α‑倒捻子素在类风湿关节炎治疗中的应用及其自微乳制剂的制作方法

本发明属于医药技术领域，具体地，涉及α-倒捻子素在类风湿关节炎治疗中的应用，还涉及一种α-倒捻子素自微乳制剂，包括其制剂组成、制备方法及其在类风湿关节炎治疗中的应用。

背景技术：

类风湿关节炎(RA)是一种由自身免疫系统障碍导致的慢性炎症性疾病。临床表现为由免疫系统异常激活导致的关节慢性炎症浸润，滑膜增生和骨质侵蚀。RA直接的致残率高，严重影响患者的劳动能力及生活质量。该病全球范围内的发病率约为1％。较高的发病率和致残率对家庭和社会都造成了沉重的经济和医疗负担。目前RA的常规治疗药物包括甾体抗炎药、非甾体抗炎药和缓解病情抗风湿药(DMARD)，其中甾体和非甾体抗炎药作为RA治疗的一线用药，合理使用可有效缓解各种临床症状，如疼痛、晨僵、活动限制等，但长期使用伴随一定的副作用，且不能遏制病情的发展。DMARD是RA治疗的重要药物，大部分DMARD可通过下调异常激活的免疫功能，实现对后续病理过程干预，产生积极的治疗效果。但该类药物治疗窗口窄，毒副作用明显，安全性较差，且对关节保护作用甚微，在长期的治疗中，后期收效不佳。近年来生物疗法蓬勃发展，然而该方案成本高，且长期使用的安全性和有效性仍有待进一步验证，短期推广应用面临诸多困难。

鉴于以上现状，新型抗风湿药物的开发迫在眉睫。传统植物药作为常规药物的替代治疗方案长期存在。山竹是南亚地区重要的热带水果，其肥厚的果皮在当地被当作解热镇痛及抗感染药物广泛使用，其中主要的活性成分是α-倒捻子素(MG)。MG生理活性广泛，具有良好的抗氧化、抗癌(细胞毒)、抗炎、抗过敏、抗微生物、抗寄生虫、抗阿尔茨海默病、减肥等多种显著的药理活性，但未有研究揭示其在RA治疗领域潜在的应用价值。MG显著的抗炎活性一直以来受到持续的关注，相关研究发现它对多种细胞在炎症诱导因素下出现的炎症反应表现出良好的抑制作用，且上述作用与游离MG及其II相代谢产物在细胞中的浓度呈现正相关性，提示高浓度的组织分布有利于其药效的发挥。但是，由于该物质口服利用率低，且注射给药消除半衰期短，这些问题限制了其药用价值的充分发挥和深入的开发应用，亟待解决。

技术实现要素：

发明目的：为临床治疗RA提供新的用药选择，本发明公开了MG在RA治疗的中的应用；为解决MG的成药性缺点，本发明还公开了一种α-倒捻子素自微乳制剂(MG-SME)，以及MG-SME的制备方法，并公开了其在RA治疗的中的应用。

技术方案：为了弥补现有治疗方案中存在的不足，本发明公开了MG在医学上的一种新用途，即MG在RA治疗的中的应用。本发明针对现有治疗方案的缺点，提供一种新型安全、有效的RA治疗天然活性成分MG，其原料来源广，应用成本低。本发明所述的MG对大鼠佐剂诱导关节炎(AA)的体内疗效显著，表现出抗炎、免疫调节和关节保护等多重活性。与目前主流DMARD来氟米特(LEF)相比，MG安全性好，无明显的肝肾毒性和骨髓抑制作用，且通过抑制滑膜血管新生和纤维增生，有效地控制了滑膜对软骨的侵蚀，体现出优于LEF的关节保护作用。

本发明还公开了一种α-倒捻子素自微乳制剂(MG-SME)，按体积计算，包括10-30％的油相，70-90％的表面活性剂混合物；MG的浓度为40mg/mL以内。MG-SME组成合理，辅料安全性好，可以有效改善MG的药代动力学缺陷，优化组织亲和力和靶向性，克服了该化合物固有的成药性缺陷，提高了体内疗效。本发明所述的MG-SME载药体系在水中分散良好且稳定。相对于MG的悬浊液(MG-SP)，MG-SME可显著提高血药浓度和生物利用度，增加MG在免疫器官中的分布。并且，该体系的载药量高，MG最高加载量可达40mg/ml，可以有效应用于类风湿关节炎的治疗。

