预防或减弱肺纤维化的复合物及其制剂和用途的制作方法

本发明属于医药用途领域，特别涉及预防或减弱肺纤维化的复合物及其制剂和用途。

背景技术：

肺癌是全球范围内发病率和死亡率最高的恶性肿瘤；非小细胞肺癌(Non Small Cell Lung Cancer,NSCLC)占所有肺癌病例的80％～85％。表皮生长因子受体(Epidermal growth factor receptor，EGFR)和间变性淋巴瘤激酶(anaplasticlymphoma kinase，ALK)在NSCLC的发生发展过程中起着重要作用。EGFR酪氨酸激酶抑制剂(Tyrosine kinase inhibitor,TKI)和ALK-TKI为代表的靶向药物对特定NSCLC患者取得了显著的疗效，但是TKI治疗过程中出现严重的并发症--间质性肺炎；尽管其发病率低，但一旦发生往往对患者产生致命影响。

吉非替尼(gefitnib，易瑞沙)为代表的EGFR-TKI，是目前被多国批准并广泛应用于进展或难治性NSCLC的小分子靶向药物，具有高选择性和低毒性的优势，在改善晚期NSCLC的近远期疗效与生活质量中的作用显示出令人鼓舞的前景。近来的Ⅲ期临床研究结果表明，对EGFR突变的NSCLC患者，一线使用靶向药物厄洛替尼，与一线常规化疗相比，可提高将近3倍的无进展生存时间。

间质性肺炎是吉非替尼和厄洛替尼少见但致命的不良反应。日本学者Okamoto et al报道了首例因服用吉非替尼导致严重间质性肺炎 而死亡的病例。患者用药8d后即出现呼吸困难，尽管给予大剂量类固醇激素治疗，但仍于给药13d后死亡。美国FDA的研究发现，在美国使用吉非替尼的患者中间质性肺炎的发生率为1％，其中约1/3患者死于间质性肺炎。预防EGFR-TKIs所致的间质性肺炎是改善该类患者预后的关键。皮质激素是治疗这类间质性肺炎最重要的措施之一，但疗效不尽人意且副作用较大。因此，若能发现一种新的、有效的措施预防间质性肺炎的发生，则对于增强TKI的安全性、改善患者预后都将具有重要的科学意义和临床价值。

经研究表明，肺纤维化是间质性肺炎最基本的病理改变，其发病机制主要包括成纤维细胞的聚集和细胞外基质过量沉积等。目前临床上多数是通过预防或减弱肺纤维化的产生，来预防间质性肺炎的发生。

二甲双胍是一种治疗糖尿病的经典药物，经济安全、耐受性好，由于其降血糖机制是抑制胃肠道葡萄糖的摄取，增加周围组织对胰岛素的敏感性，抑制肝、肾过度的糖原异生，故对正常人无降血糖作用；随着研究的深入，现有技术公开了许多二甲双胍与其他成分组合的复合物；例如，CN103271907公开了一种由小檗碱和二甲双胍组成的治疗糖尿病的组合物；CN103860532公开了一种由美金刚和二甲双胍组成的用于治疗阿尔茨海默型痴呆症的组合物；此外，现在技术还公开了由二甲双胍和氯茴苯酸类、或与DPP-4抑制剂等组成的复方组合物。但是现有技术还未见有关于以二甲双胍为主的双胍类药物与吉非替尼等EGFR-TKI或ALK-TKI组合用于预防或减弱肺纤维化从而用于治疗间质性肺炎的报道。

技术实现要素：

本发明提供了一种用于预防或减弱由EGFR-TKI或ALK-TKI治疗非小细胞肺癌时产生的肺纤维化的复合物及其制剂。

本发明提供一种预防或减弱肺纤维化的复合物，其中，该复合物包括重量份数为2-4份的双胍类药物和2-5份的TKI；所述TKI选自EGFR-TKI或ALK-TKI。

进一步的改进，双胍类药物选自二甲双胍及其盐、苯乙双胍或氯胍；所述EGFR-TKI选自吉非替尼、厄洛替尼、埃克替尼、阿法替尼、AZD9291、CO-1686或HM61713；所述ALK-TKI选自克唑替尼或色瑞替尼。

