一种新型同源重组抑制剂的制作方法

本发明属于药物化合物领域，具体地说，本发明涉及欧夹竹桃苷的抑制DNA修复以及降低肿瘤细胞的耐药性的用途。

背景技术：

肿瘤细胞中常常出现染色体的异常表现和染色体不稳定性。目前很多的肿瘤化疗和靶向治疗药物都是针对肿瘤细胞诱导DNA损伤和基因组不稳定性。一直以来，人们都在探索中药提取物对肿瘤的治疗作用。

DNA双链断裂是最严重的DNA损伤形式。如果得不到有效的修复，将会导致细胞的死亡。DNA双链断裂损伤(DNA double-strand breaks,DSBs)修复主要利用同源重组和非同源性末端接合(Non-homologous end joining,NHEJ)机制。同源重组在其中起主要作用，通过利用未受损伤的另一条染色体作为模版，来修复与其相似的受损伤的染色体；非同源性末端接合的修复方式属于不精确修复，所产生的DNA往往导致基因组不稳定而最终引起细胞死亡。参与同源重组修复的基因包括RAD51、RAD54、BRCA1、BRCA2等。RAD51是有丝分裂细胞中催化DNA同源重组修复过程中同源配对的唯一因子。而XRCC1是非同源末端接合修复的主要因子。、

因此，本领域迫切需要研发能够有效诱导肿瘤细胞DNA双链断裂损伤、肿瘤细胞凋亡的相关药物。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种能够有效诱导肿瘤细胞DNA双链断裂损伤、肿瘤细胞凋亡的相关药物。

在本发明的第一方面，提供了一种欧夹竹桃苷或其药用盐的用途，其特征在于，用于制备(i)用于抑制DNA修复；(ii)用于降低肿瘤细胞的耐药性的组合物或制剂。

在另一优选例中，所述的DNA修复包括同源重组DNA修复。

在另一优选例中，所述的DNA修复为哺乳动物细胞的DNA修复。

在另一优选例中，所述的组合物包括：药物组合物、和保健品组合物。

在另一优选例中，所述的组合物或制剂的剂型包括：口服剂型、注射剂。

在另一优选例中，所述的口服剂型包括：片剂、胶囊、颗粒剂、口服液。

在另一优选例中，所述的组合物或制剂还用于选自下组的一种或多种用途：

(a)诱导肿瘤细胞DNA双链断裂损伤；

(b)诱导肿瘤细胞凋亡。

在另一优选例中，所述组合物中含有0.001-99wt％，较佳地0.1-90wt％，更佳地1-80wt％的欧夹竹桃苷或其药学上可接受的盐，按组合物的总重量计。

在另一优选例中，所述的制剂中含有0.001-100wt％，较佳地0.1-99wt％，更佳地1-80wt％的欧夹竹桃苷或其药学上可接受的盐，按制剂的总重量计。

在本发明的第二方面，提供一种非治疗性的、体外抑制DNA修复的方法，其特征在于，包括步骤：

(a)将待处理的细胞与欧夹竹桃苷或其药学上可接受的盐接触，从而抑制所述细胞中的DNA修复。

在另一优选例中，所述步骤(a)中，欧夹竹桃苷或其药学上可接受的盐的浓度为0.02ug/ml。

在另一优选例中，所述的接触是在培养液中添加欧夹竹桃苷或其药学上可接受的盐。

在另一优选例中，所述的细胞包括肿瘤细胞。

在另一优选例中，所述的细胞包括哺乳动物细胞。

在另一优选例中，所述的细胞包括人细胞、非人哺乳动物细胞。

在本发明的第三方面，提供一种非治疗性的、体外降低肿瘤细胞耐药性或耐受性的方法，其特征在于，包括步骤：

(a)将所述的肿瘤细胞与欧夹竹桃苷或其药学上可接受的盐接触，从而降低肿瘤细胞耐药性或耐受性。

在另一优选例中，所述的肿瘤细胞包括选自下组肿瘤的细胞：胃癌、肺癌、肝癌、肠癌、卵巢癌、乳腺癌。

在本发明的第四方面，提供一种抑制DNA修复和/或降低肿瘤细胞的耐药性的方法，其特征在于，包括步骤：给需要的对象施用欧夹竹桃苷或其药用盐。

在本发明的第五方面，提供一种用于抑制DNA修复和/或降低肿瘤细胞的药物组合物，其特征在于，含有(A)欧夹竹桃苷或其药用盐；(B)药学上可接受的载体；(C)任选的额外的抗肿瘤药物。

