本发明涉及应用化学技术领域，尤其涉及一种富含石榴酸的甘油二酯油组合物及其制备方法和应用。
背景技术：
甘油二酯(Diacylglycerol)是一类甘油三酯(Triacylglycerol)中一个脂肪酸被羟基取代的结构脂质，是天然植物油脂的微量成分及体内脂肪代谢的内源中间，其具有两种天然同分异构体，即1,2-甘油二酯和1,3-甘油二酯，如式1所示。
式1 甘油二酯结构示意(其中COR、COR’为饱和或不饱和脂肪酰基)
目前，经多项安全性评估发现，甘油二酯对人体无毒无害，被美国FDA认定为“一般公认安全”物质，2009年中国卫生部第18号公告批准甘油二酯油等7种物品为新资源食品。尽管甘油二酯和甘油三酯在能值和吸收率上基本相同，但是它们在体内的代谢上存在较大差异，短期及长期的动物和人体试验表明，与含有相同或相似脂肪酸组成的甘油三酯相比，1,3-甘油二酯具有控制和治疗高血甘油三脂症、肥胖症及其并发症的作用。因此，富含1,3-甘油二酯的食用油不仅可以替代甘油三酯食用油作为健康人群的保健用油，也可以用于肥胖人群以及相关并发症人群的营养治疗。
目前，甘油二酯的制备方法主要有以下几种：(1)甘油三酯醇解法：即在脂肪酶的催化下，甘油三酯与低级醇反应，生成甘油二酯和低级醇酯，但该方法使用的脂肪酶Novozyme 435和Lipozyme IM只能特异性分解或合成sn-1位或sn-3位的酯键，因此只能得到1,2-甘油二酯。(2)部分水解、酯化法：即先部分水解甘油三酯得到脂肪酸，再加入甘油，在sn-1和sn-3位选择性脂肪酶的催化下，甘油与部分水解得到的脂肪酸发生酯化反应生成1,3-甘油二酯，目前的大部分的甘油二酯包括花王公司生产的EnovaTMOil是基于这一原理开发的，该方法最大的缺点是工艺流程复杂，需要多步分离，此外原料的利用率低，另外需要使用脂肪酶，而脂肪酶价格较高，对于工业规模化生产甘油 二酯来说存在成本过高等问题。(3)甘油解法：即将甘油三酯油与甘油以及一种含有一元羧酸或二元羧酸的碱金属盐或碱土金属盐或其混合物(作催化剂)混合，通过甘油三酯的甘油醇解，制得商业的、食品级1,3-甘油二酯油，但常规甘油解需要在220～260℃的高温下反应，使得甘油三酯、甘油二酯和脂肪酸特别是不饱和脂肪酸的氧化作用加大。目前，制备甘油二酯油主要是通过大豆油、菜籽油、花生油和玉米油等甘油三酯型油脂制备而来，以鱼油等为原料制备甘油二酯最近也有少量报导，如Feltes等(2010)以脂肪酶Novozyme 435通过甘油三酯醇解法来制备富含n-3PUFA的甘油二酯；Eoma等(2010)以脂肪酶RMIM和Novozyme 435通过水解、酯化法合成富含n-3PUFA的甘油二酯。
共轭脂肪酸是对具有共轭双键体系的多不饱和脂肪酸位置和立体异构体的通称，两个双键间如果有一个甲基，我们可以称之为甲基隔开的双键，如果有多个甲基，我们称之为多甲基隔开的双键，如果两个双键共轭结合在一起，我们称之为共轭脂肪酸。共轭脂肪酸可以是双烯、三烯或四烯的形式，最普通的共轭脂肪酸是十八碳二烯酸和十八碳三烯酸，也就是共轭亚油酸(conjugated linoleic acid,CLA)和共轭亚麻酸(conjugated linolenic acid,CLNA)。共轭亚麻酸由于双键位置和构型不同而具有多种异构体，石榴酸(Punicic acid)又名栝楼酸，因其分别从石榴籽和栝楼籽中所发现的，但后来鉴定为同一种物质，现统一称为石榴酸，石榴酸为9，11，13位双键共轭，9位和13位双键构型为顺式，11位双键构型为反式的共轭亚麻酸(9c，11t，13c CLNA)。石榴酸与9c,11t CLA(9，11位双键共轭，9位双键构型为顺式，11位双键构型为反式，共轭亚油酸最重要的一种异构体)的相似之处在于他们的脂肪酸链第9位和第11位都是不饱和的双键，且立体构型相同。石榴酸在动物和人体内能转换为9c,11t CLA，因此可以作为9c,11t CLA重要的天然饮食来源(Tsuzuki等，2006)。
