抗氧化眼药水的制作方法

本发明涉及用于减轻、预防或逆转由氧化应激诱发的眼损伤(干眼症、白内障、视网膜变性等)的局部用组合物，特别涉及一种抗氧化眼药水，其卡波姆凝胶载体中含有四种营养素。

背景技术：

年龄相关性眼部疾病，如白内障、年龄相关性黄斑变性以及干燥性角结膜炎(俗称干眼症)，其患病率随年龄增加而升高。在可逆老年性视力丧失病例中，白内障占大多数，而黄斑变性是不可逆致盲的主要原因。干燥性角结膜炎通常可影响大部分的65岁以上人群，导致严重眼部不适以及视觉功能障碍。干燥性角结膜炎不会导致视力丧失，但如果不对其加以治疗的话，会发展成浅层角膜炎，使患者非常痛苦，可导致角膜溃疡或角膜瘢痕。

年龄相关性疾病在兽医界也是一个日益严重的问题。白内障引起的视力丧失是猫犬致盲的主要原因。并且，许多伴侣宠物在6月龄至10岁以上年龄段可能会患上渐进性视网膜萎缩。并且，这些视网膜变性与遗传有很大关系。犬干眼症的发病率在犬7-9岁时开始升高。与年长雄犬相比，干燥性角结膜炎在年长雌犬身上的发病率更高，并且其在绝育的雄犬及雌犬身上的发病率都很高。与犬类相比，干燥性角结膜炎在猫身上的发病率比较低。

老年性白内障不能通过药物治疗，患者视力仅能通过手术恢复。据估计，通过将白内障的发病及发展推迟10年，白内障手术需求可降低50％。研究发现，白内障手术提高了晚期黄斑变性的发病率，所以研究支持能推迟白内障的非手术治疗需求。目前还没有医疗手段能够预防或减轻地图状萎缩(干性年龄相关性黄斑变性)扩大。

白内障和年龄相关性黄斑变性的发病机制还没有确立。但白内障和年龄相关性黄斑变性都是多因性疾病，其风险因素包括吸烟，与活性氧簇的产生和组织铁含量升高有关。干眼症也是多因性疾病，其与氧化应激有关。并且，抽烟增加了罹患干眼症的风险，而且会加剧干眼症病情。根据实验研究发现，伴随铁含量的升高，氧化损伤增加与白内障和年龄相关性黄斑变性的发病及发展有关。铁产生的活性氧簇通过芬顿反应生成羟自由基，并导致线粒体功能障碍。高铁蛋白血症(一种与铁含量升高有关的铁紊乱)患者也可能罹患白内障。铁代谢及转铁蛋白失调也与年龄相关性黄斑变性的发病机制有关，其标志是在年龄相关性黄斑变性患者视网膜内的视网膜色素上皮细胞及布鲁赫氏膜内发现螯合铁增加。此外，铁过载也与临床上类似于年龄相关黄斑变性的黄斑病变有关，其症状包括多发性视网膜下黄白色病灶的发生及发展，以及无铜蓝蛋白血症患者视网膜色素上皮细胞萎缩。

研究显示，针对与这些年龄相关性疾病相关的氧化途径有益于治疗。含有天然抗氧化剂和/或维生素的大部分剂型(用于眼睛抗氧化以及预防白内障)是口服的。例如，天然抗氧化剂和ω-3必需脂肪酸的混合剂型的临床口服给药显著改善了干眼症的主观症状；口服针对年龄相关性眼病的天然抗氧化剂配方可使晚期年龄相关性黄斑变性的发病风险降低25％。然而，几项口服营养素配方的大型临床研究显示，所有观察到的这些用于预防白内障发病的抗氧化剂的治疗效果均不佳，可能没有临床或公共健康意义。也可通过降低组织铁含量来降低活性氧簇，活性氧簇能通过芬顿反应产生活性羟自由基。利用螯合剂降低铁含量的研究表明，可减少晶状体中的活性氧簇，因为通过药物(如去铁胺)进行螯合治疗的β地中海贫血患者白内障发病率较低。类似地，在大鼠身上进行去铁胺治疗，可减轻烟草烟雾引起的白内障。一个年龄相关性黄斑变性的模型显示，新型多功能抗氧化剂能独立清除自由基和螯合铁，从而推迟白内障形成，并能保护视网膜对抗光损伤。