在另一优选例中，所述的“额外的抗肿瘤药物”包括：抗体、索拉菲尼、顺铂、或其组合。

在另一优选例中，所述的肿瘤包括：胃癌、肺癌、肝癌、肠癌、卵巢癌、乳腺癌。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了欧夹竹桃苷能够有效诱导肿瘤细胞凋亡。

图2显示了欧夹竹桃苷能够导致肿瘤细胞DNA单链相关蛋白RPA表达增加，DNA双链断裂损伤蛋白γH2AX(DNA双链断裂标记物)表达增加。

图3显示了欧夹竹桃苷能够诱导DNA同源重组修复蛋白Rad51表达降低，并促使DNA单链损伤修复蛋白XRCC1表达增加。

图4显示了欧夹竹桃苷抑制HBE细胞同源重组修复通路蛋白Rad51表达。

具体实施方式

本发明人通过广泛而深入的研究，首次意外地发现，本领域中常用作强心苷的欧夹竹桃苷居然能够非常有效地诱导肿瘤细胞DNA双链断裂损伤、肿瘤细胞凋亡。基于上述发现，发明人完成了本发明。

在描述本发明之前，应当理解本发明不限于所述的具体方法和实验条件，因为这类方法和条件可以变动，还应当理解本文所用的术语其目的仅在于描述具体实施方案，并且不意图是限制性的，本发明的范围将仅由所附的权利要求书限制。

除非另外定义，否则本文中所用的全部技术与科学术语均具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。如本文所用，在提到具体列举的数值中使用时，术语“约”意指该值可以从列举的值变动不多于1％。例如， 如本文所用，表述“约100”包括99和101和之间的全部值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。

虽然在本发明的实施或测试中可以使用与本发明中所述相似或等价的任何方法和材料，本文在此处例举优选的方法和材料。

术语定义

欧夹竹桃苷

欧夹竹桃苷(Oleandrin)(C₃₂H₄₈O₉；MW 576.3)是从中草药夹竹桃中分离、提取出来的一种单体化合物，结构式如下：

它是夹竹桃的主要活性成分，具有较强的强心苷活性。

本发明的实验表明，欧夹竹桃苷具有抑制同源重组DNA修复的作用。

(1)欧夹竹桃苷可以作为同源重组修复的抑制剂；

(2)在某些肿瘤细胞中，由于其他DNA修复基因的突变，同源重组DNA修复方式成为这些肿瘤细胞赖以生存的信号通路，欧夹竹桃苷可以作为这一类肿瘤的靶向抗癌药物；

(3)同源重组DNA修复几乎是所有化疗与放疗耐药或耐受的重要原因之一，欧夹竹桃苷可以与其他放疗药物共用，或与化疗协同作用治疗肿瘤。

组合物和施用方法

本发明还提供了一种含有欧夹竹桃苷作为活性成分的用于诱导肿瘤细胞DNA双链断裂损伤、肿瘤细胞凋亡的组合物。所述的组合物包括(但并不限于)：药物组合物、食品组合物、膳食补充剂、饮料组合物等。

在本发明中，欧夹竹桃苷可直接用于疾病治疗，例如，用于诱导肿瘤细胞DNA双链断裂损伤、肿瘤细胞凋亡的治疗。在使用本发明欧夹竹桃苷时，还可同 时使用其他治疗剂。

本发明还提供了一种药物组合物，它含有安全有效量的本发明欧夹竹桃苷以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、粉剂、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。诸如片剂和胶囊之类的药物组合物，可通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液、片剂和胶囊宜在无菌条件下制造。本发明的药物组合也可以被制成粉剂用于雾化吸入。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约1微克/千克体重-约5毫克/千克体重。此外，本发明欧夹竹桃苷还可与其他治疗剂一起使用。

