本发明涉及四个氯代四氢苯乙基色酮衍生物在预防或治疗炎症相关疾病、自身免疫性疾病和器官移植排斥中的应用，属于医药技术领域。
背景技术：
人体免疫系统包括天然免疫和适应性免疫，在防御各种内外源因素导致的机体损伤中起重要作用。但是免疫功能过度激活也会导致严重的组织损伤。与免疫功能过度激活相关的的疾病主要有炎症相关疾病、自身免疫性疾病和器官移植排斥。天然免疫过度激活主要导致炎症相关疾病或者加重炎症相关疾病机体损伤。适应性免疫过度激活导致自身免疫性疾病和器官移植排斥。
目前预防或治疗炎症相关疾病的药物主要有糖皮质激素和环氧化酶抑制剂为代表的非甾体抗炎药。虽然糖皮质激素和非甾体抗炎药具有较好的抗炎作用，但是药物不良反应严重限制了它们的应用。糖皮质激素长期应用会导致代谢功能紊乱，非甾体抗炎药长期应用会导致胃溃疡。预防或治疗自身免疫性疾病和器官移植排斥的药物主要有糖皮质激素和环孢素、他克莫司等适应性免疫抑制剂。糖皮质激素长期使用会导致代谢功能紊乱，而环孢素和他克莫司等适应性免疫抑制剂又具有较高的肾毒性。因此，开发新的结构和作用机制的天然免疫和适应性免疫抑制剂对于预防或治疗炎症相关疾病、自身免疫性疾病和器官移植排斥具有重要意义。
沉香是瑞香科植物白木香含有树脂的木材。中国药典记载沉香具有行气止痛、温中止呕、纳气平喘的功效，用于治疗胸腹胀闷疼痛、胃寒呕吐呃逆、肾虚气逆喘急。这些功效和治疗作用与现代医学的抗炎作用十分相似。本发明人对广泛存在于沉香中的苯乙基色酮衍生物进行了提取分离和结构鉴定，并对它们的天然免疫和适应性免疫抑制作用进行了筛选，以发现具有新的作用机制的天然免疫和适应性免疫抑制剂用于预防或治疗炎症相关疾病、自身免疫性疾病和器官移植排斥。
技术实现要素：
本发明人经过长期的提取分离和结构鉴定，从沉香中获得大量已知和未知的苯乙基色酮衍生物，经过药理筛选和深入的药效学研究，首次发现如下表格的3个已知氯代四氢苯乙基色酮衍生物(G1、G3和G4)(Chem.Pharm.Bull，2003，51(5)：560-564；Helvetica Chimica Acta，2012，95：1657-1665)和1个新的氯代四氢苯乙基色酮衍生物(G2)具有良好的天然免疫和特异性免疫抑制作用。
本发明的目的在于提供选自上述表格的1个新的氯代四氢苯乙基色酮衍生物(G2)。
本发明的另一目的在于提供选自上述表格的新的氯代四氢苯乙基色酮衍生物G2的制备方法。
本发明的又一目的在于提供选自上述表格中的四个氯代四氢苯乙基色酮衍生物通过天然免疫和特异性免疫抑制在预防或治疗炎症相关疾病、自身免疫性疾病和器官移植排斥中的应用。
本发明的再一目的在于提供含有效剂量上述表格中一种或多种化合物的药物组合物通过天然免疫和特异性免疫抑制在预防或治疗炎症相关疾病、自身免疫性疾病和器官移植排斥中的应用。
本发明首次从沉香中发现一种新的氯代四氢苯乙酮衍生物，具体结构如上述表格化合物G2，其特征在于氯原子和3个羟基在色酮环两侧，与化合物G4是立体异构体。
所述化合物G2提取分离步骤如下：
取沉香药材粉末，95％乙醇加热回流提取，减压浓缩至浸膏状，加水混悬，分别用石油醚、醋酸乙酯萃取。取醋酸乙酯部位浸膏，加硅胶拌样，上样于硅胶柱(200-300目)，依次用石油醚-醋酸乙酯(8∶1-1∶1)、氯仿-甲醇(20∶1-1∶3)梯度洗脱，得到GYF1～GYF7等7个流份。取流份GYF7，进一步经硅胶(200-300目)柱色谱分离，甲醇-二氯甲烷(1∶12)梯度洗脱，TLC检测，合并得到GYF7-1～GYF7-6等6个流份。取流份GYF7-3，经硅胶(200-300目)柱色谱分离，甲醇-二氯甲烷(1∶12)洗脱，得到GYF7-3-1～GYF7-3-5等5个流份。取流份GYF7-3-3经ODS反相柱分离，甲醇-水(50∶50)洗脱，洗脱液经半制备液相柱分离，乙腈-水(12∶88)洗脱，得到化合物G2(tR＝90min)。