因此，需要一种能解决上述问题的抗氧化眼药水。

技术实现要素：

该抗氧化眼药水是一种局部眼药配方，其包括四种营养素(即虾青素、白藜芦醇、丙酮酸以及表没食子儿茶素没食子酸酯)，具有抗氧化、抗发炎的功效，并且卡波姆凝胶载体中的乙二胺四乙酸具有螯合能力。这些活性成分可通过其自由基清除活性以及螯合活性减少氧化应激。

该局部眼药水配方由一种混合物组成，其包含虾青素、白藜芦醇、丙酮酸(或丙酮酸乙酯)以及山茶(含表没食子儿茶素没食子酸酯的绿茶提取物)，这些混合物位于一个粘性载体内，该载体由去离子水溶液组成，包含0.4％卡波普980nf、5.7％山梨醇、0.01％溴棕三甲铵、0.01％乙二胺四乙酸以及足量的氯化钠和氢氧化钠，以调节局部载体的粘度和ph，将其ph调节到7.0-7.4。卡波姆载体与市场上出售的optixcare类似，促进了眼表的粘附作用，并适合将醛糖还原酶抑制剂kinostattm运送到糖尿病病犬身上。每种营养成分的重量百分比在0.1％-5％不等。建议剂量为每眼1滴，每天2次。该局部眼药配方能推迟人类或其他动物身上由氧化应激诱发的白内障的发病时间，并减少由氧化应激诱发的视网膜变性。其对视网膜的疗效可通过额外口服胶囊增强，该口服胶囊包含虾青素、白藜芦醇、丙酮酸和表没食子儿茶素没食子酸酯。该局部眼药配方还能预防或减轻干眼症中泪流量降低的症状。

关于本发明的这些特性以及其他特性的详细说明，请查看以下说明书和附图。

附图说明

图1展示了大鼠糖性白内障的发病对比情况，以大鼠患糖尿病后周数的函数来表示，包括对照试样(未经治疗)、使用本发明(optixcareeh)抗氧化眼药水治疗的试样、使用其他两种市售(或快上市的)护眼配方治疗的试样。

图2为对应于图1的糖尿病大鼠的晶状体的显微照片的比较矩阵，其展示了四个试样组的大鼠白内障相对发病情况。

图3展示了谷胱甘肽含量在四组年轻雌鼠中的对比情况，其将一只眼睛暴露在紫外光辐射中，遮蔽对侧的另一只眼睛作为未辐射对照。四组年轻雌鼠包括一组对照试样(未经治疗)、一组使用本发明(optixcareeh)抗氧化眼药水治疗的试样、其他两组使用其他护眼配方治疗的试样。

图4展示了对应图3的四个试样组，4-羟基壬烯醛(4-hne)在晶状体中的含量。

图5a展示了三组大鼠神经视网膜中的4-羟基壬烯醛-组氨酸加合物的含量，三组大鼠在2周的黑暗适应后暴露在光照下，包含一组对照试样(未经治疗)、一组使用本发明(optixcareeh)抗氧化眼药水治疗的试样。

图5b展示了对应图5a的三组大鼠神经视网膜中的硝基酪氨酸加合物含量。

图6a图表展示了对应图5a的三组大鼠神经视网膜中的硫氧还蛋白表达水平。

图6b图表展示了对应图6a的三组大鼠神经视网膜中的硫氧还蛋白还原酶表达水平。

图7图表展示了在五组成年lewis大鼠中每日两次进行皮下东莨菪碱皮下注射诱发的泪流量，这五组大鼠包含一组对照试样(未经治疗)、一组使用本发明(optixcareeh)抗氧化眼药水治疗的试样。