“药学上可以接受的载体”指的是：一种或多种相容性固体或液体填料或凝胶物质，它们适合于人使用，而且必须有足够的纯度和足够低的毒性。“相容性”在此指的是组合物中各组份能和本发明的化合物以及它们之间相互掺和，而不明显降低化合物的药效。药学上可以接受的载体部分例子有纤维素及其衍生物(如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素钠、纤维素乙酸酯等)、明胶、滑石、固体润滑剂(如硬脂酸、硬脂酸镁)、硫酸钙、植物油(如豆油、芝麻油、花生油、橄榄油等)、多元醇(如丙二醇、甘油、甘露醇、山梨醇等)、乳化剂(如吐温)、润湿剂(如十二烷基硫酸钠)、着色剂、调味剂、稳定剂、抗氧化剂、防腐剂、无热原水等。

对于本发明的药物组合物，可通过常规的方式施用于所需的对象(如人和非人哺乳动物)。本发明化合物或药物组合物的施用方式没有特别限制，代表性的施用方式包括(但并不限于)：口服、瘤内、直肠、肠胃外(静脉内、肌肉内或皮下)、和局部给药，优选的给药方式为口服给药。

用于口服给药的固体剂型包括胶囊剂、片剂、丸剂、散剂和颗粒剂。在这些固体剂型中，活性化合物与至少一种常规惰性赋形剂(或载体)混合，如柠檬酸钠或磷酸二钙，或与下述成分混合：(a)填料或增容剂，例如，淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和硅酸；(b)粘合剂，例如，羟甲基纤维素、藻酸盐、明胶、聚乙烯基吡咯烷酮、蔗糖和阿拉伯胶；(c)保湿剂，例如，甘油；(d)崩解剂，例如，琼脂、碳酸钙、马铃薯淀粉或木薯淀粉、藻酸、某些复合硅酸盐、和碳酸钠；(e)缓溶剂，例如石蜡；(f)吸收加速剂，例如，季胺化合物；(g)润 湿剂，例如鲸蜡醇和单硬脂酸甘油酯；(h)吸附剂，例如，高岭土；和(i)润滑剂，例如，滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、十二烷基硫酸钠，或其混合物。胶囊剂、片剂和丸剂中，剂型也可包含缓冲剂。

固体剂型如片剂、糖丸、胶囊剂、丸剂和颗粒剂可采用包衣和壳材制备，如肠衣和其它本领域公知的材料。它们可包含不透明剂，并且，这种组合物中活性化合物或化合物的释放可以延迟的方式在消化道内的某一部分中释放。可采用的包埋组分的实例是聚合物质和蜡类物质。必要时，活性化合物也可与上述赋形剂中的一种或多种形成微胶囊形式。

用于口服给药的液体剂型包括药学上可接受的乳液、溶液、悬浮液、糖浆或酊剂。除了活性化合物外，液体剂型可包含本领域中常规采用的惰性稀释剂，如水或其它溶剂，增溶剂和乳化剂，例知，乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、丙二醇、1,3-丁二醇、二甲基甲酰胺以及油，特别是棉籽油、花生油、玉米胚油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油或这些物质的混合物等。

除了这些惰性稀释剂外，组合物也可包含助剂，如润湿剂、乳化剂和悬浮剂、甜味剂、矫味剂和香料。

除了活性化合物外，悬浮液可包含悬浮剂，例如，乙氧基化异十八烷醇、聚氧乙烯山梨醇和脱水山梨醇酯、微晶纤维素、甲醇铝和琼脂或这些物质的混合物等。

用于肠胃外注射的组合物可包含生理上可接受的无菌含水或无水溶液、分散液、悬浮液或乳液，和用于重新溶解成无菌的可注射溶液或分散液的无菌粉末。适宜的含水和非水载体、稀释剂、溶剂或赋形剂包括水、乙醇、多元醇及其适宜的混合物。