本发明的化合物G1、G3和G4可根据本领域公知的方法制备。
本发明通过巨噬细胞株RAW264.7细胞和BV-2细胞筛选，证明化合物G1、G2、G3和G4具有抑制细菌脂多糖刺激RAW264.7细胞和BV-2细胞分泌一氧化氮的作用。
本发明通过酶联免疫测定，证明抑制巨噬细胞分泌一氧化氮作用最强的化合物G4具有抑制细菌脂多糖刺激的RAW264.7细胞分泌炎症因子TNF-α和IL-6的作用。
本发明通过流式细胞测定，证明G4具有抑制小鼠中性粒细胞活化的作用。
本发明通过流式细胞测定，证明G4具有抑制小鼠脾脏CD4+T细胞活化的作用。
本发明通过小鼠系统性炎症反应模型，证明通过灌胃给药化合物G4能够抑制静脉注射细菌脂多糖导致的系统性炎症反应。
本发明通过Western-Blot实验，证明化合物G4可以通过抑制JNK信号通路抑制天然免疫和特异性免疫。
本发明通过以上药理学实验证明了化合物G1、G2、G3和G4及其药物组合物可以通过天然免疫和特异性免疫抑制在预防或治疗炎症相关疾病、自身免疫性疾病和器官移植排斥中的应用。
本发明的含化合物G1、G2、G3和G4的药物组合物可根据本领域公知的方法制备。
本发明的化合物或含有它们的药物组合物可以单位剂量形式给药，给药途径可为口服、静脉注射、肌肉注射、鼻腔、口腔粘膜、皮肤或直肠等。
本发明的化合物或含有它们的药物组合物的给药剂型可以是液体剂型、固体剂型。如液体剂型可以是真溶液类、胶体类、微粒剂型、乳剂剂型、混悬剂型。其它剂型如片剂、胶囊、滴丸、气雾剂、丸剂、粉剂、溶液剂、混悬剂、乳剂、颗粒剂、栓剂、冻干粉针剂等。
本发明的化合物的药物组合物的给药剂量取决于许多因素，例如所要预防或治疗疾病的性质和严重程度，患者或动物的性别、年龄、体重、性格及个体反应，给药途径、给药次数、治疗目的，因此本发明的治疗剂量可以有大范围的变化。一般来讲，本发明化合物的每天的合适剂量范围：本发明涉及的化合物的用量为0.1～10mg/Kg体重，可一次服用或分2～4次服用。本发明的化合物G1、G2、G3、G4或含有它们的药物组合物可单独服用，或与其他治疗药物或对症药物合并使用。
本发明的化合物预防或治疗的炎症相关疾病可以是系统性炎症反应、肺炎、支气管炎、肝炎、肾炎、胃炎、肠炎、神经炎症、皮肤炎症等。
本发明的化合物预防或治疗的自身免疫性疾病可以是类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、系统性血管炎、硬皮病、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性再生障碍性贫血、桥本甲状腺炎等。
本发明的化合物预防或治疗的器官移植排斥可以是肾移植排斥、肝移植排斥、皮肤移植排斥、心脏移植排斥、造血干细胞移植排斥。
附图说明
附图为化合物G4对NF-κB通路和MAPK通路调节作用的Western-Blot检测图。
具体实施方式
以下将结合实施例对发明作进一步说明，但并不限制本发明的范围。
实施例1：化合物G2的制备
(1)实验材料