附图中相似的参考字符表示一致对应的特征。

具体实施方式

该抗氧化眼药水(在本申请中也称为optixcareeh)是一种局部眼药配方，由一种混合物组成，其包含虾青素、白藜芦醇、丙酮酸(或丙酮酸乙酯)以及山茶(含egcg(表没食子儿茶素没食子酸酯)的绿茶提取物)，这些混合物位于一个粘性载体内，该载体由去离子水溶液组成，包含0.4％卡波普980nf、5.7％山梨醇、0.01％溴棕三甲铵、0.01％乙二胺四乙酸以及足量的氯化钠和氢氧化钠，以调节局部载体的粘度和ph，将其ph调节到7.0-7.4。该组合物还可包括1％抗坏血酸。抗坏血酸可作为该混合物的抗氧化防腐剂。

虾青素是一种类胡萝卜素，其抗氧化能力比玉米黄质、叶黄素、角黄素和β-胡萝卜素高10倍。虾青素被称为“超级维生素e”，因为其抗氧化能力比α-生育酚(维生素e)高100倍。在极性溶剂中，虾青素以酮-烯醇形态处于平衡状态，具有1个氢原子，能中断自由基反应，方式类似于α-生育酚。虾青素有3种构型异构体，即2对对映体和1种内消旋态的虾青素，其中3s和3’s结构在自然中最为丰富。体外条件下，顺式虾青素，特别是9-顺式虾青素，其抗氧化能力比全反式异构体更强。

据报道，培养的人晶状体上皮细胞可随时间蓄积虾青素、叶黄素、玉米黄质和α-生育酚这些营养素，在保护人晶状体上皮细胞抵御紫外线b辐射引起的氧化应激方面，虾青素、叶黄素、玉米黄质比α-生育酚更有效。据报道，在9周时间内每日3次在棕色挪威大鼠身上局部施用1％虾青素悬浊液，可减缓因暴露在紫外线b中(1200mj/cm2)所诱发白内障的形成。给链脲霉素致糖尿病大鼠食用含有虾青素的饮食，其白内障发病率较低，大西洋鲑幼鱼中的食用虾青素也可减缓白内障形成。各种研究显示，正如叶黄素、玉米黄质有利于治疗年龄相关性黄斑变性，虾青素对视网膜具有保护作用。虾青素能减缓视网膜神经节细胞的减少速度，并对在玻璃体腔内注射n-甲基-d-天冬氨酸引发的内网状层的厚度减少方面有减缓作用。在另一临床研究中，非晚期年龄相关性黄斑变性患者在口服12个月的azyr药片(意大利卡塔尼亚sifi制药公司)后，通过多焦视网膜电流图检测发现，中央视网膜功能障碍减轻了。这种药片成分除了包含4mg虾青素，还包含10mg叶黄素、1mg玉米黄质、180mg维生素c、30mg维生素e、2.5mg锌以及1mg铜。

白藜芦醇是存在于红葡萄酒中的氧化剂，被吹捧为一种抗衰老化合物。其抗氧化能力来源于其中所含的羟基偶联物。据有关文献报道，口服白藜芦醇的生物利用度十分有限，因为肠/肝中葡萄糖醛酸苷和硫酸结合反应使代谢加快，因此白藜芦醇可能达不到有效的靶组织含量。局部施用可避免这种新陈代谢。白藜芦醇在眼内的保护效果较好，据报道，白藜芦醇具有抗氧化、抗凋亡、抗发炎、抗血管生成和舒张血管的功效。根据不同剂量，白藜芦醇可在原代培养的人视网膜色素上皮细胞中降低高达50μm的炎症因子、转化生长因子-β以及低氧诱发血管内皮生长因子的分泌。在培养的人视网膜色素上皮-19细胞中，分别添加50mmol/l和100mmol/l的白藜芦醇，结果表面人视网膜色素上皮-19细胞的体外增殖分别降低了10％和25％，从而保护视网膜色素上皮细胞，避免过氧化氢诱发细胞死亡的情况。白藜芦醇是一种sirt1激活剂，在动物模型中上调sirt1后，显示出其具有重要保护作用，能够抵抗各种眼部疾病(如白内障、视网膜变性、视神经炎以及葡萄膜炎)。在老鼠身上进行白藜芦醇长期治疗，可减缓老鼠的年龄相关性变性和机能减退，包括减缓白内障形成。白藜芦醇还可减轻导致年龄相关性黄斑变性和青光眼的氧化应激。在老鼠身上注射脂多糖来诱发内毒素诱发的葡萄膜炎，在脂多糖注射前口服白藜芦醇，可抑制氧化损伤以及氧化还原敏感的nf-κb活化，从而减轻炎症。在进行实验性视网膜脱离的大鼠身上，白藜芦醇疗法上调了foxo基因家族，并阻止了半胱天冬酶3、8、9的活化。在一个兔角膜培养模型中，白藜芦醇减少了金黄色葡萄球菌，而金黄色葡萄球菌与白介素-8基因表达有关。

