海洋深层水萃取物及其用途的制作方法

本发明提供一种海洋深层水萃取物，特别是一种具有有机成分的海洋深层水萃取物及其用途。

背景技术：

最近10年，含有质子泵抑制剂(PPI)及抗生素的三合一疗法被视为清除幽门螺旋杆菌感染首选。然而，服药顺从性不足和抗药性菌株的增加常导致除菌的失败。初步治疗失败后，被推荐的二线疗法包括抗生素的三合一疗法及四合一疗法，但是这些疗法仍然无法克服因抗药性菌株增加而造成的困扰。因此找出能有效预防和治疗幽门螺旋杆菌感染的新成分或混合物，就有迫切的需要。

目前已知饮水中镁不足会增加心血管病变的机会，而饮水中含高钙与镁离子则可提升对心肌梗塞的保护效应。高镁摄取会改善高血脂、降低代谢症候群与氧化压力的发生率。海洋深层水(Deep-sea water，DSW)得自低于海平面200公尺以下是富含高镁、高钙与高钾离子与高营养成分或高有机成分的低温、干净卫生的无污染水。近年，DSW已被广泛应用于食品加工业、农业、药用与化妆品业。研究文献也指出DSW具有降低血脂肪与脂质氧化、血管硬化、高血压与减少血管管壁增生。在异位性皮肤炎也发现饮用或浸泡DSW也会改善皮肤发炎与过敏症状，同时DSW饮用也改善白内障。

氧化压力(oxidative stress)与发炎对幽门螺旋杆菌感染和肠胃溃疡有关，饮用高镁离子可改善幽门螺旋杆菌感染、胃溃疡与胃食道逆流等症状。而饮用海洋深层水对幽门螺旋杆菌感染患者的抗菌效用幽门螺旋杆菌与胃炎、十二指肠溃疡、胃溃疡、胃腺癌，以及其他胃部癌症如胃的「粘膜相关淋巴组织淋巴瘤」(MALToma)有强烈相关性。有限的数据或文献显示在体外试验时DSW可能藉由内含高浓度的一些离子以抑制幽门螺旋杆菌的作用。有报告指出在人体血清中的镁浓度和胃幽门螺旋杆菌聚集于胃部有关联。

技术实现要素：

基于上述，本发明进行抗胃幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori)的临床试验中发现饮用海洋深层水两周对幽门螺旋杆菌感染患者的抗菌有效成分，非经由本发明技术领域中习知认为高钙、高镁离子及硬水所引起，而是海洋深层水中的有机成分。

有鉴于此，本发明的一目的在于提供一种海洋深层水萃取物，其是将海洋深层水由一方法而制得，该方法是逆渗透(reverse osmosis，RO)与电透析(Electrodialysis，ED)的方法或是纳米过滤(nanofilter)的方法；其中该海洋深层水萃取物具有一有机成分，该有机成分选自于由685至690、733至738、以及1070至1075的分子量所组成的群组。

在本发明一实施例中，其中该方法进一步选自于由凝胶层析(gel filtration)方法、二氯甲烷(Dichloromethane，DCM)萃取方法、丙酮萃取方法、以及三氯甲烷萃取方法所组成的群组。

在本发明一实施例中，其中该海洋深层水萃取物的分子量较佳为1070至1075。

在本发明一实施例中，其中该海洋深层水是为低于海平面200公尺以下的海水。

在本发明一实施例中，其中该海洋深层水萃取物进一步包含一抗氧化物以延缓该有机成分的降解，且该抗氧化物是槲皮素(quercetin)、绿茶素(EGCG)或是氢气。

在本发明一实施例中，其中该海洋深层水萃取物具有2400ppm至4800ppm的硬度。

在本发明一实施例中，其中该海洋深层水萃取物是经由巴氏杀菌或滤菌方式而获得。

本发明的另一目的在于提供一种上述海洋深层水萃取物用于制备抑制胃幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori)生长的药物的用途。