药材：沉香。经北京中医药大学中药现代研究中心屠鹏飞教授鉴定为瑞香科植物白木香Aquilaria sinensis(Lour.)Gilg含有树脂的木材。标本(CX2012029)存放于北京中医药大学中药现代研究中心标本库。
试剂：乙醇、石油醚、醋酸乙酯、氯仿、甲醇、二氯甲烷、乙腈等化学试剂均为分析纯，购自北京化工厂。
仪器及材料：美国Rudolph Autopol IV自动旋光计；日本岛津公司UV-2450分光光度计；美国Thermo Nicolet Nexus 470FT-IR傅立叶变换红外光谱仪；美国Varian Inova-500型核磁共振仪；日本岛津离子阱飞行时间质谱仪(IT-ToF-MS)；美国Waters2535半制备型高效液相色谱仪；JA50002精密电子天平；DHG-9070B鼓风干燥箱；DZF-6090真空干燥箱；薄层色谱用GF254硅胶预制板和柱色谱用硅胶(200-300目)，购自青岛海洋化工厂；德国Merck公司ODS C18色谱柱；瑞典Amersham Biosciences公司Sephadex LH-20色谱柱；分析型HPLC色谱柱：Diamonsil C18色谱柱(4.6×250mm，5μm)；半制备反相色谱柱：Water XTerra Prep C18色谱柱(10×250mm，5μm)和Shiseido Capcell PAK MG Prep C18色谱柱(10×250mm，5μm)。
(2)实验方法
取沉香药材6.9kg，95％乙醇加热回流提取3次，每次2.5h，合并醇提液，减压浓缩至浸膏状(3.39kg)，加水混悬，分别用石油醚和醋酸乙酯萃取。得石油醚部位150g，醋酸乙酯部位600g。取醋酸乙酯部位浸膏(400g)，加硅胶拌样，行硅胶柱层析(200-300目)，依次用石油醚-醋酸乙酯(8∶1→I∶1)、氯仿-甲醇(20∶1→1∶3)梯度洗脱，得到GYF1～GYF7等7个流份。取流份GYF7(67g)，进一步经硅胶(200-300目)柱色谱分离，甲醇-二氯甲烷(1∶12)梯度洗脱，TLC检视，合并相似流份，得到GYF7-1～GYF7-6等6个流份。取流份GYF7-3，行硅胶(200-300目)柱色谱分离，甲醇-二氯甲烷(1∶12)洗脱，得到GYF7-3-1～GYF7-3-5等5个流份。取流份GYF7-3-3经ODS反相柱分离，甲醇-水(50∶50)洗脱，目标洗脱液经半制备液相柱分离，乙腈-水(12∶88)洗脱，得到黄色油状物G2(13mg，tR＝90min)。对G2进行波谱数据测定和结构解析。
(3)实验结果
黄色油状物G2，HRESIMS给出准分子离子峰m/z 401.0545[M+Cl]-(计算值401.0564)，分子式为C18H19O6Cl。IR(KBr)vmax3424，1659，1612，1513，1435，1246，1180，1097，1037，827，796cm-1；1H和13C NMR数据见表1。
表1：化合物G2的1H(500MHz)和13C(125MHz)NMR数据
实施例2：化合物G1～G4体外抑制小鼠巨噬细胞和神经小胶质细胞一氧化氮(NO)分泌作用测定
(1)实验材料
细胞株：RAW264.7细胞购自中国医学科学院基础医学研究所细胞中心；BV-2细胞由中国医学科学院陈乃宏研究员馈赠。