组合物中含有的虾青素可使该组合物呈深红色。若想组合物的颜色淡一些，可减少虾青素的用量，增加白藜芦醇的用量。例如，一种溶液或凝胶含有1％丙酮酸、1％表没食子儿茶素没食子酸酯、2％白藜芦醇以及0.01％虾青素，就会呈现出桃红色，用brookfielddv-ii粘度计在每分钟5转的情况下测得的粘度为18000-22000cps。该凝胶呈浅桃红色，并具甜香味。

丙酮酸是一种内源性抗氧化剂，施用时作为一种乙酯前药，能减少在缺血/再灌注损伤和出血性及内毒素休克中对器官系统的损伤。丙酮酸对细胞因子表达和促炎基因调控具有直接疗效。据文献中报道的体外晶状体和糖尿病大鼠研究中，丙酮酸降低了晶状体山梨醇含量、脂质过氧化反应，并促进丙酮酸还原成乳酸，从而延迟了糖性白内障的形成。在30％的半乳糖喂养的大鼠中也可以延缓糖性白内障。。局部施用的丙酮酸钠及丙酮酸乙酯可渗透角膜。丙酮酸还具有自由基清除能力，经腹腔注射后可减轻大鼠硒性白内障。

(-)表没食子儿茶素没食子酸酯(egcg)，富含在绿茶中，其抗氧化能力比维生素e高10倍。据文献报道，其可螯合具有氧化还原性的铁和铜，局部施用时能到达晶状体。表没食子儿茶素没食子酸酯可在培养的人晶状体上皮细胞中降低因紫外线b辐射和过氧化氢产生的活性氧簇。它还能保护人视网膜色素上皮细胞抵御紫外线a诱发损伤，保护视网膜光感受器抵御硝普钠诱发氧化应激。在培养的角膜上皮细胞中，表没食子儿茶素没食子酸酯展现出抗发炎、抗氧化的功效。局部施用表没食子儿茶素没食子酸酯能有效抑制兔角膜新生血管化。该抑制效果可能与血管内皮生长因子和环氧合酶-2介导的血管生成受到抑制有关。局部施用表没食子儿茶素没食子酸酯治疗老鼠，可抑制炎症因子表达以及角膜内cd11b+细胞浸润，从而减少干燥性角结膜炎的临床症状及炎性病变。

已确定糖尿病大鼠可因山梨醇细胞内蓄积引发的渗透应激快速发展为糖尿病的“糖性白内障”，山梨醇的形成受到了醛糖还原酶的催化。蓄积的山梨醇引发了渗透应激，从而诱发了内质网应激，内质网应激随后引发了未折叠蛋白反应，导致形成活性氧簇。通过使用醛糖还原酶抑制剂适当抑制醛糖还原酶，可防止形成山梨醇，从而防止了糖尿病性白内障的形成。相比之下，通过内质网应激减少活性氧簇，仅推迟了白内障的形成。