在本发明一实施例中，其中该海洋深层水萃取物具有2400ppm至4800ppm的硬度。

在本发明一实施例中，其中该海洋深层水萃取物进一步包含一抗氧化物以 延缓该有机成分的降解；且该抗氧化物是为氢气、槲皮素(quercetin)或绿茶素(EGCG)。

以下将配合图式进一步说明本发明的实施方式，下述所列举的实施例是用以阐明本发明，并非用以限定本发明的范围，任何熟习此技艺者，在不脱离本发明的精神和范围内，当可做些许更动与润饰，因此本发明的保护范围当视后附的申请专利范围所界定者为准。

附图说明

图1是本发明的2400ppm硬度海洋深层水萃取物(DSW2400)电喷洒/质谱法(ESI/MS)分析的质谱图；(A)以竹签电喷洒/质谱法(ESI/MS)分析RO逆渗透水做为比较例；(B)以竹签质谱仪分析本发明DSW2400；(C)以滤纸电喷洒/质谱法分析本发明DSW2400；(D)以竹签质谱仪分析本发明DSW2400；

图2是为电喷洒/质谱法(ESI/MS)分析以DCM、丙酮、三氯甲烷三种有机溶液萃取本发明DSW2400的质谱图；

图3是电喷洒/质谱法(ESI/MS)分析不同海水区域与不同处理的海洋深层水或海洋表面水的质谱图；CS1-HB是商品台肥海矿1400深层海水、CS2-DM是Deep Mine深层海水、DSW2400是本发明DSW2400、SSW-50是海洋表面水、CS3-TY是商品台盐海洋碱性离子水、CS4-T1是商品统一PH 9.0碱性离子水、CS5-LB是商品Light碱性水以及会出现338.5的波形的背景值；

图4是拉曼光谱仪测量电透析的本发明的海洋深层水萃取物2400ppm(DSW2400)；上图为未加热，下图为经灭菌锅加热；

图5是电喷洒/质谱法(ESI/MS)分析不同处理的本发明的海洋深层水萃取物2400ppm(DSW2400)；(A)50ml以RO逆渗透处理后淡化的RO逆渗透水；(B)未经任何处理50ml本发明DSW2400；(C)50ml本发明DSW2400连同离心管在灭菌锅内经121℃15分钟的加热灭菌处理；(D)50ml本发明DSW2400加入HCl至pH值为5，进行电透析的样品；(E)50ml本发明DSW2400加入HCl至pH值为4，进行电透析的样品；(F)50ml本发明DSW2400加入HCl至pH值为3，进行电透析的样品；(G)刚接触空气的50ml本发明DSW2400；(H)接触空气三天的50ml本发明DSW2400，进行电透析 的样品；(I)通入氢气的50ml本发明DSW2400，进行电透析的样品；(G)经过0.22μm滤纸过滤的50ml本发明DSW2400，进行电透析的样品；

图6是电喷洒/质谱法(ESI/MS)分析量测第一天(Day 1)不同处理的本发明的海洋深层水萃取物1070波形组的强度；

图7是电喷洒/质谱法(ESI/MS)分析量测第二天(Day 2)不同处理的本发明的海洋深层水萃取物1070波形组的强度；

图8是电喷洒/质谱法(ESI/MS)分析量测第九天(Day 9)不同处理的本发明的海洋深层水萃取物1070波形组的强度；

图9是电喷洒/质谱法(ESI/MS)分析量测第一天(Day 1)、第二天(Day 2)及第九天(Day 9)不同处理的本发明的海洋深层水萃取物1070波形组的强度是树形图。此数值为三重复数据；*P<0.05与第一天的个别控制组比较；#P<0.05与第九天的本发明的海洋深层水萃取物无处理组(Air 2)比较；

图10是以维他命C作为抗氧化剂会破坏本发明的海洋深层水萃取物的成分；

图11A及B是本发明的海洋深层水萃取物具有抑制胃幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori)生长的数据图；

图12是含有不同成分1070波形组含量的海洋深层水萃取物对抑制胃幽门螺旋杆菌的抑制效果的关系图。1070波形组含量越高的海洋深层水萃取物与抑制胃幽门螺旋杆菌能力成正相关；A为RO逆渗透样品；B为表面海水SSW(50公尺海平面下的海水)样品；C为经过灭菌锅处理后的DSW2400样品；D为在pH 3.93的条件下的DSW2400样品；E为经过0.22m过滤的DSW2400样品；F为经过ED处理的DSW2400样品；H为样品A至F对抑制胃幽门螺旋杆菌的抑制效果的关系图；G为样品A至F的1070波形组含量的平均强度量化数值；