试剂：化合物G1～G4由北京中医药大学中药现代研究中心从沉香中提取分离；DMEM高糖培养基和DMEM/F12培养基均购自康宁公司；细菌脂多糖购自北京拜尔迪生物技术有限责任公司(货号：L2880)；一氧化氮测定试剂盒(Griess试剂)购自普利莱基因技术有限公司(货号：E1030)；噻唑兰购自Amresco公司(货号：0793)；分析纯二甲基亚砜，购自北京化工厂。
仪器：Enspire Multimode Plate Reader购自德国铂金爱尔默公司。
(2)实验方法
将处于对数生长期的RAW264.7细胞(DMEM高糖培养基)和BV-2细胞(DMEM/F12培养基)接种到96孔板中，接种浓度均为20000细胞/孔，体积100μl，37℃和5％CO2孵育24小时后，加入化合物G1～G4，每个化合物设置7个浓度(无细胞毒作用)，各浓度设3个复孔，1小时后，加入细菌脂多糖(LPS)至终 浓度0.5μg/ml，继续孵育24小时。取50μl细胞上清，加入Griess试剂100μl，反应10分钟后，测定540nm波长的吸光度，并计算四个化合物对两种细胞分泌NO的半数抑制浓度(IC50)。另将细胞培养板中培养基弃去，加入100μl MTT试剂(PBS配制的0.5mg/ml噻唑兰溶液)，细胞培养箱继续孵育4h，然后弃去MTT试剂，各孔加入150μl的二甲基亚砜溶解甲瓒，测定570nm波长的吸光度，并计算各浓度化合物对RAW264.7细胞和BV-2细胞的生长抑制率。
(3)实验结果
通过分泌一氧化氮模型筛选，发现化合物G1～G4均能显著抑制小鼠巨噬细胞RAW264.7和小胶质细胞BV-2在脂多糖刺激后的一氧化氮分泌，其半数抑制浓度(IC50)如表2所示；化合物G1～G4在最高浓度达到100μM时仍对RAW264.7和小胶质细胞无生长抑制作用。
表2：化合物G1～G4体外抑制NO分泌作用测定
实施例3：化合物G4体外抑制小鼠巨噬细胞炎症因子分泌作用测定
(1)实验材料
细胞株：RAW264.7细胞购自中国医学科学院基础医学研究所细胞中心。
试剂：化合物G4由北京中医药大学中药现代研究中心从沉香中提取分离；DMEM高糖培养基和DMEM/F12培养基均购自康宁公司；细菌脂多糖购自北京拜尔迪生物技术有限责任公司(货号：L2880)；测定TNF-α和IL-6的ELISA试剂盒购自武汉博士德生物技术有限公司(货号：EK0527和EK0411)。
仪器：Enspire Multimode Plate Reader购自德国铂金爱尔默公司。
(2)实验方法
将处于对数生长期的RAW264.7细胞接种到96孔板中，接种浓度为50000细胞/孔，体积100μl，37℃和5％CO2孵育24小时后，加入化合物G4以及阳性药地塞米松(Dexamethasone，DEX)，地塞米松终浓度10μM(无细胞毒作用)，化合物G4终浓度分别为5、10、20μM，，各化合物各浓度设3个复孔，1小时后，加入细菌脂多糖(LPS)至终浓度0.5μg/ml，继续孵育24小时。取细胞上清，利用ELISA试剂盒测定细胞上清中TNF-α和IL-6浓度。
(3)实验结果
通过分泌炎症因子测定，发现化合物G4处理组细胞上清TNF-α和IL-6浓度显著低于LPS处理组，如表3所示(*P＜0.05vs LPS)。表明化合物G4能够抑制小鼠巨噬细胞RAW264.7在脂多糖刺激后的TNF-α和IL-6分泌。
表3：化合物G4体外抑制炎症因子分泌作用测定
实施例4：化合物G4体外抑制中性粒细胞活化作用测定
(1)实验材料
动物：Balb/c小鼠购自北京维通利华实验动物有限公司。
