均体重120g士20g模型制备:将CFA(CompleteFreund'sadjuvant)于大鼠右后足跖部肉垫皮下注射0.2ml，正常对照组在相同部位注射0.2ml灭菌液体石蜡，观察2周。实验用药与分组将大鼠按体重随机分为5组，每组8只。即为正常对照组(N)、模型组(C)、用药低密度组96mg/ml(L)、用药中浓度组144mg/ml(M)、用药高密度组192mg/ml(H)。模型制备同期连续灌胃给药2周，模型组及正常对照组予生理盐水，每日一次，每次1.5ml，药量相当正常人体的十倍、15倍与20倍，连续给药2周。滑膜组织病理标本制备给药2周后，股动脉放血后处死大鼠，剥离切取患肢关节滑膜组织，10。/。甲醛溶液固定72h，常规脱水，石蜡包埋，切片，苏木素-伊红(hematoxylin-eosinHE)染色。结果1、一般情况正常对照组大鼠毛色洁白而又光泽，饮食如常，体重增加。模型制备各组多出现毛色晦暗，饮食减少，体重变化不大等表现，其中以模型组为甚。2、组织病理学观察滑膜病理半定量分析标准正常滑膜组织为0分；滑膜细胞轻度增生达3-5层者为l分；中度增生达6-8层者为2分；中度增生伴滑膜下组织血管扩张为3分；重度增生达9层之上，并伴有大量血管新生为4分。表l各组大鼠滑膜结l织病理积分比较(^±"77=6)组别滑膜组织病理积分N0C3.0±0.8科2.4±0.7M2.0±0.8AH1.6±0.5A注与N组比较卞〈0.05，〈0.01;与C组比较AP〈0.05由表1可以看出，模型组大鼠滑膜病理积分明显高于正常对照组(P〈0.01)，用药组各组均能减少大鼠滑膜病理积分。其中高、中剂量组与模型组比较具有统计学意义(P<0.05)。3、关节肿胀率比较如图1所示，模型组、用药组关节肿胀较正常对照组明显升高，但三用药组均较模型组下降，其中以高浓度组关节消退最为明显。选取SA肿胀过程中第7、14日关节肿胀率作为各实验组量化评价时间点。由表2、图2可见，7、14d关节肿胀率模型组与正常对照组间呈显著性差异(P〈0.01)。与模型组相比各用药组7、14d均呈降低趋势，其中，用药第7d，高剂量组肿胀率的下降具有统计学意义(P<0.05)，实验至第14d，低、中、高三剂量组均具有明显差异(P<0.05)。表2各组7天及14天AR测定结果比较"±s，/7=8)<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>注与N组比较*P<0.05**P<0,01;与C组比较Ap〈0.05舔足次数比较如图3、表3所示，SA发病第一天，各实验组大鼠舔足次数无明显差异(p〉0.05)。在SA病程进展中，各组大鼠依靠自身调节，舔足次数减少呈下滑趋势。但用药至第7日、14日，血府逐瘀胶囊高、中剂量组大鼠舔足次数显著减少(P<0.05)。第14日，用药低浓度组比较也具有统计学意义(P〈0.05)。表3各组大鼠ld、7d、14d舔足次数比较(舔足实验)(i±s，/7=8)<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>注与C组比较*P〈0.05**P〈0.015、扭体次数比较由表4、图4可见，血府逐瘀胶囊提取物对有化学刺激引发的疼痛也有一定的抑制作用。对由醋酸溶液引发的首次扭体出现时间有延长趋势，对20分钟内出现的扭体次数有降低趋势，其中高、中剂量用药差异有显著性(P<0.01)o结论1.SA模型大鼠病理组织学观察可见滑膜大量炎性细胞浸润，滑膜衬里层增生，大量新生血管生成。用药可以改善大鼠滑膜病理表现。2.血府逐瘀提取物可显著抑制SA大鼠关节肿胀率。3.血府逐瘀提取物可显著抑制大鼠关节局部疼痛。组大鼠首次扭体出现时间、扭体次数比较(扭体实验)见表4，表4各组大鼠首次扭体出现时间、扭体次数比较(扭体实验)(？