图13是本发明的海洋深层水萃取物可明显降低胃幽门螺旋杆菌感染所放出的碳十三尿素呼吸数值的曲线图；DSW是本发明的海洋深层水萃取物，CMW是一般矿泉水。

具体实施方式

本发明提供一种主要目的是确认海洋深层水萃取物的抑菌或其他功效的活性成分，以及该海洋深层水萃取物用于制备抑制胃幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori)生长的药物的用途，经由取得低于海平面200公尺以下的本发明的海洋深层水进行有机成分分析确定可能分子并鉴定其特性，并藉由拉曼光谱确认该有机成分的活性。本发明海洋深层水萃取物证实具有抑制胃幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori)生长的活性成分并非是与其高钙、高镁浓度或高硬度有关。

实施例1本发明的海洋深层水(Deep sea water，DSW)萃取物的制造方法

本发明的海洋深层水水源取自中国台湾花莲县七星潭(Chisingtan)湾200米以下深度的水源，海洋深层水由石头和资源行业研究与发展中心(Guanghuajian，花莲，中国台湾)获准后取得。海洋深层水的改良与制备是由石材和资源行业研究与发展中心(Guanghuajian，花莲，中国台湾)所提供。海洋深层水水源会先经逆渗透(reverse osmosis，RO)的处理和电透析(Electrodialysis，ED)为了减少海洋深层水的硬度，以每ppm的硬度表示，以下列公式计算：

[CaCO₃]ppm＝([Ca²⁺]×2.5+[Mg²⁺]×4.1)ppm。

经逆渗透(RO)和电透析(ED)后得到了不同硬度的海洋深层水。如1200至4800ppm的硬度。海洋深层水以巴氏杀菌在60秒80℃或以滤菌方式后立即存储在室温(25℃)，即为本发明的海洋深层水萃取物。

本发明利用电感耦合的等离子体发射光谱仪(JY ULTIMA2000，堀场，法国)，分析本发明1200ppm硬度海洋深层水萃取物(DSW1200)、本发明2400ppm硬度海洋深层水萃取物(DSW2400)以及2.1ppm RO水的矿物质含量，并另分析该些样品的pH值，如表一所示。另外，本发明亦取得海洋深层水200公尺以下所制备的RO逆渗透水、海洋深层水、海平面下50公尺的海洋表面水(surface water，SSW)，以及从市面上所购买的其他海洋深层水或是表面水的相关产品做为比较。所用的化学药品如绿茶素(EGCG)和槲皮素(quercetin)等均采购自Sigma-Aldrich公司。

表一、本发明的海洋深层水萃取物及RO逆渗透水的pH及矿物质含量分析

实施例2电喷洒/质谱法(ESI/MS)

本发明是利用改良式竹签当作电喷洒游离法(ESI)，将3μl样品滴加竹签尖端同时利用甲醇当作挥发性溶剂(Harvard Apparatus Model 22)，流速6μl/min，并施加+3000v高电压(Gamma,FL,USA Model RR30-2R)，使样品离子化进到质谱仪(Thermo Finnigan LCQ LC/MS)进行分析，侦测范围是150-2000m/z，并使用抽气回转泵(EDWARDS EM30)来维持质谱仪内的真空状态，每次样品测试完毕后把竹签使用超音波洗净器(BRANSON 3510)震荡30分钟。利用电喷洒离子化/质谱法主要用来测量主成分物质的分子量。