当双胍类药物为二甲双胍，EGFR-TKI为吉非替尼，并且，二甲双胍的重量份数为3份，吉非替尼的重量份数为2份时，对肺纤维化的减弱效果最为明显。

本发明另一方面提供了由复合物和辅料制成的口服制剂，优选为片剂。

该片剂为由片芯和包裹片芯的速释层组成的双层片剂，所述片芯由二甲双胍与赋形剂制成；所述速释层由吉非替尼和辅料制成。

优选地，辅料为粉状纤维素、β-环糊精、阿拉伯胶、交联聚维酮和微粉硅胶；赋形剂为乳糖醇、聚乙烯马来酸酐、乙二醇单硬脂酸酯、交联聚维酮和肉豆蔻醇；所述双层片剂的重量份如下：

片芯：

速释层：

本发明通过将复合物制成双层片剂之后，使该片剂进入体内后，吉非替尼先发挥作用，之后，二甲双胍慢慢发挥作用，两者起到即治疗非小细胞肺癌的作用，同时还能够预防或减弱肺纤维化的发生。将吉非替尼与粉状纤维素和β-环糊精混合后，可降低吉非替尼药物在水溶液中的沉淀，提高吉非替尼的生物利用度；同时将二甲双胍与缓释材料聚乙烯马来酸酐和乙二醇单硬脂酸酯制成缓释片芯后，使片芯在1、2、6、12和24小时的累积溶出百分率分别达到30-32％、65-67％、80-82％、85-88％和90％以上，使该双层片具有释药平稳、缓慢释药的效果，并且能够达到24h释药得目的。

本发明另一方面提供了该复合物的用途，其在制备预防或减弱肺纤维化的药物中的应用。优选地所述肺纤维化是由EGFR-TKI或ALK-TKI治疗非小细胞肺癌时产生的。

本发明提供的复合物还可用于制备预防或减缓间质性肺炎的药物，所述间质性肺炎是由EGFR-TKI或ALK-TKI治疗非小细胞肺癌时产生的并发症。

本发明另一方面还提供了片剂的应用，该片剂可用于制备预防或减弱肺纤维化的药物。优选地，肺纤维化是由EGFR-TKI或ALK-TKI治疗非小细胞肺癌时产生的。

本发明的有益效果在于，本发明提供一种双胍类药物和TKI的复合物及其用途，该复合物可用于预防或减弱肺纤维化，特别是EGFR-TKI或ALK-TKI治疗非小细胞肺癌时产生的肺纤维化，从而起到预防或减弱间质性肺炎的发生，其可避免EGFR-TKI或ALK-TKI治疗非小细胞肺癌时产生的并发症，有效地提高EGFR-TKI或ALK-TKI的治疗效果，减少患者并发症的发生及发展。

附图说明

图1为免疫荧光技术检测纤维化指标α-actin表达的结果；

图2为western blot技术检测纤维化标志物α-actin及COL1A1的表达，检测TGF-β下游关键信号通路蛋白的表达的结果；

图3为HE染色及Masson染色的结果；

图4为Elisa方法检测羟脯氨酸含量的结果；

图5为免疫组化检测α-actin表达的结果；

图6为western blot检测COL1A1、α-actin及TGF-β下游关键信号通路蛋白的表达的结果。

具体实施例方式

实施例1 一种预防或减弱肺纤维化的复合物

该复合物包括3重量份的二甲双胍和2重量份的吉非替尼。

实施例2 一种双层片剂

片芯：

速释层：

实施例3 一种双层片剂

片芯：

速释层：

动物实验

实验例1 二甲双胍显著减弱吉非替尼刺激引起的肺纤维化的研究

1.1实验方法

将肺成纤维细胞株HFL-1分为6组，分别为对照组，P9-CM组，P9-CM+吉非替尼组，P9-CM+吉非替尼+二甲双胍组，R9-CM组，R9-CM+二甲双胍组；

对照组无特殊处理；P9-CM组给予来自PC-9细胞的条件培养基处理细胞48h；PC-9+吉非替尼组给予来自吉非替尼30μM处理的PC-9细胞的条件培养基处理细胞48h；PC-9+吉非替尼+二甲双胍组给予来自吉非替尼30μM处理的PC-9细胞的条件培养基联合二甲双胍20μM处理细胞48h；R9-CM组给予来自PC-9GR细胞的条件培养基处理细胞48h；R9-CM+二甲双胍组给予来自PC-9GR细胞的条件培养基联合二甲双胍20μM处理细胞48h；

48h后，采用免疫荧光技术检测纤维化指标α-actin的表达；采用western blot技术检测纤维化标志物α-actin、COL1A1及TGF-β下游关键信号通路蛋白的表达。

