一种云芝多糖提取物及其制备方法与应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及生物【技术领域】，具体涉及一种云芝多糖提取物及其制备方法与应用。本发明通过深层发酵培养云芝菌丝体后，发酵产物分离出菌丝体和发酵液，菌丝体烘干，粉碎过筛脱脂干燥后，进行热水浸提并浓缩，得到浸提浓缩液；发酵液超滤去除小分子物质后，浓缩，得到超滤浓缩液。超滤浓缩液和浸提浓缩液通过去蛋白、乙醇沉淀、双氧水脱色，透析最后经真空冷冻干燥，分别制得云芝胞内多糖提取物和云芝胞外多糖提取物。本发明制备过程简单、可高效高质大量生产，提取物对人体无毒害，具有良好降血脂的生理作用，可用于开发降血脂药物或保健食品。
【专利说明】一种云芝多糖提取物及其制备方法与应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物【技术领域】，具体涉及一种云芝多糖提取物及其制备方法与应用。
【背景技术】
[0002] 通过液体深层发酵食药用真菌菌丝体获得发酵产物，一般可以分别提取菌丝体中 的胞内多糖和发酵液中的胞外多糖。
[0003] 胡成旭等（2007)利用响应面法研宄云芝菌丝体多糖的水提取工艺，求得最佳水 浸提条件为：提取温度85°C，浸提时间105min，液料比27:1，云芝多糖的提取率为7. 27%。 Pan等（2010)等利用超声辅助提取法研宄了云芝子实体多糖的最佳工艺参数，得出最佳的 超声功率为30W，料液比为1:40,时间为8h，此条件下多糖的提取率可达到5. 95%。张桂 春等（2005)研宄了金顶侧耳胞外多糖的最佳提取工艺是将母液浓缩到原体积的1/4,再用 75%的乙醇醇沉10h。王永敏等（2009)将蛹虫草发酵清液浓缩至1/5后加3倍95%乙醇 沉淀12h，得多糖沉淀，并以Sevage法去除蛋白。Wang等（2011)将蛹虫草发酵液浓缩，乙 醇沉淀多糖，用sevage法去蛋白，并透析冷冻干燥可得胞外粗多糖。Meng等（2010)等通过 响应面法研宄羊肚菌深层培养的发酵液中胞外多糖的提取参数，包括发酵液的浓缩温度， 乙醇沉淀时间及pH值。一方面利用子实体获得多糖提取物，需耗费大量资源，目前云芝子 实体生长周期较长，且产量有限，自然环境生长采集的野生子实体数量稀少，用来提取多糖 成本高；另一方面利用半合成培养基深层发酵对所得的多糖成分影响较大，不利于分离纯 化和生理功效鉴定。研宄发现，云芝多糖具有明显免疫调节、抗肿瘤、抗氧化、促进受损肝细 胞恢复等作用，（郑炯等，2007 ;王菲菲等，2012 ;Kang等，2013 ;梁语丝等，2014)，开发和利 用价值较大。目前云芝多糖提取物的生物活性或药效的研宄大多在抗肿瘤和免疫调节等领 域。有关云芝液体深层发酵物降血脂作用的研宄尚未见到有相关文献报道。
【发明内容】
[0004] 为了克服现有技术的不足和缺点，本发明的首要目的在于提供一种云芝多糖提取 物的制备方法。
[0005] 本发明的另一目的在于提供上述制备方法制备得到的云芝多糖提取物，该云芝多 糖提取物培养简易高效、提取方法稳定可靠、成本低。
[0006] 本发明的再一目的在于提供上述云芝多糖提取物的应用。
[0007] 本发明的目的通过下述方案实现：
[0008] 一种云芝多糖提取物的制备方法，包含如下步骤：
[0009] (1)云芝（Coriolus versicolor)液体深层发酵后，分离得到云芝菌丝体和发酵 液，其中，云芝菌丝体干燥粉碎并过筛后，脱脂，干燥，得到脱脂后的菌丝体；发酵液超滤去 除小分子物质，得到云芝超滤液；
[0010] (2)热水浸提脱脂后的菌丝体，得到含云芝胞内多糖的浸提液；
[0011] (3)将步骤（1)得到的云芝超滤液和步骤（2)得到的浸提液分别浓缩，得到超滤浓 缩液和浸提浓缩液；