电喷洒游离法中主要包含雾化(nebulization)、去溶剂(desovation)以及游离(ionization)三部分。

2.1雾化(nebulization)：形成带电液滴

当样品通过未施加高电压的金属毛细管出口端时，由于缺乏电场的作用，只会形成正负离子分布均匀的液滴。但当样品流经外加高电压的金属毛细管时，毛细管出口端会产生强大的电场作用，使得溶液中的正负离子受到电场作用而产生电荷分离的现象。若施加的为正电压，则正离子会因为电场排斥的作用力 往毛细管出口端移动，负离子会受正电场吸引而聚集在金属毛细管壁，当溶液大量聚集出口端时，会在液滴表面累积大量正电荷。当正电荷累积到一定的数量，此时所产生的排斥力与电场作用力会将正电荷的液体表面往低电场方向拉长，在毛细管出口端形成一锥状液滴，称之为泰勒锥(Taylor cone)。此时向外的库伦排斥力和向内的表面张力呈现平衡状态，称为雷利极限(Rayleigh limit)。当外加电场逐渐增强时，累积在溶液表面的正电荷排斥力大于表面张力，液滴的作用力就会突破雷利极限，由泰勒锥前端喷洒出表面带有电荷的微小液滴，此即为电喷洒游离法中带电液滴形成的过程。

2.1去溶剂(desovation)：电喷洒液滴的挥发与分裂

从金属毛细管出口端喷洒出来的带正电荷液滴，因会受到质谱入口较低电场的吸引而进入质谱仪。在飞行过程中，带电液滴不断接触大量的空气，使得液滴中的溶剂分子快速挥发，造成液滴体积持续缩小，但液滴内电荷是固定的，因此液滴内电荷密度会逐渐增加，当体积缩小到一定程度时，电荷间的排斥力会大于液滴的表面张力，为了平衡内部的作用力，此时液滴会产生分裂现象，而分裂的程度会因液滴的半径大小、溶剂的表面张力和液滴内所带的电荷数而有所不同。相同的过程会在电喷洒端与质谱仪间不断重复，带电液滴经过多次分裂，体积不断减少，最终便能去除溶剂。为了提高去除溶剂的效率，通常会在分析物溶液中添加挥发性较高的有机溶剂，降低溶液的表面张力以利电喷洒时的溶剂的挥发。也会利用雾化气流来增加电喷洒的效率，或是在质谱仪入口端往电喷洒端施予一辅助气流来帮助溶剂挥发。

2.3游离(ionization)：形成气相离子

目前为止并无法定论将带电液滴形成气相离子的机制，但是目前较为被科学家接受的理论主要有两个，一个是在1968年由M.Dole所提出电荷残留理论；另一个是在1976年由B.A.Thomson所提出的离子挥发理论。电荷残留理论讨论到当带电液滴的溶剂经过不断的挥发和多次分裂后，溶剂会完全挥发，使液滴无法再一次分裂，而原本液滴上的电荷会残留在分析物分子上，使分析物形成带多电荷的气相离子。离子挥发理论则认为气相离子不一定是溶剂挥发后才能形成，而是当带电液滴的溶剂挥发到最后，液滴直径缩小至10至20nm，造成液滴内部电荷不稳定，为了降低内部过大的向外排斥力，带电的液滴就会 突破液滴表面形成带多电荷的气态离子。1993年Fenn将离子挥发理论改良并发表，用来解释大分子会带多电荷的现象，他认为液滴一开始就带有多电荷，而这些液滴中同时包含异性电荷的离子。由于大分子在液滴中行布朗运动而移动到液滴的表面取代部分液滴表面的电荷，再藉由热能驱动使大分子的部分带电区域突破液滴表面，使分子与液滴脱离而形成多价电荷的气相离子。

实施例3拉曼散射光谱

本发明利用拉曼光谱法主要用来测量主成分物质的分子振动谱峰，作为分析物的光谱指纹辨识之用。

拉曼光谱的产生机制为牵涉入射光和样品分子交互作用后，当分子上的原子受到入射光的扰动时，其入射光的电场会和分子的电子云产生交互作用，因而产生辐射散射(electromagnetic radiation)，而此交互作用所引起电子的周期性振动，会伴随产生震荡电极矩(electric moment)，其振荡的电子即为散射光的来源。散射过程中，入射光和样品分子牵扯到能量转移，所产生的散射光频率和光源入射光频率不相等，故拉曼散射(Raman scattering)即是非弹性碰撞，其中拉曼散射又可分为两种，当散射光频率相对于入射光增加时，称为反史托克散射(anti-Stokes Raman scattering)；而当散射光频率相对于入射光减少时，称为史托克散射(Stokes Raman scattering)。而生活中常看到的散射是雷利散射，因为不牵涉光波长的改变，所以属于弹性散射。相对于雷利散射，拉曼强度通常仅是其百万分一左右，因此在日常生活中要观察到拉曼散射现象并不容易。从量子力学角度来看，拉曼散射光频率之所以和入射光不同，主要是因为电子所占据的能阶改变所致，及散射光频率改变可对应分子振动能阶。