2.2实验结果

从图1中可以看出，与对照组相比，经过P9-CM组、R9-CM组和P9-CM+吉非替尼组处理的HFL-1细胞48h后，α-actin蛋白的表达明显增加；与P9-CM组比较，经过P9-CM+吉非替尼组处理的HFL-1细胞48h后，α-actin蛋白的表达也明显增加，由此得出，吉非替尼不但能够显著提高肺纤维化标志物α-actin蛋白的含量，并且能够进一步提高P9-CM组处理后的HFL-1细胞内的α-actin蛋白的含量；与P9-CM+吉非替尼组比较，经过P9-CM+吉非替尼+二甲双胍组处理后的HFL-1细胞，α-actin蛋白的表达显著降低；与R9-CM组比较，经过R9-CM+二甲双胍组处理后的HFL-1细胞，α-actin蛋白的表达显著降低；由此得出，二甲双胍不但可以显著减弱来自PC-9细胞株的条件培养基和来自PC-9GR细胞株的条件培养基引起的肺纤维化标志物α-actin蛋白的表达；而且能够显著减弱吉非替尼刺引起的肺纤维化标志物α-actin蛋白的表达。

从图2中可以看出，与对照组相比，经过R9-CM组和P9-CM+吉非替尼组处理的HFL-1细胞48h后，COL1A1、α-actin、pSmad2、pSmad3、pSTAT3、pAKT和dpERK1/2蛋白的表达明显增加；与P9-CM组比较，经 过P9-CM+吉非替尼组处理的HFL-1细胞48h后，COL1A1、α-actin、pSmad2、pSmad3、pSTAT3、pAKT和dpERK1/2蛋白的表达明显增加；与P9-CM+吉非替尼组比较，经过P9-CM+吉非替尼+二甲双胍组处理后的HFL-1细胞中，COL1A1、α-actin、pSmad2、pSmad3、pSTAT3、pAKT和dpERK1/2蛋白的表达明显降低；与R9-CM组比较，经过R9-CM+二甲双胍组处理后的HFL-1细胞中，COL1A1、α-actin、pSmad2、pSmad3、pSTAT3、pAKT和dpERK1/2蛋白的表达明显降低；由此得出，二甲双胍可显著减弱吉非替尼和来自PC-9GR细胞株的条件培养基引起的肺纤维化标志物α-actin和COL1A1蛋白的表达，显著抑制TGF-β信号通路关键下游蛋白的表达，显著抑制肺纤维化的关键机制。

1.3结论

从以上可以得出二甲双胍能够显著减弱吉非替尼引起的肺纤维化。

实验例2 二甲双胍显著减弱吉非替尼加重的博来霉素引起的肺纤维化的研究

2.1实验材料

6周龄健康雄性SD大鼠75只(购自第三军医大学大坪医院实验动物中心)，体重200g-210g；

吉非替尼，购自英国Tocris Bioscience公司；

二甲双胍，购自美国sigma公司；

HE及Masson染色试剂盒，由福州迈新生物技术公司生产；

酶联免疫吸附(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)试剂盒，由武汉优尔生公司生产。

2.2动物模型的制备及分组

将75只SD大鼠适应性喂养一周以后，按随机数字表的方法分为对照组，博莱霉素组，二甲双胍组，吉非替尼组和吉非替尼二甲双胍联用组，每组各15只；

将75只SD大鼠分别用1％戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后，仰卧固定于鼠板上，颈部去毛后乙醇消毒，纵行切开颈前皮肤，分离组织后暴露气管；

其中，对照组注入无菌生理盐水200μl，其余各组向气管内注入博莱霉素(5mg/kg，5g/L)，注射后迅速将动物直立，旋转，使药液在肺内分布均匀；

各实验组大鼠于气管内注射当天开始还需连续灌胃21天，其中，对照组与博莱霉素组给予生理盐水2ml灌胃，吉非替尼组给予吉非替尼200mg/kg灌胃；二甲双胍组给予二甲双胍300mg/kg灌胃；吉非替尼二甲双胍联用组给予吉非替尼200mg/kg联合二甲双胍300mg/kg灌胃；气管内注射后第21天，杀鼠取肺；

2.3观察指标

左肺石蜡切片行HE染色及Masson染色；免疫组化检测α-actin的表达；取右肺Elisa方法检测羟脯氨酸含量；western blot检测COL1A1、α-actin及TGF-β下游关键信号通路蛋白的表达。