[0012] (4)将步骤（3)制备得到的超滤浓缩液和浸提浓缩液分别采用胰蛋白酶和Sevage 法去蛋白，得到去蛋白后的胞外多糖提取液和胞内多糖提取液；
[0013] (5)用乙醇分别沉降步骤（4)得到的胞外多糖提取液和胞内多糖提取液中的多 糖，然后离心分离得到沉淀，脱色透析干燥后，分别制得云芝胞内提取物和云芝胞外多糖提 取物；
[0014] 步骤⑴中所述的干燥温度优选为50?55°C;所述的过筛筛目为14?40目；优 选为40目；
[0015] 步骤（1)中所述的脱脂方法优选为：菌丝体粉末与石油醚按体积比为1:2混匀，振 荡或搅拌处理2?3d，脱去菌丝体中的脂质，离心留沉淀；重复脱脂1?2次；
[0016] 步骤（1)中所述的超滤条件优选为进膜压力为lObar，通量3?5L/min，物料温度 22°C;所述的超滤优选用1万分子量PS超滤膜超滤；
[0017] 步骤（2)中所述的热水浸提的条件为：料液比为1:30,提取时间为2?3h，提取温 度为90°C，提取次数为1?3次；
[0018] 步骤（2)中所述的热水浸提的条件优选为：料液比为1:30,提取时间为2h，提取温 度为90°C，提取次数为2次；
[0019] 步骤（3)中所述的浓缩的温度优选为55°C?60°C ;优选为60°C ;
[0020] 步骤（5)中所述的乙醇用量为多糖提取液体积的3?5倍；
[0021]步骤（5)中所述的沉降的温度为0?25°C，沉降的时间为12?48h;
[0022] 步骤（5)中所述的脱色透析干燥的方法为：用水溶解沉淀并调节多糖溶液pH至 8. 0;然后滴加质量分数为30%的H202溶液，于50?55°C水浴保温2?3h，对其进行氧化 脱色处理；然后将多糖溶液装入截留分子量为8000?15000Da的透析袋中透析2?3d，每 8?10h更换一次水；对透析完成后的溶液进行浓缩，并真空冷冻干燥，获得云芝多糖提取 物；所述的质量分数为30%的H 202溶液的用量为每100mL多糖液滴加2mL质量分数为30% 的H20 2溶液；
[0023] 步骤⑷中所述的胰蛋白酶和Sevage法，包含如下步骤：
[0024] ①将步骤（3)制备得到的浓缩液分别调pH至8.0;然后将胰蛋白酶加入浓缩液中 充分混合并37°C振荡30?60min，再水浴灭酶10?15min，冷却至室温；
[0025] ②去蛋白后的浓缩液加入0. 2倍体积的氯仿正丁醇混合液，剧烈振荡30?40min; 然后离心，弃取蛋白层及有机溶液，回收上清液；
[0026] ③重复步骤②2?3次，得到去蛋白后的多糖提取液；
[0027] 步骤①所述的胰蛋白酶的初始浓度优选为2% (W/V);所述的胰蛋白酶的用量为 浓缩液体积的（1:10)?（1:20);
[0028] 步骤①所述的灭酶温度优选为100°C ;
[0029] 步骤①所述的胰蛋白酶加入浓缩液充分混合的具体操作优选为：配制2% (W/V) 的胰蛋白酶溶液，将步骤（3)制备得到的浓缩液调pH至8.0;然后将胰蛋白酶溶液和浓缩 液分别37°C水浴预热10?15min，将预热后的胰蛋白酶溶液和发酵浓缩液充分混合；
[0030] 步骤②所述的氯仿正丁醇混合液中氯仿和正丁醇的体积比为5:1 ;
[0031]步骤②所述的离心转速为8000?lOOOOrpm，所述的离心时间为10?15min;
[0032] 步骤（1)中所述的云芝（Coriolus versicolor)液体深层发酵培养的方法，优选 包含如下步骤：
[0033] ( I )将云芝斜面母种活化培养后转接至斜面固体培养基中，24?27°C培养10? 15d，直至菌丝铺满斜面为止，得到云芝斜面菌种；
[0034] ( II )从步骤（I )制备得到的云芝斜面菌种上挑取4?6菌块，接种至200mL的 液体发酵培养基中，室温静置24h，待菌块伤口处愈合后，在150rpm，27的条件下振荡培养 6d，制得一级种子液；