实施例4本发明的海洋深层水萃取物活性成分分析

本发明的2400ppm硬度海洋深层水萃取物(DSW2400)以电喷洒/质谱法(ESI/MS)包括竹签电喷洒离子化、滤纸电喷洒离子化方法和拉曼光谱分析海洋深层水萃取物可能有某些特殊成分的分析。

电喷洒/质谱法(ESI/MS)的结果如图1所示，以竹签质谱仪发现在本发明DSW2400有三种主要687(685-690)、733(733-738)、1070(1070-1075)波形组分子量的强度(B)；687、733、1070波形组分子量在快速图的表现(D)。或是利用滤纸电喷洒/质谱法(ESI/MS)亦可发现733和1070波形组分子量(C)；而RO 水样品在竹签电喷洒/质谱法(ESI/MS)无法发现有此波形(A)。

为确定本发明的海洋深层水萃取物成分的溶解性有机质(DOM)为有机成分，本发明分别以二氯甲烷(Dichloromethane，DCM)、丙酮、三氯甲烷三种有机溶液萃取的海洋深层水萃取物与本发明2400ppm硬度海洋深层水萃取物(DSW2400)原液作电喷洒/质谱法(ESI/MS)质谱图的比较。结果如图2所示，竹签电喷洒/质谱法(ESI/MS)发现在本发明DSW2400以DCM、丙酮、三氯甲烷三种有机溶液萃取可得到主要687、733、1070波形的分子量。利用本发明DSW2400进行的滤纸电喷洒/质谱法(ESI/MS)亦可发现733和1070波形的分子量。因此，证明本发明的海洋深层水萃取物的687、733、1070分子量为有机成分。

本发明取不同海水区域与不同处理的海洋深层水或海洋表面水(surfacewater，SSW)的以电喷洒/质谱法(ESI/MS)分析，结果如图3所示，分子量在2000以下的有机成分的分子量表现不同，发现本发明的海洋深层水(DSW2400)比海洋表面水(SSW-50)、台肥海矿1400深层海水(CS1-HB)样品更能表现1070波形组的强度；且其他深井深层海水(CS2-DM系)、台盐海洋碱性离子水(CS3-TY)、统一pH 9.0碱性离子水(CS4-T1)以及弱碱性水(CS5-LB)皆不具有1070波形，表示该些商品未含有该有机成分。

以市售RENISHAW拉曼光谱仪测量电透析(ED)的DSW2400的样品，如图4所示，在波数(wavenumber)为1000的分子振动谱峰的强度，会受到灭菌锅加热后和未处理的本发明海洋深层水萃取物相比有显著降低的情形，证实加热会破坏有机成分。

实施例5本发明的海洋深层水萃取物活性成分对酸的表现

将400ml的本发明的2400ppm硬度海洋深层水萃取物(DSW2400)开封后立即使用。取10个离心管分别加入：(A)50ml以RO逆渗透处理后淡化的RO逆渗透水；(B)未经任何处理50ml本发明DSW2400；(C)50ml本发明DSW2400连同离心管在灭菌锅内经121℃15分钟的加热灭菌处理；(D)50ml本发明DSW2400加入HCl至pH值为5，进行电透析的样品；(E)50ml本发明DSW2400加入HCl至pH值为4，进行电透析的样品；(F)50ml本发明DSW2400加入HCl至pH值为3，进行电透析的样品；(G)刚接触空气的50ml 本发明DSW2400；(H)接触空气三天的50ml本发明DSW2400，进行电透析的样品；(I)通入氢气的50ml本发明DSW2400，进行电透析的样品；(G)经过0.22μm滤纸过滤的50ml本发明DSW2400，进行电透析的样品。10个样品进行电喷洒/质谱法(ESI/MS)，如图5所示，发明1070波形组的强度在各样品中表现不同，以刚接触空气的50ml本发明DSW2400，及以经过0.22μm滤纸过滤的50ml本发明DSW2400的波锋最高，而用酸(pH 3至4)、接触空气越久氧化以及高温灭菌的样品1070波形的有机成分会被破坏。

