羟基红花黄色素在防治流感药物中的应用的制作方法
【专利摘要】羟基红花黄色素在制备流感病毒药物中的应用，属于中药应用领域，本发明是通过以下技术方案实施的：首先用取自不同亚型的流感病毒神经氨酸酶液和羟基红花黄色素在37℃培养箱中孵育30分钟，然后加入荧光底物缓冲溶液进行检测，我们发现羟基红花黄色素对H1N1、H3N2及B型流感病毒均有作用，然后我们检测了羟基红花黄色素在细胞水平上的抗流感作用，发现羟基红花黄色素也能对感染H1N1和H3N2的细胞起到治疗作用，最后，我们检测了羟基红花黄色素对小鼠流感模型的影响，我们发现加入羟基红花黄色素后，可以明显抑制流感感染小鼠体重的减轻程度，使小鼠逐渐恢复到健康水平，并且能显著降低流感小鼠的肺指数。
【专利说明】羟基红花黄色素在防治流感药物中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于中药应用领域，具体涉及羟基红花黄色素在制备抑制流感病毒药物中 的应用。
【背景技术】
[0002] 流行性感冒（以下简称流感）是由流感病毒引起的急性病毒性呼吸道传染病，它 传染性强、流行面广、发病率高，全球每年大约有5 %?15 %感染。甲型流感病毒RNA由8个 节段组成，编码10个蛋白；其中第六节段编码神经氨酸酶（neuraminidase,NA)蛋白。NA是 存在于流感病毒被膜上的两种蛋白之一，主要作用为催化水解寡糖、糖蛋白、糖脂中a-2、 3,a_2、6糖苷键，释放末端的N-乙酰神经氨酸酶残基。病毒侵染细胞时，首先通过血凝素 (hemagglutinin,HA)与细胞表面SA(唾液酸）受体结合形成糖苷键，再经NA催化，切断糖 苷键，以利于流感病毒进入细胞内；子代病毒完成复制后，以出芽的方式突出宿主细胞，再 通过NA的催化作用而释放，从而感染新的宿主细胞。
[0003] 中医中药抗病毒已有数千年的历史，我国在利用中药防治流感方面积累了大量宝 贵的理论和实践经验。在我国，中药资源非常丰富，从古至今用中医药治疗流感疗效显著。 但在国外，由于中药中有效成分不明，作用原理不清，所以使中药的发展在国外受阻。现在 单味中药抗流感的研究已经有数十年了，已经筛选出很多具有抗流感病毒的中草药。所以， 我们从天然产物中获得了新颖的具有NA抑制活性的化合物--轻基红花黄色素，以此来寻 找抑制流感NA，从而抑制流感病毒的新药物。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提供羟基红花黄色素在制备流感病毒药物中的应用。羟基红 花黄色素能够有效的抑制神经氨酸酶的活性，从而抑制流感病毒在体内的繁殖，进而减轻 或治愈流感患者。本发明对化合物羟基红花黄色素对HlNl(代表group-1)和H3N2(代 表group-2)两类NA进行了体外酶学抑制性的检测，发现其对HlNl和H3N2的IC5tl分别为 90. 40±9. 13iimol/L，155. 33± 17. 37iimol/L，我们又对这两种病毒感染MDCK细胞并加以 此种化合物进行了细胞存活率的测定，发现此化合物均能提高病毒感染后的细胞存活率。 本发明为开发以神经氨酸酶为靶点的新药提供基础，为羟基红花黄色素应用于人类流感的 治疗提供了参考。
【专利附图】
【附图说明】
[0005] 图1是不同浓度羟基红花黄色素对HlNl，H3N2和B型流感病毒神经氨酸酶的抑制 作用。
[0006] 图2是不同浓度羟基红花黄色素与HlNl或H3N2共同作用后，混合液对MDCK细胞 的损伤作用。
[0007] 图3是不同浓度羟基红花黄色素对感染了HlNl或H3N2的MDCK细胞的治疗作用。
[0008] 图4是不用浓度羟基红花黄色素对感染了流感病毒的小鼠体重的影响。
[0009] 图5是不用浓度羟基红花黄色素对感染流感病毒的小鼠肺中病毒载量的影响。