[0035] (III)将步骤（II )制备得到的一级种子液转入50L种子罐培养二级种子液，接种 量为7 %，培养温度为27°C，转速为150rpm，罐压为0. 05?0. 07MPa，通气量1. 5m3/h (V: V为 1:0. 6)，培养3d后转入500L发酵罐培养，初始培养条件温度，转速及罐压与种子罐相同，通 气量为12m3/h，培养3?5d;
[0036] 步骤（I )所述的斜面固体培养基的配方为：马铃薯（去皮）200g，葡萄糖20g，蛋 白胨 lg，（NH4)2S042g，MgS04 ? 7H20 lg，KH2P04lg，琼脂 20g，加蒸馏水定容至 1000mL，pH 调至 6. 5；
[0037] 步骤（II )和（III)中用于一级种子液和二级种子液培养以及发酵培养的培养 基配方为：步骤（1)中所述的云芝液体深层发酵的培养基配方为：葡萄糖50g，NH 4N032g， KH2P042g，MgS0 4 ? 7H20 lg，维生素 &0? 05g，水 1000mL，pH 6. 5 ;
[0038] 一种云芝多糖提取物，根据上述制备方法制备得到；
[0039] 所述的云芝胞内多糖提取物（IPCV)中总糖、还原糖、蛋白质含量分别为 66. 58%?69. 53%，3. 14%?3. 74%，0. 36%?0? 40%;胞外多糖提取物（EPCV)中总糖、 还原糖、蛋白质含量分别为63. 91%?64. 89%，3. 08%?3. 48%，0. 17%?0? 22%;
[0040] 所述的云芝多糖提取物具有良好的降血脂作用，显著降低动脉粥样硬化指数，具 有抗动脉粥样硬化的能力，可作为生产云芝多糖提取物降血脂和抗动脉粥样硬化药物与保 健食品开发的原料；
[0041] 所述的云芝胞内多糖提取物在降血脂药物与保健食品应用中的使用剂量为50mg/ (kg ? d)，云芝胞外多糖提取物的使用剂量为200mg/ (kg ? d);
[0042] 与现有的技术相比，本发明具有如下优点和有益效果：
[0043] (1)本发明的云芝多糖提取物，采用中式发酵罐生产，从菌丝体中获得云芝胞内多 糖提取物，从发酵液中获得胞外多糖提取物，不但制备过程简单，条件易控制，而且可大批 量工厂化生产。
[0044] (2)本发明使用葡萄糖和硝酸铵作为碳氮源的合成培养基进行发酵，不但培养基 成分精确，重复性强，发酵效率高，而且多糖质量稳定、易于分离纯化，特别重要的是发酵的 多糖测定不受培养基中糖含量的影响。
[0045] (3)使用不同云芝菌株液体发酵，多糖产率和活性有所差异。本发明采用的云芝菌 株，性状优良，适宜用于液体发酵产多糖，其产率高。
[0046] (4)本发明采用活化的斜面菌块接种于液体培养基，培养获得一级种子液，可以缩 短液体种制备周期，简化生产工艺，而不需另外制备菌液。
[0047] (5)本发明所得胞外多糖提取物，来源于云芝液体深层发酵液，而且提取过程中安 全可控，具有对人体无毒害的优点。
[0048] (6)本发明所得云芝胞内多糖提取物溶解性好，胞外多糖提取物有少量难溶物，两 者均具有良好的降血脂、抗动脉粥样硬化的作用。
【专利附图】
【附图说明】
[0049] 图1为云芝多糖提取物对小鼠血清TC的影响图。
[0050] 图2为云芝多糖提取物对小鼠血清TG的影响图。
[0051] 图3为云芝多糖提取物对小鼠血清LDL-C的影响图。
【具体实施方式】
[0052] 下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限 于此。
[0053] 实施例中涉及到的培养基配方：
[0054] 斜面固体培养基配方：马铃薯（去皮）200g，葡萄糖20g，蛋白胨lg，（NH4)2S0 42g， MgS04 ? 7H20 lg，KH2P04lg，琼脂 20g，加蒸馏水定容至 1000mL，pH 调至 6. 5 ;