通过进行几个实验来确定上述成分的有效性。

实施例1

制备1kg含4％(重量百分比)活性成分的配方

在室温下将750g去离子水加入适当大小的不锈钢或玻璃容器中，然后再加入0.1g溴棕三甲铵，使溶液最终浓度为0.01％，搅拌该混合物至溶解。然后加入0.1g乙二胺四乙酸，搅拌至溶解，使最终浓度为0.01％，加入57g的70％美国药典标准的山梨醇，使溶液最终浓度为5.7％，搅拌该混合物至溶解，然后加入40g白藜芦醇，使最终浓度为4.0％，待溶液混合均匀后，加入8g卡波普980，使最终浓度为0.80％，搅拌该混合物至完全水化，然后加入40g丙酮酸乙酯和40g茶树提取物(没食子儿茶素没食子酸酯)，分别使最终浓度为4.0％，搅拌该溶液5-10分钟，再加入40g虾青素，使最终浓度为4％，待虾青素搅拌分散后，通过5n氢氧化钠溶液将ph值调节到7.0-7.4，再加入适量去离子水，使最终加入的水达到774.8g(去离子水和氢氧化物溶液)。使用该浓度的溶液进行实验研究。

实施例2

糖尿病诱发白内障

在这项研究中，在幼龄(体重约100g)斯普拉格-杜勒大鼠的尾部静脉注射75mg/kg的链脲霉素，以诱发糖尿病，如randazzo等人在《公共科学图书馆期刊》(plosone,2011,6(4),p.e18980)中的描述。将所有血糖水平大于300mg/dl的大鼠平均分成4组，每组6只。第一组作为未治疗对照，第二组施用醛糖还原酶抑制剂kinostattm，每眼1滴，每日2次。第三组施用本发明抗氧化眼药水组合物(也称为optixcareeh，其制备如上所述)，每眼1滴，每日2次。第四组每日1次口服1ml的吐温80ocu-glotm溶液，其制备方法是：将ocu-glotm(animalhealthquest公司，美国华盛顿贝林哈姆)胶囊中的内容物溶解于适量吐温80中，以便根据动物重量，按照厂商对营养素配方的建议剂量施用1ml的吐温混合物。每眼使用1％托品酰胺滴眼液进行散瞳，然后用手持裂隙灯进行晶状体病变检测，每周1次。通过手持裂隙灯评估晶状体病变，分0-3级，0级表示无晶状体病变；0.5级表示裂缝加重；1级表示细胞空泡化；2级表示皮质混浊；3级表示成熟白内障。该研究在诱发糖尿病后8周结束，采用后路法从每只摘除眼睛中小心取下晶状体，并进行拍照存档。在研究开始时通过使用商用血糖仪(therasense公司的freestyle血糖仪，美国加利福尼亚州阿拉米达市)测定血糖水平。糖化血红蛋白水平用于估量研究中所有大鼠的总体高血糖状况，在研究结束后使用拜耳公司的metrikaa1cnowplus系统试剂盒(美国加利福尼亚州圣地亚哥市)来确定糖化血红蛋白水平。根据测得的结果(糖化血红蛋白，均值±，使用扫描电镜观察，未治疗对照组为10.7±0.7；kinostattm组为11.48±0.2；optixcareeh组为10.6±0.7；ocu-glotm组为10.4±0.76)，可确定所有组的大鼠都患有相同程度的糖尿病。

如图1所示，所有幼龄糖尿病大鼠在8周内很快患上白内障，通过局部施用醛糖还原酶抑制剂kinostattm，防止了白内障形成。通过局部施用营养素optixcareeh，推迟这些糖尿病大鼠白内障的发病及发展，并且optixcareeh的推迟效果比口服ocu-glotm更好。在研究结束时，通过对解剖的晶状体进行显微镜检查来确定这些裂隙灯观察结果，如图2所示。在使用醛糖还原酶抑制剂治疗的大鼠中未见明显晶状体混浊，在未治疗对照组和口服ocu-glotm组中均发现不同程度(皮质白内障到成熟白内障)的晶状体病变(如图2所示)。相比之下，裂缝加重是糖性白内障的主要初期症状，在使用optixcareeh治疗的糖尿病大鼠中就发现了这一症状。