±"/7=8)<table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table>注与N组比较*P<0.05**P〈0.01实施例2:血府逐瘀提取物对SA大鼠TNF-a和IL-10及NO含量的影响方法根据试剂盒说明书采用ELISA法测定血清TNF-a和血清IL-10，应用硝酸还原酶法检测血清NO。结果1、对炎性细胞因子的影响如表6，图7所示，与正常对照组相比，模型组大鼠血清TNF-oc含量显著性升高(P〈O.OD，高、中剂量组降低SA大鼠血清TNF-a含量，较模型组差异具有显著性(p〈0.05);与模型组比较，各用药组均有提高SA大鼠血清IL-IO含量的趋势，但高剂量组差异无显著性(P>0.05)，中、低剂量组IL-10含量的升高则具有统计学意义(P〈0.05)。各组血清TNF-a、IL-10含量比较见表69表6各组血清TNF-a、<table>tableseeoriginaldocumentpage10</tabl注与N组比较*P〈0.05**P<0.01;与C组比较AP〈0.05结论1.增高的TNF-ct、N0与降低的IL-10协同作用下，致使微循环障碍，加重SA的血瘀症状；2.血府逐瘀胶囊可显著降低血清中TNF—a、NO，升高血清IL-10。3.血府逐瘀胶囊通过改善微循环，增加局部氧运，消除水肿，促进局部病变的吸收，抑制炎性因子的表达。实施例3:血府逐瘀提取物对关节炎大鼠滑膜VEGF和TGF-P1表达的影响方法滑膜组织免疫组化染色，VEGF及TGF-pi判定1、滑膜组织免疫组化染色将在破片进行APES预处理，滑膜组织切片贴敷于预处理去载玻片。采用SP免疫组织化学染色法，以磷酸盐缓冲溶液(PBS)代替一抗作阴性对照，操作步骤如下l.石蜡切片脱蜡至水2.3%过氧化氢室温孵育lOmin3.蒸馏水冲洗，PBS浸泡5minX24.5-10%正常封闭血清(PBS稀释)封闭，室温孵育10min，倾去血清，勿洗。滴加一抗工作液，37"C孵育1-2小时或4"C过夜5.PBS冲洗，5minX3次6.滴加适量生物素标记二抗工作液，37。C孵育10-30分钟；7.PBS冲洗，5minX3次8.滴加适量的辣根酶标记的链霉卵白素工作液，37'C孵育10-30分钟9.PBS冲洗，5minX3次10.显色剂显色3-15分钟(DAB)，自来水充分冲洗，复染，脱水，透明，封片；VEGF及TGF-(31判定标准VEGF的染色判断标准VEGF阳性细胞的细胞浆染成棕黄色，选择染色均匀的区域，随机选取3个视野，每个视野分别计算血管内皮阳性细胞比例(a):无阳性细胞为0分；阳性细胞数小于25%为1分；阳性细胞数25%50%为2分；阳性细胞数大于50%为3分；每张切片阳性细胞着色强度(b):基本不着色为O分；淡黄色为l分；棕黄色为2分；深棕色为3分。综合评分=aXb。TGF-pi判定标准选择染色均匀的区域，随机选取3个视野，根据染色程度(a)及染色细胞百分率(b)进行评定基本不着色为O分；着色淡为l分；着色较深为2分；着色深为3分。无为O分；着色细胞数小于百分率5%以下为0分；6%25%为1分；26%50%为2分；50%以上为3分。综合评分=aXb。结果1.血府逐瘀胶囊对滑膜中VEGF表达的影响免疫组化染色显示，正常对照组大鼠的滑膜组织中没有或仅见少量的VEGF阳性细胞，而在SA大鼠滑膜细胞层及滑膜下层可见大量VEGF阳性细胞，其阳性细胞百分数明显高于正常对照组(P〈0.01);与模型组对比，各用药组VEGF阳性细胞百分数呈减少趋势，其中，高、中剂量组VEGF阳性细胞百分数减少具有统计学意义(P〈0.05)。表8各组大鼠滑膜VEGF阳性细胞表达比较(f士"77二18),组别VEGF表达N0.9±0,5C5.0±1.3**4,5±1.2M3.7±1.()△H2.1±0.7A注与N组比较*P〈0.05"P〈0.01;与C组比较AP〈0.052.