[0055] 液体发酵培养基配方：葡萄糖50g，NH4N032g，KH2P0 42g，MgS04 ? 7H201g，维生素 E^O. 05g，水 1000mL，pH 6. 5;
[0056] 云芝（Coriolus versicolor)菌株由华南师范大学生命科学学院提供（张峰源， 张松，曾剑锋.罗炜杰，云芝、灵芝和柱状田头菇胞外多糖对果蝇寿命的影响.生命科学 研宄，11 (2) : 130-133, 2007.);
[0057]实施例1
[0058] (1)云芝（Coriolus versicolor)经斜面或平板菌种培养、液体振荡培养和液体 深层发酵培养，得到菌丝体和发酵液，具体方法如下：
[0059] ①斜面或平板菌种培养：将活化后的云芝斜面母种菌丝块接入新的斜面固体培养 基中，24°C培养10d，置于4°C保存备用。
[0060] ②一级液体菌种培养：取200mL液体发酵培养基装入500mL三角瓶，在121°C灭菌 20min，并接入4个黄豆大小的的云芝母种菌丝块；室温静置24h，待菌块伤口处愈合后在 27°C，转速150rpm，避光恒温振荡培养6天，得到一级种子液；
[0061] ③二级液体菌种培养：50L种子罐装入液体发酵培养基35L，125°C灭菌20min ;冷 却后接入2. 45L培养好的一级种子液，培养温度为27°C，转速为150rpm，罐压为0. 05? 0. 07MPa，通气量约1. 5m3/h(V:V为1:0. 6)培养3天，取样观察可发现到种子液清澈透亮， 菌丝体丰富，大小均匀。
[0062] ④液体深层发酵培养：将培养好的二级种子液转入500L发酵罐培养，初始培养条 件温度，转速及罐压与种子罐相同，通气量约为12m 3/h，培养4d;
[0063] (2)将发酵产物通过高速离心获得菌丝体和发酵液，发酵液经1万分子量PS超滤 膜超滤去除小分子物质后，浓缩至20L，得到云芝超滤液，其中，超滤条件为：进膜压力约为 10bar，通量3L/min，物料温度22°C。
[0064] (3)将云芝菌丝体55°C烘干粉碎过40目筛后，进行脱脂处理（菌丝体粉末与石油 醚按体积比为1:2混匀，振荡或搅拌处理3d，脱去菌丝体中的脂质，离心留沉淀；重复脱脂2 次）并干燥；然后以料液比为1:30,提取时间为2h，提取温度为90°C，提取次数为2次的工 艺参数热水浸提胞内多糖，获得含有云芝胞内多糖的浸提液；
[0065] (4)浓缩：用旋转蒸发仪将步骤（2)得到的云芝超滤液和步骤（3)得到的浸提液 分别在60°C的恒温水浴锅中减压浓缩至原体积的1/10,得到超滤浓缩液和浸提浓缩液；
[0066] (5)胰蛋白酶和sevage法去蛋白、离心：称取2. 0g胰蛋白酶溶于100mL蒸馏水中， 再把1000mL的浓缩液调pH至8. 0,将酶液及浓缩液同时放入37°C水浴锅中预热lOmin，把 两者充分混合，并振荡保持30min后放入100°C水浴锅中灭酶10min，冷却至室温；然后加 入0.2倍体积的氯仿正丁醇混合液（氯仿：正丁醇（V:V) = 5:1)，剧烈震荡30min，然后 8000rpm离心10min，弃取蛋白层及有机溶液，回收上清液，此过程重复2次；
[0067] (6)在去蛋白后的多糖溶液中加入4倍体积的乙醇，放于4°C冰箱冷藏2d，待析出 粗多糖，离心得到沉淀；用少量蒸馏水溶解沉淀，调节多糖溶液pH至8. 0,然后滴加30%的 H202 (每100mL多糖液滴加2mL质量分数为30%的H202溶液），在50°C下水浴保温2h，对其 进行脱色素处理；之后，将多糖溶液装入截留分子量为8000?15000Da的透析袋中以蒸馏 水透析约3d，每8h更换一次蒸馏水。最后，对透析完成后的溶液进行浓缩，并真空冷冻干 燥，获得云芝胞内和胞外多糖提取物（IPCV和EPCV)。