实施例6添加抗氧化物对保存本发明的海深层水萃取物活性成分的效果

将400ml的本发明的海洋深层水开封后(第一天)立即以电喷洒/质谱法(ESI/MS)分析，用量筒取出200ml，然后分装至4瓶50ml离心管内，每瓶50ml处理后封瓶锁紧，第一瓶不做任何处理(减少接触空气面积)，第二瓶则通氢气30秒(可能会导至DSW溢出)，第三瓶加入抗氧化物槲皮素(quercetin)(1mg/200ml)及第四瓶加抗氧化物绿茶素(EGCG)(12mg/50ml)，另外残余的200ml则仍旧留在原容器中并暴露于空气中作为无处理对照组。所有液体都会在第二、九天分别开封测试不同处理方式后的以电喷洒/质谱法(ESI/MS)评估1070等波形强度。

结果如图6至图8所示，以电喷洒/质谱法(ESI/MS)发现以1070波形组的强度在第一天的各种情形的表现量，在第一天刚开瓶时五种处理有相近的1070波形组的强度(图6)。以电喷洒/质谱法(ESI/MS)发现以1070波形组的强度在第二天的各种情形的表现量，在第二天减少空气接触、通入氢气30秒或加入抗氧化物如槲皮素或绿茶素处理都有保留1070波形组的强度表现量，相对于大瓶未处理与大量接触空气的1070波形组的强度表现量明显消失(图7)。以电喷洒/质谱法(ESI/MS)发现以1070波形组的强度在第九天的各种情形的表现量，各组1070波形组的强度表现量皆明显降低，但加入抗氧化物如槲皮素或绿茶素的1070波形组的强度表现量比其它组别仍有较高的趋势(图8)。

以电喷洒/质谱法(ESI/MS)量测以1070波形组的强度为指标统计五组处理本发明的海洋深层水萃取物在第一天(Day 1)、第二天(Day 2)和第九天(Day 9)的各种情形的1070波形表现强度。如图9所示，除了暴露在大量空气中的第一组(Air 1)外，四组1070波形组的强度在第二天尚可保持。各组1070波形组 的强度在第九天表现量皆明显降低，但加入抗氧化物如氢气、槲皮素(quercetin)或绿茶素(EGCG)的1070波形组的强度表现量比其它组别仍有较高的趋势。在无处理的对照组中(以Air 1表示)，将200ml本发明的海洋深层水萃取物暴露在大量空气中；在无处理组中(以Air 2表示)，将50ml本发明的海洋深层水萃取物紧密封住在50ml离心管中；通入氢气(以H2表示)组中，将50ml本发明的海洋深层水萃取物紧密封住在通入氢气30秒的50ml离心管中；加入槲皮素组中(以quercetin表示)，将50ml本发明的海洋深层水萃取物紧密封住在已添加1mg/200ml槲皮素的50ml离心管中；加入绿茶素(以EGCG表示)，将50ml本发明的海洋深层水萃取物紧密封住在已添加12mg/50ml绿茶素的50ml离心管中。其结果显示与空气接触，皆会使本发明的海洋深层水萃取物的有机成分氧化，而加入具安全、常用的可食性物质的抗氧化物能减少本发明的海洋深层水萃取物的1070波形组的有机成分氧化。

本发明利用海洋深层水萃取物经过reverse osmosis(RO逆渗透)和电透析(electrodialysis)或是经由小分子膜纳米过滤(nanofilter)等其它方式可以取得或保留具有抑制胃幽门螺旋杆菌生长的活性成分。这些活性成分可进一步经由凝胶层析(gel filtration)、二氯甲烷(Dichloromethane，DCM)萃取、丙酮萃取、以及三氯甲烷萃取后取得分子量在2000以下具有抑制胃幽门螺旋杆菌生长的性质。以电喷洒/质谱法(ESI/MS)分析可发现三种主要分子量在687(685-690)、733(733-738)、1070(1070-1075)波形组的强度。并以电喷洒/质谱法(ESI/MS)发现在以DCM、丙酮、三氯甲烷三种有机溶液萃取2400ppm硬度海洋深层水萃取物(DSW2400)的样品可得到主要687、733以及1070波形，证实687、733以及1070分子量为有机成分。