实施例3

紫外线诱发白内障

暴露于紫外线辐射是白内障发病机制的另一主要风险因素。紫外线辐射产生活性氧簇，其使晶状中体谷胱甘肽(晶状体中的主要抗氧化剂)快速减少，随后几周发生晶状体混浊。在该研究中，将幼龄雌性斯普拉格-杜勒大鼠平均分为五组。第一组作为未受辐射的对照组，第二组作为未经治疗的受辐射对照组。第三组局部施用含有3％的jhx-4(4-(5-羟基嘧啶盐酸盐-2-基)-n、n-二甲基-3、5-二酮哌嗪-1-磺酰胺(采用高效液相色谱法测定纯度为99％)的optixcare卡波姆载体，第四组施用本发明抗氧化眼药水组合物(也称为optixcareeh，其制备如上所述)，第五组口服1ml的ocu-glotm灌胃，如上所述。治疗在受辐射前3天开始进行，并持续进行直至实验结束。受辐射之前，对每只大鼠使用60mg/kg氯胺酮和10mg/kg甲苯噻嗪的混合物进行腹腔注射使其麻醉，用1％托品酰胺滴眼液对右眼进行散瞳。对侧眼睛用眼罩遮住，用黑胶布将眼罩固定好。每只大鼠单眼侧面接受15分钟1600μw/cm2紫外线辐射(280-360nm,uvmax306nm)，遮住的对侧眼睛不受紫外线辐射。辐射后两天，采用二氧化碳窒息法对每只大鼠进行安乐死。摘除双眼，采用后路法将晶状体小心取出。使用冰冷的裂解缓冲液(ph7.5)对每个晶状体进行均质化，在4℃条件进行离心，去除不溶蛋白。根据bradford法测量一小份上层清液种的蛋白含量。对另一小份上层清液使用等容量的20％三氯乙酸去除蛋白，按照dtnb法测得去除蛋白上层清液中谷胱甘肽含量为412nm。

将所有受到紫外线辐射的眼睛晶状体谷胱甘肽含量(显著减低，p<0.05)与对侧未受辐射晶状体的谷胱甘肽含量做对比，如图3所示。受同样辐射程度的大鼠，在辐射前3天局部施用3％jhx-4(每日2次)、optixcareeh(每日2次)或口服ocu-glo^tm灌胃(每日1次)进行预治疗，结果只在使用ocu-glo^tm治疗的大鼠中发现谷胱甘肽含量显著减低。局部施用optixcareeh或3％jhx-4的大鼠中，其受辐射晶状体中的谷胱甘肽含量没有明显降低(图3)。为了确认紫外线辐射后谷胱甘肽含量降低与活化氧簇含量增加有关，对余下的匀浆上清液采用竞争性elisa法，根据厂商指示，使用oxiselecthne加合物竞争性elisa测定试剂盒(cellbiolabs有限公司，美国加利福尼亚州圣地亚哥市)来确定晶状体中氧化膜脂质4-羟基壬烯醛(4-hne)的含量。如图4所示，紫外线辐射致使4-hne含量增加，使用抗氧化剂治疗后4-hne含量降低，降低程度按顺序为：局部施用jhx-4>局部施用optixcareeh>口服ocu-glo^tm。与受紫外线辐射且未经治疗大鼠的晶状体内4-hne含量相比，受紫外线辐射但使用jhx-4(p<0.01)和optixcareeh(p<0.05)进行治疗的大鼠的晶状体内4-hne含量显著降低。受辐射但使用ocu-glo^tm治疗的大鼠的晶状体内4-hne含量与受辐射且未经治疗大鼠的晶状体内4-hne含量没有明显不同。只在使用jhx-4治疗的大鼠中，受紫外线辐射的晶状体内4-hne含量与未受辐射的对侧眼睛晶状体内4-hne含量统计相似。

实施例4

光诱发视网膜变性

已适应黑暗大鼠的神经视网膜中，光辐射也能导致活化氧簇的形成、铁失调以及铁蛋白铁释放。在年龄相关性黄斑变性的动物模型中，在开始对威斯塔大鼠进行两周黑暗适应时进行治疗，口服含有0.05％多功能抗氧化剂jhx-4，或局部每日2次施用optixcareeh。