[0068] 云芝胞内和胞外多糖提取物，经苯酚硫酸法测定含总糖分别为66. 58 %和 63. 91 %，经DNS比色法测定含还原糖分别为3. 14%和3. 08%，经考马斯亮兰法测定含蛋白 分别为〇? 36%和0? 17%。
[0069] 实施例2
[0070] (1)云芝（Coriolus versicolor)经斜面或平板菌种培养、液体振荡培养和液体 深层发酵培养，得到菌丝体和发酵液，具体方法件如下：
[0071] ①斜面或平板菌种培养：将活化后的云芝斜面母种菌丝块接入新的斜面固体培养 基中，25°C培养12d，置于4°C保存备用。
[0072] ②一级液体菌种培养：取200mL液体发酵培养基装入500mL三角瓶，在121°C灭菌 20min，并接入6个黄豆大小的的云芝母种菌丝块；室温静置24h，待菌块伤口处愈合后在 27°C，转速150rpm，避光恒温振荡培养6天，得到一级种子液；
[0073] ③二级液体菌种培养：50L种子罐装入液体发酵培养基35L，125°C灭菌20min;冷 却后接入2. 45L培养好的一级种子液，培养温度为27°C，转速为150rpm，罐压为0. 05? 0. 07MPa，通气量约1. 5m3/h(V:V为1:0. 6)培养3天，取样观察可发现到种子液清澈透亮， 菌丝体丰富，大小均匀。
[0074] ④液体深层发酵培养：将培养好的二级种子液转入500L发酵罐培养，初始培养条 件温度，转速及罐压与种子罐相同，通气量约为12m 3/h，培养5d;
[0075] (2)将发酵产物通过高速离心获得菌丝体和发酵液，发酵液经1万分子量PS超滤 膜超滤去除小分子物质后，浓缩至20L，得到云芝超滤液，其中，超滤条件为：进膜压力约为 10bar，通量5L/min，物料温度22°C。
[0076] (3)将云芝菌丝体50°C烘干粉碎过40目筛后，进行脱脂处理（菌丝体粉末与石油 醚按体积比为1:2混匀，振荡或搅拌处理3d，脱去菌丝体中的脂质，离心留沉淀；重复脱脂2 次）并干燥；然后以料液比为1:30,提取时间为3h，提取温度为90°C，提取次数为3次的工 艺参数热水浸提胞内多糖，获得含有云芝胞内多糖的浸提液；
[0077] (4)浓缩：用旋转蒸发仪将步骤（2)得到的云芝超滤液和步骤（3)得到的浸提液 分别在60°C的恒温水浴锅中减压浓缩至原体积的1/7,得到超滤浓缩液和浸提浓缩液；
[0078] (5)胰蛋白酶和sevage法去蛋白、离心：称取2. 0g胰蛋白酶溶于100mL蒸馏水中， 再把1000mL的浓缩液调pH至8. 0,将酶液及浓缩液同时放入37°C水浴锅中预热12min，把 两者充分混合，并振荡保持40min后放入100°C水浴锅中灭酶12min，冷却至室温；然后加 入0.2倍体积的氯仿正丁醇混合液（氯仿：正丁醇（V:V) = 5:1)，剧烈震荡35min，然后 8500rpm离心12min，弃取蛋白层及有机溶液，回收上清液，此过程重复2次；
[0079] (6)在去蛋白后的多糖溶液中加入3倍体积的乙醇，置于25°C沉降ld，待析出粗 多糖，离心得到沉淀；用少量蒸馏水溶解沉淀，调节多糖溶液pH至8. 0,然后滴加质量分数 为30 %的H202 (每100mL多糖液滴加2mL质量分数为30 %的H202溶液），在55 °C下水浴保 温3h，对其进行脱色素处理；之后，将多糖溶液装入截留分子量为8000?15000Da的透析 袋中以蒸馏水透析约3d，每9h更换一次蒸馏水。最后，对透析完成后的溶液进行浓缩，并真 空冷冻干燥，获得云芝胞内和胞外多糖提取物（IPCV和EPCV)。
[0080] 云芝胞内和胞外多糖提取物，经苯酚硫酸法测定含总糖68. 78%和64. 92%，经 DNS比色法测定含还原糖3. 60%和3. 32%，经考马斯亮兰法测定含蛋白0. 39%和0. 21%。