试剂：化合物G4由北京中医药大学中药现代研究中心从沉香中提取分离；PE标记大鼠抗小鼠CD11b抗体，购自美国BD Biosciences公司(货号：557397)。
仪器：FACSCantoTMII流式细胞仪购自美国BD Biosciences公司。
(2)实验方法
颈椎脱臼处死1只Balb/c小鼠，75％酒精浸泡5分钟，然后超净工作台内无菌去小鼠两侧股骨，剪开股骨膝关节端，利用1ml注射器吸取IMDM培养基(含2％胎牛血清)将股骨中骨髓细胞冲洗到离心管中。经40μm孔径无菌滤网过滤细胞和白细胞计数，然后将细胞接种到24孔板中，保持白细胞浓度1×106个/孔，加入IMDM培养基(含2％胎牛血清)至每孔培养基总体积1ml。再加入化合物G4以及阳性药地塞米松，地塞米松终浓度10μM(无细胞毒作用)，化合物G4终浓度分别为5、10、20μM，，各化合物各浓度设3个复孔，37℃和5％CO2孵育1小时后，加入250μl条件培养基(利用DMEM高糖培养基培养的RAW264.7细胞，经0.5μg/ml的LPS刺激24小时，TNF-α浓度30ng/ml)，37℃和5％CO2继续孵育1.5h。然后将细胞收集到离心管中，4℃，200g离心5分钟，倒去上清，250μl含1％牛血清白蛋白(BSA)的冰冷PBS重悬细胞，加入PE标记大鼠抗小鼠CD11b抗体，冰上孵育1小时。然后加入1ml含1％BSA的PBS，4℃，200g离心5分钟，倒去上清，再加入1ml含1％BSA的PBS，4℃，200g离心5分钟，倒去上清。最后加入300μl含1％BSA的PBS重悬细胞，利用BD FACSCantoTM II流式细胞仪检测骨髓细胞中中性粒细胞CD11b标记的平均荧光强度。
(3)实验结果
通过流式细胞测定，发现化合物G4处理组CD11b平均荧光强度显著低于LPS处理组，如表4所示(*P＜0.05vs LPS)。表明化合物G4能够抑制小鼠中性粒细胞在炎症因子刺激后的活化。
表4：化合物G4体外抑制中性粒细胞活化作用测定
实施例5：化合物G4体内抗炎作用测定
(1)实验材料
动物：Balb/c小鼠购自北京维通利华实验动物有限公司。
试剂：化合物G4由北京中医药大学中药现代研究中心从沉香中提取分离；细菌脂多糖购自北京拜尔迪生物技术有限责任公司(货号：L2880)；测定TNF-α和IL-6的ELISA试剂盒购自武汉博士德生物技术有限公司(货号：EK0527和EK0411)。
仪器：Enspire Multimode Plate Reader购自德国铂金爱尔默公司。
(2)实验方法
将36只8周龄Balb/c小鼠，适应性饲养3天，然后将动物随机平均分为6组，溶媒对照组(Vehicle)、脂多糖组(LPS)、地塞米松组(DEX)、化合物G4低、中、高剂量组。通过灌胃给予化合物G4各剂量组和地塞米松组相应剂量化合物G4和地塞米松，Vehicle和LPS组给予等体积溶媒(含1％羧甲基纤维素钠的5％葡萄糖溶液)。给药后1小时，通过静脉注射给予Vehicle组以外5组动物10mg/kg脂多糖，Vehicle 组给予相应体积生理盐水。1.5h后，通过摘取眼球采集各组动物静脉血，4℃凝固1h后，4℃，800g离心取血清。利用ELISA试剂盒(武汉博士德生物技术有限公司)测定血清中TNF-α和IL-6浓度。
(3)实验结果
通过ELISA测定，发现化合物G4给药组动物血清中TNF-α和IL-6浓度显著低于LPS处理组，如表5所示(*P＜0.05vs LPS)。表明化合物G4具有良好体内抗炎作用。
表5：化合物G4体内抗炎作用测定