进一步的，上述的MG-SME，所述表面活性剂混合物包括乳化剂和助乳化剂，其中乳化剂为助乳化剂的1-3倍。乳化剂和助乳化剂比例合理，易形成自微乳，体系的稳定性高，载药量高。

进一步的，上述的MG-SME，所述油相包括肉豆蔻酸异丙酯和油酸，其中，按体积计算，所述油酸占油相的10-50％。油相的组分合理，体系的稳定性高，载药量高。

进一步的，上述的MG-SME，所述肉豆蔻酸异丙酯和油酸的体积比为3:1。作为本发明的一种优选方式，上述的组分构成的油相体系的稳定性最好，且载药量最高。

进一步的，上述的MG-SME，所述乳化剂为聚氧乙烯蓖麻油，所述助乳化剂为乙醇。该体系制备方便，且应用成本低。

进一步的，上述的MG-SME，所述聚氧乙烯蓖麻油和乙醇的比例为2:1。作为本发明的一种优选方式，上述的组分构成的乳化剂和助乳化剂体系的稳定性最好。

本发明还公开了一种α-倒捻子素自微乳制剂(MG-SME)的制备方法，所述油相、表面活性剂混合物和MG混合均匀，得所述MG-SME。本发明所述的MG-SME的制备方法，工艺简单易行，生产效率高，应用成本低，操作简单、易于实现。

进一步的，上述的MG-SME制备方法，所述油相、表面活性剂混合物和MG于25-35℃、200-400rpm的条件下搅拌5-20min，得所述MG-SME。制备条件温和，工艺简单。

本发明还公开了α-倒捻子素自微乳制剂(MG-SME)在类风湿关节炎治疗方面的应用。MG-SME有效地克服MG的药代动力学固有缺陷，优化了组织亲和力和靶向性。由于该体系提高了MG的血药浓度和生物利用度，并增加了其在免疫器官中的分布，进而表现出更为出色的类风湿关节炎的治疗效果。具体而言，MG-SME的免疫抑制和关节保护活性明显优于对照的悬浊液，展现出极高后续的应用价值和潜力。

有益效果：与现有技术相比，本发明具有以下优点：

1.MG作为天然的活性单体成分，在山竹果实的非食用部位中含量丰富，经济成本低。MG以滑膜组织为主要作用部位，产生关节保护作用，进而可应用于类风湿关节的临床治疗。其中其对于滑膜组织产生的抑制炎症浸润、血管新生和纤维增殖与关节保护作用密切相关，在此基础上实现对关节炎症状的有效控制。MG相对于目前常规的药物，具有毒性低，多靶点的优点，相对于阳性药LEF，能更有效地保护关节，从而在长期治疗中，能更有效地遏制疾病的进程。

2.MG-SME的制剂构成合理。本发明采用绿色环保的制剂辅料，成功制备MG-SME，得到均匀的热力学稳定分散系。该载药体系载药量高，可大幅促进原药的吸收，提高了生物利用度，并优化了组织分布特性，从而产生更为显著的体内疗效，达到增效的制剂目标。

附图说明

图1为本发明所述的MG-SME的三元相图；

图2为本发明所述实施例1中的MG-SME分散于水后的粒径分布及形态特征图；

图3为本发明大鼠血浆中MG的浓度变化图；

图4为本发明AA大鼠关节炎指数及足容积变化趋势图；

图5为本发明不同治疗方案对AA大鼠关节影响图，其中a-e分别表示模型、空白、MG-SME、MG-SP和LEF组(上，足形态图；下，足DR透射图)；

图6为本发明大鼠血清中主要促炎细胞因子水平图；

图7为本发明MG对T细胞亚群影响图；

图8为本发明治疗对AA大鼠关节病理结构变化的影响图，其中，上，皮下结构，竖直箭头：风湿结节，水平箭头：肉芽肿；中，滑膜形态，水平箭头：血管新生；下，软骨结构，水平箭头：软骨侵蚀，竖直箭头：血管翳；a-e分别表示模型，空白，MG-SME，MG-SP和LEF组。