[0081] 实施例3
[0082] (1)云芝（Coriolus versicolor)经斜面或平板菌种培养、液体振荡培养和液体 深层发酵培养，得到菌丝体和发酵液，具体方法件如下：
[0083] ①斜面或平板菌种培养：将活化后的云芝斜面母种菌丝块接入新的斜面固体培养 基中，27°C培养15d，置于4°C保存备用。
[0084] ②一级液体菌种培养：取200mL液体发酵培养基装入500mL三角瓶，在121°C灭菌 20min，并接入5个黄豆大小的的云芝母种菌丝块；室温静置24h，待菌块伤口处愈合后在 27°C，转速150rpm，避光恒温振荡培养6天，得到一级种子液；
[0085] ③二级液体菌种培养：50L种子罐装入液体发酵培养基35L，125°C灭菌20min;冷 却后接入2. 45L培养好的一级种子液，培养温度为27°C，转速为150rpm，罐压为0. 05? 0. 07MPa，通气量约1. 5m3/h(V:V为1:0. 6)培养3天，取样观察可发现到种子液清澈透亮， 菌丝体丰富，大小均匀。
[0086] ④液体深层发酵培养：将培养好的二级种子液转入500L发酵罐培养，初始培养条 件温度，转速及罐压与种子罐相同，通气量约为12m 3/h，培养3d;
[0087] (2)将发酵产物通过高速离心获得菌丝体和发酵液，发酵液经1万分子量PS超滤 膜超滤去除小分子物质后，浓缩至20L，得到云芝超滤液，其中，超滤条件为：进膜压力约为 10bar，通量4L/min，物料温度22°C。
[0088] (3)将云芝菌丝体55°C烘干粉碎过40目筛后，进行脱脂处理（菌丝体粉末与石油 醚按体积比为1:2混匀，振荡或搅拌处理2d，脱去菌丝体中的脂质，离心留沉淀；重复脱脂1 次）并干燥；然后以料液比为1:30,提取时间为3h，提取温度为90°C，提取次数为3次的工 艺参数热水浸提胞内多糖，获得含有云芝胞内多糖的浸提液；
[0089] (4)浓缩：用旋转蒸发仪将步骤⑵得到的云芝超滤液和步骤⑶得到的浸提液 分别在55°C的恒温水浴锅中减压浓缩至原体积的1/5,得到超滤浓缩液和浸提浓缩液；
[0090] (5)胰蛋白酶和sevage法去蛋白、离心：称取2. 0g胰蛋白酶溶于100mL蒸馏水中， 再把1000mL的浓缩液调pH至8. 0,将酶液及浓缩液同时放入37°C水浴锅中预热15min，把 两者充分混合，并振荡保持60min后放入100°C水浴锅中灭酶15min，冷却至室温；然后加 入0.2倍体积的氯仿正丁醇混合液（氯仿：正丁醇（V:V) = 5:1)，剧烈震荡40min，然后 9000rpm离心15min，弃取蛋白层及有机溶液，回收上清液，此过程重复3次；
[0091] (6)在去蛋白后的多糖溶液中加入5倍体积的乙醇，置于8°C沉降12h，待析出粗 多糖，离心得到沉淀；用少量蒸馏水溶解沉淀，调节多糖溶液pH至8. 0,然后滴加质量分数 为30 %的H202 (每1 OOmL多糖液滴加2mL质量分数为30 %的H202溶液），在52 °C下水浴保 温2. 5h，对其进行脱色素处理；之后，将多糖溶液装入截留分子量为8000?15000Da的透 析袋中以蒸馏水透析约2d，每10h更换一次蒸馏水。最后，对透析完成后的溶液进行浓缩， 并真空冷冻干燥，获得云芝胞内和胞外多糖提取物（IPCV和EPCV)。
[0092] 云芝胞内和胞外多糖提取物，经苯酚硫酸法测定含总糖69. 53%和64. 89%，经 DNS比色法测定含还原糖3. 74%和3. 48%，经考马斯亮兰法测定含蛋白0. 40%和0. 22%。
[0093] 实施例4
[0094] (1)云芝多糖提取物（实施例1制备得到）降血脂作用的实验（高剂量）
