专利名称：序列号21的生物活性肽在制备用于防止或治疗关节炎的药物中的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种治疗关节炎的药物，尤其是治疗类风湿性关节炎的药物。
背景技术：
类风湿性关节炎(Rheumatoid Arthritis，简称RA)是一种常见的严重危害人类身体健康的自身免疫性疾病，在欧美国家白人的患病率为1％-2％，在我国平均为0.32％-0.34％，以此推断全国患者数达400万人。RA是关节的一种慢性炎症性破坏性疾病，其发病机理至今未明。该病对关节的损伤很大，造成关节的畸形，肢体活动障碍，是我国人群丧失劳动力的主要原因之一。
RA的治疗药物众多，但临床效果都不甚满意。非甾体类抗炎药物疗效有限，改变病情的抗类风湿药物如环孢素、霉酚酸、糖皮质激素等均有严重的不良反应，特别对一些慢性炎症需长期服用者，其中可导致胃溃疡、肾功能降低和对骨髓的影响。而近年来研制的一些生物制剂如TNF-α拮抗剂etanercept及infliximab，IL-1受体拮抗剂anakinra在临床上显示了一定的效果，但价格昂贵，体内不稳定，且有严重的免疫原性。因此，开拓新的领域，寻找新型高效低毒的抗类风湿的药物是药物研究的迫切任务。
作为治疗用途的小分子多肽越来越受到人们的重视，小分子多肽类药物的优点是分子量小，无免疫原性，比较安全，结构相对比较简单，功能较明确，特异性强，副作用小，因而成为新药研究的理想起点。目前国内外对于小分子多肽治疗类风湿性关节炎的研究已取得的一些成就，如利用噬菌体肽库筛选出来能与TNF-α结合并能阻断TNF-α生物活性的12肽(刘新平，张晓光，韩炯.噬菌体肽库展示的小肽序列差异对肿瘤坏死因子α诱导的细胞毒作用的影响.[J]中华风湿病杂志，2001，5(3)142-145)，从峰毒中提取的峰毒多肽BV I-H(朱伟，王本祥，朱讯.蜂毒新多肽部位BV I-2H的分离纯化及其生物学活性[J].科技通报，2002，47(3)198-203)、P肽(余晓东.蜂毒P肽对大鼠佐剂性关节炎的抑制作用[J].重庆医学，2002，31(12)1191-1192)、蜂毒肽(李亚非，时述山，李欣.纯化蜂毒肽对兔免疫性关节炎的抑制作用[J].中国风湿病学杂志，2000，4(5)293-295)，脑肠肽八肽胆囊收缩素(赵占胜，金玉怀，徐锦荣et al.八肽胆囊收缩素对大鼠滑膜细胞株RSC-364分泌IL-6的影响[J].基础医学与临床，2003，23(1)85-88)、血管活性肠肽(TajebaY，Suzuki N，Kaneko A et al.Evidence for neural regulation odinflammatory synovial cell function by secreting calcitoningene-related peptide and vasoactive intestinal peptide in patientswith rheumatoid arthritis.Arthritis Rheum，1999，422418-2428)，及一些抗血管形成、抗粘附的分子模拟肽，T细胞的肽疫苗(Moreland LW，Heck LWJr，Koopman WJ et al.V beta 17 T cell receptor peptide vaccination inrheumatoid arthritisresults of phase I dose escalation study.JRheumatol.1996，231353-62)等。
本发明的申请人在中国专利公开号为1398882、发明名称为“序列号21的生物活性肽”的专利申请中公开了肽序列为Phe Glu Glu Met的四肽化合物(即序列号21的生物活性肽，以下简称CMS030。)，CMS030的前期工作结果显示其具有免疫抑制作用，但目前仍未见有将CMS030用于制备防止或治疗关节炎的药物应用的报道。
发明内容
本发明的目的是提供序列号21的生物活性肽在制备用于防治或治疗关节炎的药物中的用途。
根据本发明的实施方案(实施例)所建立的抗炎抗类风湿药物研究的常用模型——AA大鼠动物模型试验，本发明提供了序列号21的生物活性肽在制备用于防治或治疗关节炎的药物中的用途。