实施例6：化合物G4体外抑制CD4+T细胞活化作用测定
(1)实验材料
动物：Balb/c小鼠购自北京维通利华实验动物有限公司。
试剂：化合物G4由北京中医药大学中药现代研究中心从沉香中提取分离；地鼠抗小鼠CD3e抗体(货号：557306)、地鼠抗小鼠CD28抗体(货号：557393)、FITC标记大鼠抗小鼠CD4抗体(货号：553046)、PE标记地鼠抗小鼠CD69抗体(货号：553237)，购自美国BD Biosciences公司。
仪器：FACSCantoTM II流式细胞仪购自美国BD Biosciences公司。
(2)实验方法
取无菌24孔培养板，设置溶媒对照组(Vehicle)、模型组(Model)、地塞米松组(DEX)、化合物G45、10、20μM等剂量组，各组设3个复孔，溶媒对照组各孔加入1ml的PBS，其它各组每孔加入1ml含2μg/ml地鼠抗小鼠CD3e抗体的PBS，4℃孵育过夜。颈椎脱臼处死1只Balb/c小鼠，75％酒精浸泡5分钟，然后超净工作台内无菌取小鼠脾脏，在50ml离心管上，架设40μm孔径尼龙滤网，将脾脏放到滤网上，缓缓加入20ml的PBS，并用5ml注射器芯杆平端研磨脾脏。将过滤的脾脏细胞200g离心5分钟，倒去上清，加入5ml含10胎牛血清的1640RPMI培养基重悬细胞，并对白细胞进行计数。然后吸去24孔板中的PBS，用1640RPMI培养基清洗2次，再将脾细胞接种到24孔板中，保持白细胞浓度1×106个/孔，加入含10胎牛血清的1640RPMI培养基至每孔培养基总体积1ml。再在地塞米松和化合物G4各剂量组孔中加入阳性药地塞米松以及化合物G4，地塞米松终浓度10μM(无细胞毒作用)，化合物G4各剂量组终浓度分别为5、10、20μM，37℃和5％CO2条件下继续孵育。1小时后，CD3e包被孔中加入地鼠抗小鼠CD28抗体，浓度2μg/ml，继续孵育16小时。然后将细胞收集到离心管中，4℃，200g离心5分钟，倒去上清，250μl含1％牛血清白蛋白(BSA)的冰冷PBS重悬细胞，加入FITC标记大鼠抗小鼠CD4抗体和PE标记地鼠抗小鼠CD69抗体，冰上孵育1小时。然后加入1ml含1％BSA的PBS，4℃，200g离心5分钟，倒去上清，再加入1ml含1％BSA的PBS，4℃，200g离心5分钟，倒去上清。最后加入300μl含1％BSA的PBS重悬细胞，利用BD FACSCantoTM II流式细胞仪检测CD4+T细胞活化标志物CD69平均荧光强度。
(3)实验结果
通过流式细胞测定，发现化合物G4各剂量组CD4+细胞CD69平均荧光强度显著低于Model组，如表6所示(*P＜0.05vs Model)。表明化合物G4能够抑制小鼠CD4+T细胞的活化。
表6：化合物G4体外抑制CD4+T细胞活化作用测定
实施例7：化合物G4抗炎作用机制研究
(1)实验材料
细胞株：RAW264.7细胞购自中国医学科学院基础医学研究所细胞中心。
试剂及材料：化合物G4由北京中医药大学中药现代研究中心从沉香中提取分离；DMEM高糖培养基和DMEM/F12培养基均购自康宁公司；细菌脂多糖购自北京拜尔迪生物技术有限责任公司(货号：L2880)；RIPA裂解液(货号：P0013B)、BCA蛋白定量试剂盒(货号：P0010)、SDS-PAGE凝胶配制试剂盒(货号：P0012A)、SDS-PAGE电泳液(货号：P0014B)、Westernblot转膜液(货号：P0021B)、超敏ECL化学发光试剂盒(货号：P0018)、PVDF膜(货号：FFP39)购自碧云天生物技术研究所；NF-κB Pathway Sampler Kit(货号：9936)、MAPK Family Antibody Sampler Kit(货号：9926)和Phospho-MAPK Family Antibody Sampler Kit(货号：9910)购自Cell Signalling Technology公司。