[0095] ①昆明种小鼠，SPF级别，雄性，体重18?22g，购自中山大学实验动物中心。许可 证号4〇((粵）2011-0029 ;高脂饲料（配方为：10%猪油、1.0%胆固醇、0.3%胆盐、88.7% 普通饲料），购自广东省医学实验动物中心。许可证号：SCK(粵）2008-0002。小鼠用普通 饲料适应性喂养4d后，根据小鼠体重随机分为正常对照组，高脂模型组，阳性对照组（辛伐 他汀，lOmgAkg ? d))，200mgAkg ? d)多糖提取物高剂量组，每组小鼠数为10只。实验期间 小鼠自由饮水，定量给食。所有小鼠饲养于温度为18?22°C，相对湿度为50%?60%，有 自然光照的标准实验动物房。除正常对照组小鼠给予普通饲料外，其他各实验组给予高脂 饲料，每只小鼠5g/d(后两周增至6g/d)。采取预防模式给药：即高脂饲料建模与给药同时 进行。每天上午定时对实验处理组小鼠灌胃各药物一次，每只小鼠灌胃量均为〇.5mL，正常 对照组和高脂模型组灌胃等体积的蒸馏水。实验进行28d。实验期间每周称量一次体重，每 日观察小鼠摄食，自主活动情况。
[0096] ②最后一天灌胃后，小鼠禁食不禁水12h，断颈取血，分离得血清后分别检测血脂 四项指标TC、TG、HDL-C、LDL-C的含量。取血后迅速解剖小鼠，取其心脏，肝脏、肾脏、脾脏， 并计算心指数、肝指数、肾指数和脾指数（以脏器鲜重/体重表示）。
[0097] (2)云芝多糖提取物（实施例1制备得到）降血脂作用的实验（中剂量）
[0098] 方法同步骤（1)，其中，各处理组分别为正常对照组，高脂模型组，阳性对照组（辛 伐他汀，l〇mg/(kg ? d))，100mg/(kg ? d)多糖提取物中剂量组，每组小鼠数为10只。
[0099] (3)云芝多糖提取物（实施例1制备得到）降血脂作用的实验（低剂量）
[0100] 方法同步骤（1)，其中，各处理组分别为正常对照组，高脂模型组，阳性对照组（辛 伐他汀，l〇mg/ (kg ? d))，50mg/ (kg ? d)多糖提取物低剂量组，每组小鼠数为10只。②同步 骤⑴。
[0101] 上述（1)、⑵、（3)的实验数据如表1，表2和表3所示。
[0102] 由表1可知，小鼠摄食高脂饲料至最后一天，与正常对照组相比，高脂模型组小鼠 血清中TC的含量极显著地升高了 104. 72% (P〈0. 01);由表2可知，实验结束时，相对正常 对照组，小鼠摄食高脂饲料使得其血清LDL-C、HDL-C和动脉粥样硬化指数AI极显著地升高 285. 14%，56. 16%和44. 20% (P〈0. 01)，以上说明摄入外源性高脂成分使得小鼠体内脂质 水平极显著升高，是典型的脂质代谢紊乱症状，这提示本实验小鼠高脂血症模型已成功建 立。
[0103] 表1云芝多糖提取物对小鼠血清TC及TG水平的影响
[0104]
【权利要求】
1. 一种云芝多糖提取物的制备方法，其特征在于包含如下步骤： (1) 云芝（Coriolus versicolor)液体深层发酵后，分离得到云芝菌丝体和发酵液，其 中，云芝菌丝体干燥粉碎并过筛后，脱脂，干燥，得到脱脂后的菌丝体；发酵液超滤去除小分 子物质，得到云芝超滤液； (2) 热水浸提脱脂后的菌丝体，得到含云芝胞内多糖的浸提液； (3) 将步骤（1)得到的云芝超滤液和步骤（2)得到的浸提液分别浓缩，得到超滤浓缩液 和浸提浓缩液； (4) 将步骤（3)制备得到的超滤浓缩液和浸提浓缩液分别采用胰蛋白酶和Sevage法去 蛋白，得到去蛋白后的胞外多糖提取液和胞内多糖提取液； (5) 用乙醇分别沉降步骤（4)得到的胞外多糖提取液和胞内多糖提取液中的多糖， 然后离心分离得到沉淀，脱色透析干燥后，分别制得云芝胞内提取物和云芝胞外多糖提取 物； 步骤（4)中所述的胰蛋白酶和Sevage法，包含如下步骤： ① 将步骤（3)制备得到的浓缩液分别调pH至8.0 ;然后将胰蛋白酶加入浓缩液中充分 混合并37°C振荡30?60min，再水浴灭酶10?15min，冷却至室温； ② 去蛋白后的浓缩液加入0. 2倍体积的氯仿正丁醇混合液，剧烈振荡30?40min ;然 后离心，弃取蛋白层及有机溶液，回收上清液； ③ 重复步骤②2?3次，得到去蛋白后的多糖提取液。