2.4实验结果

从图3中可以看出，经HE染色法后，与对照组相比，经过博来霉素组和吉非替尼组处理小鼠的肺后，肺间隔增厚、肺间质水肿及纤维化毛细血管充血量均显著增加；与博来霉素组比较，经过吉非替尼组处理小鼠的肺后，肺间隔增厚、肺间质水肿及纤维化毛细血管充血量也显著增加；与博来霉素组比较，经过二甲双胍组处理小鼠的肺后，肺间隔增厚、肺间质水肿及纤维化毛细血管充血量均显著降低；与吉非替尼组比较，经过吉非替尼二甲双胍联用组处理小鼠的肺后，肺间 隔增厚、肺间质水肿及纤维化毛细血管充血量均显著降低；由此得出，二甲双胍可显著降低肺间隔增厚、肺间质水肿及纤维化毛细血管充血，显著减弱肺组织损伤程度；经masson染色可得出，与对照组相比，经过博来霉素组和吉非替尼组处理小鼠的肺后，肺组织纤维化程度加重；与博来霉素组比较，经过吉非替尼组处理小鼠的肺后，肺组织纤维化程度也加重；与博来霉素组比较，经过二甲双胍组处理小鼠的肺后，肺组织纤维化程度明显减弱；与吉非替尼组比较，经过吉非替尼二甲双胍联用组处理小鼠的肺后，肺组织纤维化程度明显减弱；由此得出，二甲双胍显著减弱了肺组织的纤维化程度。

从图4中可以看出，与对照组比较，经过博来霉素组和吉非替尼组处理小鼠的肺后，羟脯氨酸的含量显著增加；与博来霉素组比较，经过吉非替尼组处理小鼠的肺后，羟脯氨酸的含量也显著增加；与博来霉素组比较，经过二甲双胍组处理小鼠的肺后，羟脯氨酸的含量显著降低；与吉非替尼组比较，经过吉非替尼二甲双胍联用组处理小鼠的肺后，羟脯氨酸的含量显著降低；由此得出，二甲双胍可显著降低羟脯氨酸的含量，显著减弱组织胶原沉积。

从图5中可以看出，与对照组相比，经过博来霉素组处理小鼠的肺后，α-actin蛋白的表达明显增加；与博来霉素组相比，经过吉非替尼组处理小鼠的肺后，α-actin蛋白的表达也明显增加，由此得出，吉非替尼可加重博来霉素引起的肺纤维化标志物α-actin蛋白的表达；与博来霉素组比较，经过二甲双胍组处理小鼠的肺后，α-actin蛋白的表达明显降低；与吉非替尼组比较，经过吉非替尼二甲双胍联用组处理小鼠的肺后，α-actin蛋白的表达显著降低；由此得出，二甲双胍不但可以显著减弱博来霉素引起的肺纤维化标志物α-actin蛋白的表达；而且能够显著减弱吉非替尼加重的博来霉素引起的肺纤维化标志物α-actin蛋白的表达。

从图6中可以看出，与对照组相比，经过博来霉素组和吉非替尼 组处理小鼠的肺后，COL1A1、α-actin、pSmad2、pSTAT3、pAKT和dpERK1/2蛋白的表达明显增加；与博来霉素组比较，经过吉非替尼组处理小鼠的肺后，COL1A1、α-actin、pSmad2、pSmad3、pSTAT3和pAKT蛋白的表达明显增加；与博来霉素组相比，经过二甲双胍组处理小鼠的肺后，COL1A1、α-actin、pSmad2、pSTAT3、pAKT和dpERK1/2蛋白的表达明显降低；与吉非替尼组相比，经过吉非替尼二甲双胍联用组处理小鼠的肺后，COL1A1、α-actin、pSmad2、pSTAT3、pAKT和dpERK1/2蛋白的表达明显降低；由此得出，二甲双胍可显著减弱博来霉素引起的肺纤维化标志物α-actin和COL1A1蛋白的表达；而且能够显著减弱吉非替尼加重的博来霉素引起的肺纤维化标志物α-actin和COL1A1蛋白的表达；并且显著抑制TGF-β信号通路关键下游蛋白的表达，显著抑制肺纤维化的关键机制。

2.5结论

从以上可以得出二甲双胍能够显著减弱博来霉素引起的肺纤维化；并且显著减弱吉非替尼加重的博来霉素引起的肺纤维化。