所述关节炎为类风湿性关节炎。
下面通过实施例对本发明作进一步详细的说明具体实施方式
生物活性肽化合物CMS030对大鼠佐剂性关节炎治疗作用
材料与方法1.1材料1.1.1药物CMS030深圳市康哲药业有限公司，用生理盐水稀释到所需浓度；环孢素A诺华制药有限公司，批号S15500，用少量无水乙醇溶解后加入橄榄油配成所需的浓度。
1.1.2试剂卡介苗卫生部北京生物制品研究所，批号20030115；羊毛脂、石蜡油天津市化学试剂六厂三分厂；胎牛血清、RPMI-1640、Hanks’液GIBCO公司；MTTSigma公司，批号61K5318；ConASigma公司，批号PR0080-2；LPSSigma公司，批号110K4046；IL-1β检测试剂盒R&D Systems.Inc，批号213634；TNF-α检测试剂盒R&D Systems.Inc，批号220346。
1.1.3仪器电子分析天平梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司；Olympus CK2型倒置显微镜Olympus Optical Co.Ltd.JAPAN；MODEL 302型CO2孵育箱National Appliance Company，USA；ALISEI随机型全自动酶标板分析仪意大利RAPIM集团。
1.1.4实验动物Wistar大鼠，雄性，SPF级，体重180±20g，北京维通利华实验动物技术有限公司，动物合格证编号0031841。
1.2方法1.2.1制备弗氏完全佐剂(张丽丽，宋丹青，胡志君et al.新型免疫抑制剂来氟米特药效学研究[J].中国抗生素杂志，2001，25(3)210-213)将卡介苗干粉于60℃水浴灭活1小时。羊毛脂∶液体石蜡(1∶2)加热混匀，10磅高压灭菌15分钟。将卡介苗溶于生理盐水中与前者等量研磨混匀，使卡介苗的最终含量为10mg/ml。将研磨后的混合物置于玻璃注射器中，另取一只注射器，中间用胶管连接，来回推拉，充分乳化，至滴入水中不立即散开，置于4℃冰箱保存备用。
1.2.2建立AA大鼠佐剂性关节炎模型除正常对照组11只大鼠外，其余每只大鼠右后足趾皮内注射弗氏完全佐剂0.1ml致炎。
1.2.3实验动物分组及给药造模后第十天随机分组给药，CMS 030高剂量组(给药剂量为20μg·kg-1·d-1)，中剂量组(给药剂量为10μg·kg-1·d-1)，低剂量组(给药剂量为2μg·kg-1·d-1)，腹腔注射给药1ml/d，同时灌胃橄榄油1ml/d；环孢素组(给药剂量10mg·kg-1·d-1)，灌胃给药，1ml/d，同时腹腔注射生理盐水，1ml/d；模型对照组、正常对照组均灌胃橄榄油1ml/d，腹腔注射生理盐水1ml/d，每日一次，连续给药26天。
1.2.4CMS030对AA大鼠踝关节肿胀程度的作用于给药当天用游标卡尺开始测量每只鼠左后及右后踝关节的周长，先用线绳环绕关节一周测得一个数值，减去线绳的初长度即为踝关节的周长，每隔三天测量一次。
1.2.5CMS030对AA大鼠腹腔巨噬细胞分泌IL-1β、TNF-α的影响于给药结束后次日，脱臼处死各组大鼠，用含2％血清的Hanks’液冲洗腹腔巨噬细胞，调细胞数为2×106个/ml，加入到24孔板中，贴壁24h后加入LPS(终浓度为10μg/ml)刺激48h后取上清，用ELISA试剂盒检测IL-1β、TNF-α。
1.2.6CMS030对AA大鼠T淋巴细胞增殖反应的影响各组大鼠收集腹腔巨噬细胞后无菌分离脾脏，制成脾细胞悬液，调细胞浓度为4×106个/ml，加入到96孔板中，同时加入ConA(终浓度为5μg/ml)，置于37℃5％CO2中孵育68h，离心弃上清后加入MTT(终浓度为0.5mg/ml)，4小时后离心弃上清加入盐酸异丙醇(1∶300)，490nm测定OD值并计算刺激指数。
1.2.7统计方法用Spss10.0进行分析，组间比较用方差分析，两两比较应用Student-Newman-Keuls法。
结果2.1CMS030对AA大鼠原发性病变的影响造模后第10天生理盐水组右后踝关节肿胀明显高于正常对照组(P＜0.05)，造模后第14天(即给药4天后)CMS030各给药剂量组右后踝关节肿胀均明显低于生理盐水组(P＜0.05)，一直持续到给药结束，结果见表1。