具体实施方式

下面将通过几个具体实施例，进一步阐明本发明，这些实施例只是为了说明问题，并不是一种限制。

实施例1

制剂优化

在绘制三元相图之前首先测定MG在不同介质的溶解度，结果发现其在豆蔻酸异丙酯、PEG-400和乙醇中的溶解性能良好，而主要乳化剂性能类似。但是单纯的豆蔻酸异丙酯油相难以实现自组装形成微乳。多次尝试后发现，以豆蔻酸异丙酯+油酸(3:1)为油相，聚氧乙烯蓖麻油为乳化剂，乙醇为助乳化剂可实现较大的自乳化范围。

基于以上基本配方，将乳化/助乳化剂(Km)按照7:1，6:1，5:1，4:1，3:1，2:1，1:1，1:2，1:3，1:4，1:5和1:6的比例预先配制成混合物，而后在其中加入不同比例的油相，采用磁力搅拌器混合均匀。随后以100倍量的水充分稀释混匀，观察是否形成微乳，借以确定自微乳区域。微乳形成的考察指标包括相分离、透明度和流动性等。结果表明当Km值在3-1的区间内，较易形成自微乳，而油相比例的增加，体系的稳定性不断下降。

为进一步优化制剂组成，我们采用正交实验法对Km值，油相比例和载药浓度进行研究。实验采用L9(3⁴)正交试验表，结果采用包封率和粒径综合评价，具体实验安排和结果见表1。

其中，自微乳的表征检测方法：

1)包封率测定

取葡聚糖凝胶G-50适量，采用纯水预先溶胀24h，并加热至充分溶胀。将溶胀的凝胶填充于5ml注射器改装的微柱，以1500rpm转速离心脱水。将已知浓度的MG-SME以水充分稀释，吸取100μl，上样于微柱之上，以水淋洗，并采用离心法加速洗脱。收集洗脱液，加入等量甲醇破乳。样本中的MG采用HPLC-UV法测定，主要色谱条件为：C18色谱柱，90％甲醇洗脱，流速1ml/min，检测波长317nm。

2)粒径分布测定及形态观察

将MG-SME以水预先稀释，所得微乳粒径采用激光散射仪测定。微乳的形态采用透射电镜(TEM)予以观察，简要步骤如下。将微乳体系滴一滴至碳膜铜网上，并保持2min保证铜网充分吸附微乳，后用滤纸吸干多余液体。自然阴干后上机检测观察。

对结果的直观和方差分析发现，药物浓度对MG-SME的粒径影响较大，而包封率则主要受到Km和载药浓度的影响(表2)，在合理范围内油相比例对两者影响均不明显。根据正交实验结果，A₃B₁C₁为理论最优制剂，但过高的乙醇浓度会导致体系长期储存稳定性下降，而适当增加油相比例，可有效地提高载药量，因此选择A₂B₂C₁为优化制剂。

表1正交实验设计和结果

A，B和C分别代表Km，油相/表面活性剂混合物和α-倒捻子素浓度(mg/ml)

表2正交分析结果

A，B和C分别代表Km，油相/表面活性剂混合物和α-倒捻子素浓度(mg/ml)

因此，本发明的最优的一种用于类风湿关节炎治疗的MG-SME，其制备方法，包括以下步骤：量取豆蔻酸异丙酯和油酸按照3:1的比例预先充分混合均匀，得到油相；将聚氧乙烯蓖麻油和乙醇按照2:1的比例预混合，得表面活性剂混合物。精密称取MG 400mg，加入3ml的油相及7ml表面活性剂混合物，在30℃下，以磁力搅拌器以300rpm的速度搅拌混合10min，直至形成均一、透明、粘稠的黄色液体，即得MG-SME。

实施例2

一种用于类风湿关节炎治疗的MG-SME，其制备方法，包括以下步骤：量取豆蔻酸异丙酯和油酸按照1:1的比例预先充分混合均匀，得到油相；将聚氧乙烯蓖麻油和乙醇按照3:1的比例预混合，得表面活性剂混合物。精密称取MG 80mg，加入1ml的油相及9ml表面活性剂混合物，在25℃下，以磁力搅拌器以200rpm的速度搅拌混合15min，直至形成均一、透明、粘稠的黄色液体，即得MG-SME。