如randazzo等人在《公共科学图书馆期刊》(plosone,2011,6(7),p.e21926)中的描述，所有组一共包括12只4-5周大的雄性威斯塔大鼠，第一组喂食正常鼠粮(未治疗)，第二组喂食正常鼠粮并局部每日2次施用optixcareeh，第三组经口喂食含0.05％多功能抗氧化剂jhx-4的食物，并进行为期两周的黑暗适应。然后将每组大鼠单独放入亚克力材质平底的啮齿动物束缚盒(plas-labs有限公司，美国密歇根州兰辛市)中，再放入灯箱中受1000lx冷白荧光灯(lightsofamerica公司，美国加利福尼亚州洛杉矶市)辐射三小时。另外一组未治疗大鼠也放入灯箱中三小时，但不暴露在光线下(无光损伤大鼠)。受光辐射后立即对8只光损伤大鼠和8只无光损伤大鼠实施安乐死，小心地将其神经视网膜从摘除眼睛中剥离，并用干冰冷冻以备随后分析。随后，将解冻的视网膜在裂解缓冲液中均质化，使用4-hne-his加合物和硝基酪氨酸elisa试剂盒进行elisa测定。将另外一部分解冻的视网膜在总蛋白提取细胞裂解缓冲液中均质化，总蛋白提取细胞裂解缓冲液中含有halt蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物，用于对硫氧还蛋白(trx)和硫氧还蛋白还原酶(trxr)的表达水平进行蛋白质印迹分析。蛋白质样品通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离，并转移到硝酸纤维膜上。用含有5％乳粉的0.1％tbs-t封闭该硝酸纤维膜后，在4℃条件下使用一级抗体硫氧还蛋白抗体(稀释比例1:1000)或硫氧还蛋白还原酶抗体(稀释比例1:2000)将该硝酸纤维膜孵育过夜。随后使用tbs-t冲洗该硝酸纤维膜，然后使用辣根过氧化物酶-二级抗体将硝酸纤维膜孵育1小时。通过化学发光和曝光于x射线胶片的方法，可见蛋白条带。最后，使用磷酸甘油醛脱氢酶抗体探针探测该硝酸纤维膜，作为质控物。所有可见蛋白质含量可使用nihimagej程序(可在网站rsbweb.nih.gov/ij/在线使用)来定量。

总而言之，局部眼部施药不会显著提高视网膜中的药物含量。因此，对已适应黑暗并受过光辐射的大鼠而言，与口服多功能抗氧化剂jhx-4相比，预计局部施用optixcareeh对视网膜氧化应激不会产生显著防御作用。但出乎意料地的是，局部施用optixcareeh可见有利的视网膜抗氧化效果。据randazzo等人在《公共科学图书馆期刊》(plosone,2011,6(7),p.e21926)中报道，将神经视网膜暴露于1000lx光辐射下3小时，导致氧化应激标记物增加，该氧化标记物包含4-羟基壬烯醛加合物(如图5a)和改性硝基酪氨酸蛋白(如图5b)，其中4-羟基壬烯醛加合物由组氨酸构成，组氨酸由多不饱和脂肪酸的非酶促氧化生成；改性硝基酪氨酸蛋白由过氧硝酸盐氧化酪氨酸残基生成，过氧硝酸盐由氧化氮与超氧阴离子的反应生成。进行光辐射后，这两种标记物含量均显著增加，而在相似受光辐射并使用jhx-4治疗的大鼠中，氧化标记物含量都没有显著增加(图6a、6b)。对使用optixcareeh治疗的大鼠进行测量显示这两种氧化标记物含量均有不同程度的增加。但增加程度比那些未治疗大鼠要低很多。因将视网膜暴露于强光下产生的活性氧簇和自由基也可通过硫氧还蛋白/硫氧还蛋白还原酶防御体系得到缓解。因此，也检查了这些大鼠神经视网膜中硫氧还蛋白/硫氧还蛋白还原酶的表达水平。如图6a、6b所示，在受光辐射且未治疗大鼠中，硫氧还蛋白/硫氧还蛋白还原酶的表达都有所增加。在受光辐射但使用jhx-4或optixcareeh治疗的大鼠的神经视网膜中，硫氧还蛋白还原酶的表达显著降低(p<0.05)。但只有使用jhx-4治疗的大鼠中硫氧还蛋白的表达才有所降低。