本发明的海洋深层水萃取物接触空气氧化、以121℃或加热100℃处理或是用酸(pH 3至4)会破坏687、733以及1070等波形的有机成分。以市售RENISHAW拉曼光谱仪测量电透析的DSW2400的样品，在波数(wavenumber)为1000的分子振动谱峰的强度，会受到灭菌锅加热后和未处理的本发明海洋深层水萃取物有显著降低的情形。以电喷洒/质谱法(ESI/MS)发现以1070波形组的强度在第二天接触空气后的表现量明显降低。在第二天减少空气接触、通入氢气30秒或加入抗氧化物如槲皮素或绿茶素处理都有保留1070波形组的强 度表现量。以电喷洒/质谱法(ESI/MS)发现以1070波形组的强度在第九天的强度表现量皆明显降低，但加入抗氧化物如槲皮素或绿茶素的1070波形组的强度表现量比其它组别仍有较高的趋势。

此外，本发明亦采用其他抗氧化剂进行比较，如图10所示，以维他命C作为抗氧化剂会破坏本发明的海洋深层水萃取物的有效成分，非所有的抗氧化剂皆具有减缓本发明的海洋深层水萃取物氧化的效果。

实施例7本发明的海深层水萃取物具有抑制胃幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori)生长的效果

本发明证实海洋深层水萃取物具有抑制胃幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori)生长的活性成分并非是与其高钙、高镁浓度及高硬度有关。如第十一图A所示，本发明1200、2400、3600、4800以及6000ppm硬度的海洋深层水萃取物分别以灭菌锅、0.22μm过滤膜进行滤菌以及灭菌锅与0.22μm过滤膜进行滤菌处理后，发现本发明硬度2400ppm以上具有抑制胃幽门螺旋杆菌的效果，同时以滤菌处理后的抑制较果较佳(图11A)。本发明利用EDTA二价金属螯合剂将钙和镁移除，证实本发明的海洋深层水萃取物不含钙及镁离子，仍具有抑制胃幽门螺旋杆菌生长的效应；而以含相同的镁离子浓度的蒸馏水则无法产生抑制胃幽门螺旋杆菌生长的效应(图11B)。

另外，本发明利用质谱仪量化海洋深层水萃取物1070成分强度数值与抑制胃幽门螺旋杆菌生长百分比的关系图，本实施方式为制备不同硬度的海洋深层水萃取物、加入不同浓度的EDTA于海洋深层水萃取物或不同浓度MgCl₂的洋菜胶(agar)，接着以0.22μm过滤膜灭菌或是锅(autoclave)灭菌进行滤菌。混合羊血之后，倒入9cm的培养基，等待凝固成为洋菜胶固体培养基(agar plate)。取2.85毫克MgCl₂，加入其他培养基成分与水，最后泡成体积为10ml的agar plate，则代表agar plate所含有MgCl₂浓度为285mg/L。依据上述方法，分别制备含有MgCl₂浓度为285mg/L与570mg/L的agar plate；并且分别制备不同硬度1200至6000ppm海洋深层水萃取物或加入不同浓度的EDTA于硬度2400的ppm海洋深层水萃取物制备成不同成分含量的洋菜胶固体培养基。本案为确定海洋深层水具抑制胃幽门螺旋杆菌生长的主要成份为何者，选取来自10个不同病人检体的胃幽门螺旋杆菌，使用无菌棉棒，沾取适量的胃幽门 螺旋杆菌，涂抹于洋菜胶固体培养基上，放入厌养培养箱进行培养，培养3至4天之后，观察是否有胃幽门螺旋杆菌细菌生长，如果没有生长以－标示，如果有微量生长以+/－标示，如果会有正常生长以+标示。其结果如图12所示，发现该海洋深层水萃取物浓度愈高其抑菌效果越好。灭菌锅(autoclave)灭菌降低1070波形组含量，但以0.22μm过滤膜进行滤菌不会影响1070波形组含量，证实1070波形组含量为海洋深层水具抑制胃幽门螺旋杆菌生长的主要成份。图12是含有不同成分1070波形组含量的海洋深层水萃取物对抑制胃幽门螺旋杆菌的抑制效果的关系图。1070波形组含量越高的海洋深层水萃取物与抑制胃幽门螺旋杆菌能力成正相关。A为RO逆渗透水样品；B为表面海水SSW(50公尺海平面下的海水)样品；C为经过灭菌锅处理后的DSW2400样品；D为在pH 3.93的条件下的DSW2400样品；E为经过0.22μm过滤的DSW2400样品；F为经过ED处理的DSW2400样品；H为样品A至F对抑制胃幽门螺旋杆菌的抑制效果的关系图；G为样品A至F的1070波形组含量的平均强度量化数值。