【具体实施方式】
[0010] 以下通过实例形式的【具体实施方式】对本发明作进一步的详细说明。
[0011] 实施例1
[0012] 我们用含有流感病毒NA的尿囊液（经鸡胚传代，收尿囊液，-80°C保存）在 pH6. 5MES缓冲液（32. 5mM)中进行配制，我们将49iiL的NA液及其与不同浓度的41iiL 羟基红花黄色素的混合物加入到反应缓冲液中，在37 °C孵箱中放置30min，然后加入 50iiL20iiMMU-NANA底物缓冲液，在酶标仪上进行检测，激发波长为360nm，发射波长 为450nm，检测时长8min。检测结果为，羟基红花黄色素对H1N1，H3N2和B型流感病 毒NA的半数一直浓度（IC5tl)分别为 90. 40±9. 13iimol/L，155. 33±17. 37iimol/L和 104.72±8.91iimol/L。
[0013] 实施例2
[0014] 为了检测羟基红花黄色素在细胞水平的抗流感作用，我们用两种不同的处理对其 进行实验：首先将羟基红花黄色素按浓度梯度稀释成不同浓度，I将上述溶液与IOOTCIDki 的不同亚型流感病毒（HlNl和H3N2)等体积孵育2小时，总体积为200iiL。然后将混合液 加入到MDCK细胞中孵育2h;II将IOOTCID5q的不同亚型流感病毒（HlNl和H3N2)在MDCK 细胞中孵育2小时，在加入不用浓度的羟基红花黄色素孵育2小时。2种不同处理稀释液都 用维持液（10Ug/ml胰酶的DMEM)。2小时后，换一次上述的维持液继续培养24小时。24 小时后换含有2%血清的维持液，连续观察2?3天，用MTT法检测细胞病变效果。上述实 验均在37°C、5%CO2条件下培养。
[0015] 结果如图2和图3所示，在不同处理条件下，加入羟基红花黄色素与流感病毒时， 随着羟基红花黄色素浓度的增加，细胞存活率也随着增加。说明羟基红花黄色素可以抑制 流感病毒，保护MDCK细胞免受病毒破坏，而且保护效应也随着羟基红花黄色素浓度的增加 呈现浓度依赖性。
[0016] 实施例3
[0017]为了检测羟基红花黄色素在小鼠流感模型中的保护作用，我们采用SOilLlOLD5tl 的FMl病毒滴鼻感染小鼠。实验小鼠随机分为6组，分别为NC组；IOLD5tl组；10LD5Q+50mg/ kgTamiflu组；轻基红花黄色素低、中、高剂量组：10LD5(i+50, 100, 200mg/kgSafflominA。 每组10只，病毒攻击前1天开始给药，均采用灌胃给药的方式，每天2次，连续7天，每只小 鼠灌胃0.2ml。每天记录小鼠生存状态,体重变化。然后在15天时,处死小鼠,记录肺重,对 肺组织研磨加入PBS，后测定其NA活性。
[0018] 结果如图4和图5所示，说明羟基红花黄色素可以抑制流感感染小鼠体重的减轻 程度，改善小鼠的生存状态，使小鼠逐渐恢复到健康水平。
[0019] 结果如下表所示，说明不同浓度的羟基红花黄色素能显著降低流感小鼠的肺指 数。
[0020]
【权利要求】
1. 化合物羟基红花黄色素在防治流感药物中的应用。
2. 如权利要求1中羟基红花黄色素以作为单一成分在防治流感药物的应用。
3. 如权利要求1中羟基红花黄色素以作为复方药物中的一种成分在防治流感药物的 应用
4. 如权利要求1中羟基红花黄色素以口服给药方式的应用。
5. 如权利要求1中羟基红花黄色素以注射给药方式的应用。
6. 如权利要求1中羟基红花黄色素以喷雾吸入方式的应用。
【文档编号】A61P31/16GK104306366SQ201410572638
【公开日】2015年1月28日 申请日期:2014年10月22日 优先权日:2014年10月22日
【发明者】房学迅, 于淼, 麻彤辉, 于大海, 王溪竹, 王烨, 田莉, 梁伟国, 杨吉雨 申请人:吉林大学