通过对光感受器细胞层进行组织学测量，确认了jhx-4和optixcareeh可减少氧化应激。在如上所述的光辐射之后，在每组中选择几只大鼠，将其放回黑暗环境中停留7天。采用二氧化碳窒息法对每只大鼠进行安乐死，然后在背腹侧每只眼睛上用烧灼工具做标记。然后摘除眼睛，以体积比为3:1的甲醇固定；在乙酸溶液中放置一夜，然后采用标准组织学方法进行处理。然后使用zeissaxioplan显微镜(carlzeissmicroimaging有限公司，美国纽约州索恩伍德市)和axiovision软件获得he染色区域的数字图像。使用image-proplus软件(mediacybernetics公司，美国马里兰州银泉市)测得外核层厚度(从视神经乳头开始到上下锯状缘之间的间隔)为400μm。结果显示，强光辐射致使外核层光感受器变薄，上半球损伤比下半球更明显。使用jhx-4治疗的大鼠，上下半球的光感受器细胞层都只是稍微变薄。相比之下，使用optixcareeh治疗的大鼠，光感受器细胞层仅受到局部保护。这些结果说明，虽然是局部施药，但optixcareeh可局部降低受光损伤大鼠视网膜中的氧化应激。

实施例5

东莨菪碱诱发干眼症

optixcare是一种以卡波姆为载体的市售兽医用润眼剂，在麻醉过程中防止眼睛脱水，还可作为干眼症的辅助疗法。optixcare属于一类眼部安慰剂，成分包含聚(丙烯酸)聚合物，聚(丙烯酸)聚合物可通过提高泪膜特性来缓解眼部不适，使泪液量稳定留存，同时使眼表保持润滑。这种类型的安慰剂还包含具有锁水作用的透明质酸。optixcare、optixcareh(含透明质酸的optixcare)以及含有透明质酸的idropvetplus滴眼液(局部用透明质酸，imed制药公司，加拿大多拉尔-德索莫)都被用于兽医市场，减轻干眼症的临床症状。因为optixcareeh的成分不仅抗氧化而且具有抗发炎的疗效，所以对于optixcareeh实际治疗干眼症的潜在疗效进行了研究。在30只体重为180-200g的雌性lewis大鼠(分为5组)中进行了干眼症诱发。一组作为未治疗对照，其他各组分别施用optixcare、optixcareh、idropvetplus滴眼液或本发明抗氧化眼药水组合物(optixcareeh)，每眼1滴，每日2次。对全部大鼠皮下注射0.1ml含24mg东莨菪碱的水溶液(每日2次，每天总剂量为48mg)，进行干眼症诱发。在用异氟烷麻醉所有大鼠并施用zone-quick^tm苯酚红线(fciopthalmics公司，美国马萨诸塞州彭布罗克)之前测量泪流量，每周进行一次。拉下下眼睑，使用镊子将每根线折起的3mm端部放入睑结膜内距离外眦约1/3处。将线留在睁开的眼睛中15秒钟，然后取出，取出时轻轻拉下下眼睑，朝上取出线。然后，立即测量线染红部分的长度。如图7所示，所有大鼠的泪流量为双眼均值，未治疗大鼠的泪流量随时间增加而降低，而局部施用任何一种安慰剂(optixcare、optixcareh或i-drop透明质酸)也没有改变泪流量的降低趋势。相比之下，同样注射东莨菪碱但施用了本发明optixcareeh组合物的大鼠，其泪流量得到维持。这表明，营养素抗氧化剂的加入提高了optixcare(作为一种干眼症辅助疗法)的疗效。

该组合物可置于低密度聚乙烯管和/或从低密度聚乙烯管中分出，例如15g，白色低密度聚乙烯管。该低密度聚乙烯管可具有五层，包括乙烯-乙烯醇共聚物屏障，其夹在每两层聚乙烯的之间的粘合剂中。例如，该低密度聚乙烯管可包括具有直径为0.047的“孔口的分液器吸头以及直径为7/8的平滑螺纹封闭件。

需要了解的是，本发明不限于以上所述实施例，还包括以下权利要求范围内的任何实施例。。