实施例3

一种用于类风湿关节炎治疗的MG-SME，其制备方法，包括以下步骤：量取豆蔻酸异丙酯和油酸按照9:1的比例预先充分混合均匀，得到油相；将聚氧乙烯蓖麻油和乙醇按照1:1的比例预混合，得表面活性剂混合物。精密称取MG 200mg，加入5ml的油相及5ml表面活性剂混合物，在35℃下，以磁力搅拌器以400rpm的速度搅拌混合5min，直至形成均一、透明、粘稠的黄色液体，即得MG-SME。

由于实施例1是本发明的最优实施例，因此对制备的MG-SME进行相关性能检测。

1、MG-SME的表征检测

检测发现制备所得MG-SME分散于水形成的微粒平均粒径为24.6nm，PDI为0.093；在TEM观察中，微粒呈现出单层膜状结构的球形囊泡状结构(图2)。上述表征结果表明，这一体系粒径分布均一，且符合自微乳的各项要求。

2、MG-SME的药代动力学及组织分布特征

1)药代动力学研究

将体重220g左右的20只SD大鼠(雌雄各半)随机分入MG-SME和MG-SP(MG以少量乙醇溶解，加入0.5％CMC-Na溶液混合，浓度为8mg/ml)灌胃组。适应性饲养后按照分组要求给药，并按照预先设计方案在不同时间点通过眼眶静脉连续取血，每次0.5ml。采集的血样收集入肝素钠化离心管，离心分离血浆，吸取200μl血浆加入800μl色谱纯甲醇，混匀后高速离心收集上清液，采用HPLC-UV检测MG浓度。结果表明，MG-SME加速了药物的消化道吸收，将T_max由40min提前至20min，同时峰浓度由734.1ng/ml提高到8066.9ng/ml，AUC达到MG-SP组的4.75倍(图3)。以上结果说明MG-SME显著促进了MG的吸收，提高了口服生物利用度。

2)组织分布研究

选取体重25g左右DBA/1的小鼠(雌雄各半)随机分为MG-SME和MG-SP灌胃组，每组10只。适应性饲养后按照分组要求给药，给药2.5h后，脱颈处死，随即解剖，采集组织样本并称重。每个组织取200mg样本，加入1％的吐温80溶液，高速匀浆至均匀。高速离心后取上清液200μl加入800μl色谱纯甲醇，混匀后高速离心收集上清液，采用HPLC-UV检测MG浓度。实验结果表明，总体而言MG在两组动物体内的组织分布特征类似，但SME载药体系显著提升了MG在脾和肺中的分布浓度。作为重要的免疫器官，MG在脾中的分布差异可能与两者的体内药效有密切的关联性。

表3 MG在小鼠组织分布结果

3、MG及MG-SME对AA大鼠的治疗作用评价

1)大鼠AA模型的制备及给药

将体重180g左右的SD雄性大鼠适应性饲养7d后，在右后足的足垫部位皮内注射完全弗氏佐剂(含灭活卡介苗20mg/ml)100μl。随后将其分为MG-SME组(50mg/kg/d)、MG-SP组(50mg/kg/d)、模型组和阳性药组(LEF片加入少量水充分研磨，逐步加入0.5％CMC-Na溶液，得10mg/ml的悬浊液，10mg/kg/d)，每组8只，在造模第二天予以相应药物治疗。同时随机选取另外8只大鼠作为空白对照，每日同步灌胃0.5％CMC-Na溶液1.5ml。

2)临床症状评估

在成功造模并给药后，定期测定大鼠的足肿胀和体重。大鼠的足肿胀程度采用排水法测定。关节炎的严重程度和病情进展采用关节炎指数来评价。根据肿胀程度，将每足评分为0-4，总分最高为16分。处死前一天，对实验动物的右后足拍摄DR透射片，评价关节病变程度。