用于局部给药的本发明化合物的剂型包括软膏剂、散剂、贴剂、喷射剂和吸入剂。活性成分在无菌条件下与生理上可接受的载体及任何防腐剂、缓冲剂，或必要时可能需要的推进剂一起混合。

使用药物组合物时，是将安全有效量的欧夹竹桃苷施用于哺乳动物，其中该安全有效量通常至少约10微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约8毫克/千克体重，较佳地该剂量是约10微克/千克体重-约1毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。

与现有技术相比，本发明的主要优点包括：

欧苷夹竹桃可以显著抑制DNA修复和/或降低肿瘤细胞的耐药性。

(1)欧夹竹桃苷可以作为同源重组修复的抑制剂；

(2)在某些肿瘤细胞中，由于其他DNA修复基因的突变，同源重组DNA修复方式成为这些肿瘤细胞赖以生存的信号通路，欧夹竹桃苷可以作为这一类肿瘤的靶向抗癌药物；

(3)同源重组DNA修复几乎是所有化疗与放疗耐药或耐受的重要原因之一，欧夹竹桃苷可以与其他放疗药物共用，或与化疗协同作用治疗肿瘤。

下面结合具体实施例，进一步陈述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明详细条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。以下实施例中所用的实验材料和试剂如无特别说明均可从市售渠道获得。

实施例欧夹竹桃苷对于肿瘤细胞的处理实验

细胞培养：

人体细支气管肺泡癌细胞A549细胞(购自中国科学院上海分院)在37℃下培养在含有10％牛胎儿血清的细胞培养基/高葡萄糖(胰蛋白酶)，且在含5％二氧化碳的气氛下。奥拉帕尼购自Selleck Chemicals公司。

欧夹竹桃苷溶解在DMSO中，初始浓度为5ug/ml，随后稀释至所需的浓度。

A549细胞分成三份，放置在六孔板过夜。

1.流式细胞仪检测肿瘤细胞凋亡率

(1)用不同浓度欧夹竹桃苷(0.01ug/ml,0.02ug/ml,0.04ug/ml,006ug/ml)干预A549(人支气管上皮肺癌细胞系)24小时，用流式细胞仪检测细胞凋亡率；

(2)用0.02ug/ml的欧夹竹桃苷干预A549细胞(6h,12h,18h,24h)，用流式细胞仪检测细胞凋亡率。

2.免疫荧光法检测DNA损伤

用0.02ug/ml的欧夹竹桃苷干预A549细胞24h，用免疫荧光法观察并统计分析DNA损伤蛋白RPA(DNA单链相关蛋白)、γH2AX(DNA双链断裂标记物)的表达情况。

3.Western blot检测肿瘤细胞DNA损伤修复

用欧夹竹桃苷干预A549细胞24h，Western blot检测DNA损伤修复蛋白Rad51(同源重组修复)、XRCC1(单链损伤修复)表达情况。

4.Western blot检测Oleandrin抑制同源重组修复通路

用欧夹竹桃苷干预HBE(人正常支气管上皮细胞系)24h，Western blot检测同源重组修复蛋白Rad51表达情况。

实验结果：

1.欧夹竹桃苷能够有效诱导肿瘤细胞凋亡(图1)；

2.欧夹竹桃苷能够导致肿瘤细胞DNA单链相关蛋白RPA表达增加，DNA双链断裂损伤蛋白γH2AX(DNA双链断裂标记物)表达增加(图2)；

3.欧夹竹桃苷能够诱导DNA同源重组修复蛋白Rad51表达降低，并促使DNA单链损伤修复蛋白XRCC1表达增加(图3)。

4.欧夹竹桃苷抑制HBE细胞同源重组修复通路蛋白RAD51表达(图4)。

结论：

欧夹竹桃苷能够有效的抑制同源重组信号通路，并成为一种新的同源重组抑制剂。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。