血府逐瘀胶囊对滑膜TGF-pl表达的影响免疫组化染色显示，滑膜TGF-pi阳性表达呈深棕色。正常对照组滑膜组织中仅见少量的TGF-(31阳性细胞表达，模型组TGF-(31阳性细胞百分数及染色程度几分显著性增高，与正常对照组差异有统计学意义(P〈0.01);中药各剂量组TGF-pi表达积分呈降低趋势，其中，高、中剂量组VEGF阳性细胞百分数减少具有统计学意义(P〈0.05)。VEGF与TGF-P1与SA发病的关系Berse等通过比较几种血管相关因子对滑膜成纤维细胞分泌VEGF的作用发现，FGF-pl是最强的促进滑膜成纤维细胞分泌VEGF的诱导剂，是血小板源性生长因子(PDGF)和IL-1作用的6倍；而且低氧环境下可使FGF-pl和IL-1刺激VEGF分泌速度提高2倍；VEGF与TGF-P1被证明是体内重要的血管新生因子如VEGF等而实现的。而且体外实验表明，TGF-31介导的血管新生是剂量依赖性的，是双重作用机制；即高浓度时抑制VEGF及其所介导的血管新生；低浓度时增强VEGF介导的血管新生。在血管新生不同阶段TGF-31发挥不同的作用在激活阶段主要是促进基底膜降解，加速细胞迁移和细胞外基质入侵，促进内皮细胞增殖及血管强形成；在炎症消退阶段可抑制内皮细胞增殖，终止细胞迁移，基底膜重建。瘀证的治法为祛瘀生新，其理论核心为"瘀血不去，新血不生"，治疗上需活血化瘀。活血化瘀法与现代医学的血管新生存在相似之处。现代药理学研究提示，活血化瘀方药对异常血管新生能减少微血管密度，抑制血管内皮细胞的生长和转移，改善机体血液循环及微循环状态，抑制炎症反应及抑制血管内膜增生和血管重构等多种作用。实验证明一些活血化瘀药物如血府逐瘀胶囊等可以抑制血管平滑肌细胞、内皮细胞增生，从而抑制血管新生和新生血管的形成。结论1.VEGF与TGF-P1的高表达与血管新生显著相关，加速了血管新生的过程。2.血府逐瘀胶囊可能通过抑制关节炎大鼠滑膜组织TGF-61及VEGF的表达，减少血管新生。表9各组大鼠滑膜TGF-pl阳性细胞表达比较(f±s,r18)<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>注与N组比较*P<0,05**P<0.01;与C组比较AP<0.05。权利要求1、血府逐瘀药物组合物在制备治疗关节炎药物的用途，其特征是下述药物组合物在制备治疗关节炎药物中的应用桃仁(炒)200g、当归150g、枳壳(麸炒)100g、川芎75g、柴胡50g、红花150g、牛膝150g、赤芍100g、地黄150g、桔梗75g、甘草50g；制法将桃仁(炒)200g、当归150g、赤芍100g、枳壳(麸炒)100g、川芎75g、柴胡50g药材粉碎为细粉(80目)，过筛，混匀，其余红花150g、牛膝150g、地黄150g、桔梗75g、甘草50g药材加水煎煮三次，第一次3小时，6倍量水；第二次2小时，5倍量水；第三次1小时，4倍量水，滤过，合并滤液，浓缩成稠膏，浸膏比重1.15-1.25，65℃-70℃，与上述粉末混匀，制成颗粒，烘干80℃-90℃，8小时，粉碎24目，过筛，装入硬胶囊，即得血府逐瘀胶囊。全文摘要本发明涉及一种血府逐瘀中成药的医药新用途，特别是涉及下述药物组合物桃仁(炒)200g、当归150g、枳壳(麸炒)100g、川芎75g、柴胡50g、红花150g、牛膝150g、赤芍100g、地黄150g、桔梗75g、甘草50g在制备治疗关节炎药物中的应用。本发明证明了血府逐瘀药物组合物在制备治疗关节炎药物方面的用途，为血府逐瘀药物组合物增加了新的适应症。文档编号A61K36/804GK101327269SQ20081005226公开日2008年12月24日申请日期2008年2月3日优先权日2008年2月3日发明者朱晓晶,李凤阁,李艳丽,亮赵申请人:天津宏仁堂药业有限公司