仪器：ImageQuantLAS4000mini超灵敏化学发光成像仪，购自General Electric公司。
(2)实验方法
接种细胞：将处于对数生长期的RAW264.7细胞接种到6孔板中，接种浓度为200000细胞/孔，体积2ml，37℃和5％CO2孵育24小时；药物处理细胞：将6孔板细胞设溶媒对照组(Vehicle)、模型组(Model)、化合物G4各剂量组(5、10、20μM)，化合物G4各剂量组加入化合物G4至终浓度为5、10、20μM，1小时后，加入细菌脂多糖(LPS)至模型组和G4各剂量组至终浓度0.5μg/ml，继续孵育6小时；收集细胞：弃细胞培养基，用冰冷PBS冲洗细胞2次，然后各孔加入2ml冰冷PBS，用细胞刮收集细胞到2ml离心管中，4℃、300g离心5分钟，弃上清；裂解细胞：各管细胞中加入400μl的RIPA裂解液，冰浴裂解30分钟，4℃、10000g离心10分钟，收集上清；蛋白浓度定量：利用BCA蛋白定量试剂盒测定各样品蛋白浓度，并用RIPA裂解液将各样品浓度调到同一浓度；制备蛋白电泳样品：吸取上述蛋白样品各200μl，加入50μl蛋白电泳上样缓冲液(5×)，混匀后99℃金属浴10分钟，然后冷却至室温；蛋白电泳：利用SDS-PAGE凝胶配制试剂盒配制10％聚丙烯酰胺凝胶，然后将上述蛋白样品各上样10μl，90V恒压电泳2小时：蛋白电转：将海绵垫、滤纸、甲醇浸泡过的PVDF膜和完成电泳操作的聚丙烯酰胺凝胶、滤纸、海绵垫按顺序放到电转夹中，再固定到电转槽内，120V恒压冰浴电转1.5小时；封闭：将电转后的膜取出，放入TBS溶液配制的5％脱脂牛奶中封闭1小时；一抗孵育：将封闭后的PVDF膜按目的条带所在位置剪成小条，然后分别加入5％脱脂牛奶配制的兔抗小鼠Actin抗体、p65抗体、phospho-p65抗体、p38抗体、phospho-p38抗体、Erk抗体、phospho-Erk抗体、Jnk抗体、phospho-Jnk抗体(均为1∶1000稀释)，4℃塑封袋中孵育过夜；洗涤：将孵育一抗后的PVDF膜用TBST洗涤3次，每次5分钟；二抗孵育：再将PVDF膜装入塑封袋中，加入TBST配制的辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG，室温孵育2h；洗涤：将孵育二抗后的PVDF膜用TBST洗涤3次，每次5分钟；化学发光成像：将PVDF膜逐条放入ImageQuantLAS4000mini超灵敏化学发光成像仪中，加入超敏ECL化学发光液，拍摄化学发光图片。
浓度。
(3)实验结果
通过上述Westernblot检测，发现化合物G4处理RAW264.7细胞，对LPS活化NF-κB通路的p65没有抑制作用，对MAPK通路的p38和Erk通路活化也没有抑制作用，但是化合物G4中高剂量对Jnk通路活化 具有显著的抑制作用(见附图)，表明抑制Jnk通路活化可能是化合物G4发挥抗炎作用及其它天然免疫抑制和适应性免疫抑制的关键机制。