2. 根据权利要求1所述的云芝多糖提取物的制备方法，其特征在于： 步骤（1)中所述的脱脂方法为：菌丝体粉末与石油醚按体积比为1:2混匀，振荡或搅拌 处理2?3d，脱去菌丝体中的脂质，离心留沉淀；重复脱脂1?2次。
3. 根据权利要求1所述的云芝多糖提取物的制备方法，其特征在于： 步骤（1)中所述的超滤条件为进膜压力为l〇bar，通量3?5L/min，物料温度22°C。
4. 根据权利要求1所述的云芝多糖提取物的制备方法，其特征在于： 步骤（2)中所述的热水浸提的条件为：料液比为1:30,提取时间为2?3h，提取温度为 90°C，提取次数为1?3次。
5. 根据权利要求1所述的云芝多糖提取物的制备方法，其特征在于： 步骤（5)中所述的脱色透析干燥的方法为：用水溶解沉淀并调节多糖溶液pH至8. 0 ; 然后滴加质量分数为30%的H202溶液，于50?55°C水浴保温2?3h，对其进行氧化脱色 处理；然后将多糖溶液装入截留分子量为8000?15000Da的透析袋中透析2?3d，每8? l〇h更换一次水；对透析完成后的溶液进行浓缩，并真空冷冻干燥，获得云芝多糖提取物。
6. 根据权利要求1所述的云芝多糖提取物的制备方法，其特征在于： 步骤（1)中所述的云芝（Coriolus versicolor)液体深层发酵培养的方法，优选包含 如下步骤： (I )将云芝斜面母种活化培养后转接至斜面固体培养基中，24?27°C培养10?15d， 直至菌丝铺满斜面为止，得到云芝斜面菌种； (II )从步骤（I )制备得到的云芝斜面菌种上挑取4?6菌块，接种至200mL的液体 发酵培养基中，室温静置24h，待菌块伤口处愈合后，在150rpm，27的条件下振荡培养6d，制 得一级种子液； (Ill)将步骤（II )制备得到的一级种子液转入50L种子罐培养二级种子液，接种量为 7%，培养温度为27°C，转速为150rpm，罐压为0? 05?0? 07MPa，通气量1. 5m3/h，培养3d后 转入500L发酵罐培养，初始培养条件温度，转速及罐压与种子罐相同，通气量为12m3/h，培 养3?5d〇
7. 根据权利要求6所述的云芝多糖提取物的制备方法，其特征在于： 步骤（I )所述的斜面固体培养基的配方为：马铃薯200g，葡萄糖20g，蛋白胨lg， (NH4)2S042g，MgS04 ? 7H20 lg，KH2P04lg，琼月旨 20g，加蒸馏水定容至 1000mL，pH 调至 6. 5。
8. 根据权利要求6所述的云芝多糖提取物的制备方法，其特征在于： 步骤（II )和（III)中用于一级种子液和二级种子液培养以及发酵培养的培养基配方 为：步骤（1)中所述的云芝液体深层发酵的培养基配方为：葡萄糖50g，NH4N032g，KH 2P042g， MgS04 ? 7H20 lg，维生素 &0? 05g，水 1000mL，pH 6. 5。
9. 一种云芝多糖提取物，其特征在于根据权利要求1?8任一项所述的制备方法制备 得到。
10. 权利要求9所述的云芝多糖提取物在制备降血脂、抗动脉粥样硬化药物或保健食 品中的应用。
【文档编号】A61K31/715GK104450826SQ201410857383
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2014年12月31日 优先权日:2014年12月31日
【发明者】张松, 张命龙 申请人:华南师范大学