2.2CMS030对AA大鼠继发性病变的影响造模后第14天生理盐水组左后踝关节明显高于正常对照组(P＜0.05)，给药8天后CMS030各给药剂量组左后踝关节肿胀均明显低于生理盐水组(P＜0.05)，一直持续到给药结束，结果见表2。
2.3CMS030对AA大鼠腹腔巨噬细胞分泌IL-1β、TNF-α的作用生理盐水组大鼠腹腔巨噬细胞分泌的IL-1β、TNF-α明显高于正常对照组(P＜0.05)，CMS030各给药剂量组均能明显降低AA大鼠腹腔巨噬细胞分泌IL-1β(P＜0.05)及TNF-α(P＜0.05)，结果见表3。
2.4CMS030对AA大鼠淋巴细胞增殖功能的影响生理盐水组ConA诱导的T淋巴细胞增殖明显低于正常对照组(P＜0.05)，CMS030各给药剂量组均能明显抑制AA大鼠淋巴细胞增殖功能(P＜0.05)，结果见表4。
结合表1-4CMS030各剂量组均能明显抑制AA大鼠踝关节的原发性(右后踝关节)及继发性(左后踝关节)病变，CMS030给药4天后即能抑制原发性病变，CMS03020μg/kg/d给药剂量组与环孢素治疗组比较无显著性差异。继发性病变在造模后第14天开始出现，CMS030给药8天后能明显抑制继发性病变，相比环孢素起效晚，实验过程中发现CSA治疗组大鼠毛色发黄，行动迟缓，状态不佳，认为是环孢素的副作用的结果，而CMS030各剂量组未见此现象。对AA大鼠细胞免疫功能的研究表明CMS030能抑制脾脏T淋巴细胞增殖，提示其可能通过抑制机体的细胞免疫功能而发挥作用。AA大鼠腹腔巨噬细胞分泌炎症因子明显升高。IL-1β及TNF-α是促使RA病理发展的重要细胞因子(Simpson SA，Dalldoref FG，Otteress IG et al.Exacerbation of arthritis byIL-1 in rat joits previously injured by peptidoglycan-polysaccharide.JImmunol，1988，140(9)2946.)，CMS030能降低AA大鼠腹腔巨噬细胞分泌IL-1β及TNF-α，说明它与抑制巨噬细胞活化，降低其产生炎性细胞因子有关。
由于AA是一种免疫性炎症，较接近人类类风湿性关节炎，建立AA大鼠动物模型是抗炎抗类风湿药物研究的常用模型之一(Jacobson PB，BorganSJ，Wiliot DM et al.A new spin an old model ub in vivo evaluation of diseaseprogress by magnetic resonace imaging with respect to standard inflammatoryparameters and his eopathology in adjuvant arthritis rats.ArthritisRheum，1999，42(10)2060-73)，该AA大鼠动物模型可用来评判抗炎抗类风湿药物的效用。
表1CMS030对AA大鼠关节右后踝关节肿胀的抑制作用(cm)
*和生理盐水组比较P＜0.05；&和正常对照组比较P＜0.05
表2CMS030对佐剂性关节炎大鼠左后踝关节肿胀程度的抑制作用(cm)
*和生理盐水组比较P＜0.05；&和正常对照组比较P＜0.05
表3CMS030对LPS诱导的AA大鼠腹腔巨噬细胞分泌IL-1β、TNF-α的影响
注*和生理盐水组比较P＜0.05；&和正常对照组比较P＜0.05表4CMS030对ConA诱导的AA大鼠T淋巴细胞转化作用的影响
注*和生理盐水组比较P＜0.05；&和正常对照组比较P＜0.0权利要求
1.序列号21的生物活性肽在制备用于防治或治疗关节炎的药物中的用途。
2.根据权利要求1的用途，其特征在于所述关节炎为类风湿性关节炎。
全文摘要
本发明涉及序列号21的生物活性肽在制备用于防治或治疗关节炎、特别是类风湿性关节炎的药物中的用途。
文档编号A61P19/00GK1799623SQ20051002013
公开日2006年7月12日 申请日期2005年1月5日 优先权日2005年1月5日
发明者王伟明, 林刚 申请人:一泰医药研究(深圳)有限公司