更进一步地，本发明的实施例另采前瞻、双盲的方式进行临床试验检测本发明的海洋深层水萃取物是否可明显降低胃幽门螺旋杆菌感染所放出的碳十三尿素呼吸数值。

首先，针对年龄20岁以上的成年男性或女性，因有上腹痛等消化不良症状而来接受胃镜检查，经检查发现有慢性胃炎或轻微胃糜烂(直径小于5mm，数目不超过3个)或在瘢痕期的消化性溃疡，同时有幽门螺旋杆菌感染的病患，将征求其意愿，邀请参与本试验。病患若有下列情况之一，就被排除：1)怀孕或哺乳妇女；2)严重并存疾病如肾衰竭、肝硬化等；3)无法治愈的恶性肿瘤；4)严重的溃疡出血；5)以前接受胃切除手术；6)在胃镜检查前一个月之内曾服用铋盐、PPIs、抗生素，或非类固醇消炎止痛剂。治疗前都接受胃镜和其附属检查同时做碳13尿素呼气试验(13C-UBT)判定幽门螺旋杆菌存在的状态。病患先经过负责计划的人员解说试验内容及流程且签署受试者同意书后，依照试验流程接受试验前后抽血筛检身体基本功能(血液常规检验(CBC)、肝功能检验(LFT)、肾功能检验(RFT)、血糖、血脂及、电解质)，碳13尿素呼气试验(分别在本发明的海洋深层水萃取物(DSW)饮用前、2周DSW刚饮用完毕后、 DSW饮用完毕4周后)。受试者分别为每次饮用200mL本发明的海洋深层水萃取物(DSW)或饮用相同包装非本发明的海洋深层水萃取物的一般矿泉水(CMW)，一天4次(三餐饭前一小时及睡前)，为期四周。同时在三餐饭后服用促进肠胃蠕动药物(prokinetics)(甲氧氯普胺(metoclopramide)5mg/tab)一天三次和抗酸剂(antacid)(息痛佳音锭(Strocain)(含有欧西拉因(oxethazaine)5mg以及polymigel 244mg/tab)，一天三次，以帮助消化不良症状的缓解。所有病患被要求填写一份问卷，同时在治疗期间每天记录临床症状和DSW饮用量。DSW饮用期间，病人将维持其平时规则性饮食方式，但被要求禁止同时使用下列食物或药物：乳制品、汉方草药、蜂蜜、蔓越莓、含乳酸菌的保健食品、过度酸辣的食物等。本发明的海洋深层水萃取物(DSW)饮用结束后，病患被安排至门诊以便评估DSW饮用顺从度和不良反应发生的内容、程度和频率。同时安排评估DSW饮用后改变幽门螺旋杆菌菌量效果的追踪检查。治疗前，当(1)组织学检查及13C-UBT均为阳性时；或(2)细菌培养阳性，则判定为有带菌的状态。治疗后的效果则以系列性的13C-UBT数值的变化做为判断的依据。

如图13所示在临床研究数值发现具有阳性幽门螺旋杆菌感染的病患在饮用本发明的含有1070成分的海洋深层水萃取物可以明显降低胃幽门螺旋杆菌感染所放出的碳十三尿素呼吸数值，而以不含1070成分的一般矿泉水(CMW)则不能改善碳十三尿素呼吸数值(无法改善胃幽门螺旋杆菌感染程度)。

因此，本发明提供一种具有分子量为2000以下的有机成分的海洋深层水萃取物，能有效抑制胃幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori)生长，其为治疗胃幽门螺旋杆菌感染的新策略。