3)解剖指数测定

实验周期结束后，所有动物采用水合氯醛麻醉并解剖处死。采用腹主动脉取血，血液采用肝素钠抗凝采血管和促凝血采血管分别采集，采集后用于全血细胞计数、T细胞分型分析(流式细胞术法)和制备血清。组织和器官迅速采集并称重，用于计算内脏指数(组织重/体重)。

4)血液指标分析

抗凝的全血分别用于全血细胞计数及T细胞分型分析。全血细胞计数采用全自动血细胞分析仪分析，T细胞分型分析采用流式细胞术，CD3、CD4、CD8抗体分别采用FITC、APC和PE标示。血清中TNF-α、IL-1β采用ELISA法测定，NAG、ALP、AST、ALT、Cr和BUN采用微板比色法测定。

5)病理切片分析

将经过福尔马林浸泡固定的组织采用固体石蜡包埋，采用连续切片机切成5μm的薄片(关节在包埋前采用EDTA脱钙处理2周)，采用苏木精-伊红染色后装片并封片固定，随后显微观察。

6)治疗对AA大鼠临床指标的影响

MG对AA大鼠的足肿胀和关节炎指数具有显著的抑制作用。总体而言，相对于LEF，MG的抗炎作用针对佐剂诱发的急性炎症快速和有效，但对免疫激活诱发的激发炎症和肿胀的治疗作用较弱(图4)，在此过程中MG-SME的疗效始终优于MG-SP。MG对AA大鼠的足活动功能具有良好的保护作用。DR片检查发现，AA大鼠普遍出现关节软骨侵蚀和融合，LEF对这一病理现象作用有限，而MG对关节具有显著的保护作用，体现出优于对照药的显著优势(图5)。

7)治疗对主要脏器重量的影响

通过对主要脏器、组织进行称重计算，发现治疗对肝、脾、肺、胸腺和足的重量影响较大。阳性药显著减轻肿胀的后足重量，并对胸腺具有显著的抑制作用，同时引起明显的肝脏肿大。MG总体而言对于足重和胸腺均具有抑制作用，而MG对于脾的抑制作用则更为突出和明显，体现出优于MG-SP的组织靶向性。上述数据表明MG和LEF均有不同程度的免疫抑制活性。

表4主要内脏和组织的重量指数

显著性差异：相对于模型组，^*p＜0.05，^**p＜0.01，^***p＜0.001；相对于LEF组，^##p＜0.01，^###p＜0.001；相对于MG-SME组，

8)治疗对血液指标的影响

MG和LEF对AA大鼠的炎症血象具有明显的改善作用，主要表现为对总白细胞和各型白细胞绝对数量的抑制(表5)。治疗过程中，MG-SP疗效甚微，再次体现出MG-SME的剂型优势。血清中主要促炎细胞因子水平经过3种方案的治疗也得到恢复性下调，其中MG-SME对于IL-1β的下调作用明显优于阳性药，显示出强大的抗炎活性(图6)。

表5大鼠全血细胞分型计数

显著性差异：相对于模型组，^*p＜0.05，^***p＜0.001；相对于LEF组，^#p＜0.05，^###p＜0.001

T细胞亚群分布实验表明LEF对CD3⁺细胞具有极显著的抑制作用，而MG的活性较弱，尤其MG-SP对该细胞比例基本无明显影响。LEF通过抑制CD8⁺比例，显著升高CD4⁺/CD8⁺比值(图7)。MG-SME对这一比值具有类似但较弱的影响。上述结果表明，SME体系可通过改变MG组织亲和力特征，增强免疫调节能力。

9)MG对AA大鼠关节的保护作用

病理切片检查发现，AA大鼠的关节存在显著的损伤，主要表现为皮下有明显的风湿结节，滑膜组织中存在大量新生血管、炎症浸润和纤维增生，而软骨层有血管翳生成，同时伴有炎症浸润和侵蚀。LEF对炎症及风湿结节具有良好的治疗效果，但对滑膜和软骨的病理变化作用不明显。MG相对于LEF显著的优势在于其有效地改善了关节组织结构的破坏症状(图8)。

以上所述仅是发明的几个实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离发明原理的前提下，还可以做出若干改进，这些改进也应视为本发明的保护范围。