共轭脂肪酸具有与常规的多不饱和脂肪酸不同的特殊生理功能。据报道，CLA具有很多有利的生理功能，如改善人和动物血脂，抗动脉粥样硬化，抗肥胖，抗癌，抗高血压的作用(Rainer等，2004)。CLA已经在全世界，特别是欧美国家作为减肥、降血脂等功能食品和保健品得到广泛应用。CLA主要存在奶脂类、奶酪和反刍动物肉中。然而，CLA在这些食物中含量只有约1％(Sehat等，1998)，这使它不可能用自然资源存在的CLA来作含CLA的促进健康的食品或药品。商业上应用的CLA是通过把富含油酸的油异构化而得到的，这种异构化产物通常包含等摩尔的9c,11t-CLA和10t,12c-CLA(Pariza等，2001)以及其他异构体。消费者对工业化制备的CLA存在安全等方面的考虑，CLA工业化生产价格成本较高，且工业化制备的CLA有多种异构体形式，而并不是每种异构体都具有对人体有益的功能。
石榴酸与9c,11t-CLA的关键不同之处在于石榴酸的第三个不饱和的双键，石榴酸在脂肪酸链的第13位有一个顺式的双键。所以，石榴酸又具有“多不饱和脂肪酸”的特 征。多不饱和脂肪酸具有重要的营养价值，对人和动物体内甘油三酯和胆固醇具有有益的作用，能降低心脑血管疾病的危险，促进生长和发育。目前，多不饱和脂肪酸广泛用于添加到婴儿食品中来促进婴儿的生长发育和智力的发展。
研究发现共轭亚麻酸主要异构体石榴酸具有抗癌，预防和治疗肥胖等代谢综合症，提高免疫力等功能，如美国专利(US8258188B2)利用石榴酸高机体免疫功能和治疗和与预防炎症及炎症相关代谢综合征如炎性肠病等，美国专利(US 20080146664 A1)利用石榴酸和石榴酸酯治疗机体脂肪过多导致的相关疾病，美国专利(US 8367072 B2)利用富含石榴酸的石榴籽油与fucoxanthin结合处理治疗肥胖。
技术实现要素：
本发明所要解决的第一个技术问题是针对现有技术而提供一种富含石榴酸的甘油二酯油组合物。
本发明所要解决的第二个技术问题是针对现有技术而提供一种上述富含石榴酸的甘油二酯油组合物的制备方法。
本发明所要解决的第三个技术问题是针对现有技术而提供一种上述富含石榴酸的甘油二酯油组合物的应用。
本发明解决第一个技术问题所采用的技术方案为：一种富含石榴酸的甘油二酯油组合物，其特征在于，该甘油二酯油组合物按质量百分数计由以下组分构成：55～85％的甘油二酯、10～45％的甘油三酯、0.2～8％的甘油一酯和0.03～9％的残留物，由上述甘油一酯、甘油二酯及甘油三酯组成的全部甘油酯中石榴酸与脂肪酸的质量比为0.3～0.7:1，所述残留物为游离脂肪酸和甘油。
本发明解决第二个技术问题所采用的技术方案为：上述方案中的富含石榴酸的甘油二酯油组合物的制备方法包括以下步骤：
第一步，石榴酸的提取：
(1)预处理：将石榴籽或瓜蒌籽清洗、沥干，40～60℃下干燥；
(2)石榴酸甘油三酯提取：干燥后的石榴籽或瓜蒌籽粉碎后得干粉，干粉经溶剂萃取超临界萃取或直接冷压压榨得石榴酸甘油三酯粗提物，石榴酸甘油三酯粗提物经脱胶、脱酸、脱色、脱臭、脱腊后精炼制得石榴酸甘油三酯；
(3)石榴酸的制备：将所述步骤(2)中制得的石榴酸甘油三酯经皂化、酸化后得到石榴酸；
(4)纯化：将步骤(3)获得的石榴酸和石榴酸酯溶解在有机溶剂中，由两步冷冻结晶法分离得到纯度分别为95～98％的石榴酸；
第二步，将上述提取的石榴酸与甘油以2～9:1的比例混合形成混合物，在该混合物中加入lipozyme RMIM在真空下进行酶催化反应制得富含石榴酸的甘油二酯油组合物 粗品，反应温度为30～60℃，反应时间8～12h，所述混合物与lipozyme RMIM的质量比为200～500:1；
第三步，对上述制得的富含石榴酸的甘油二酯油组合物粗品通过分子蒸馏分离脂肪酸和甘油一酯，然后再采用脱色、脱臭和过滤的方法精制获得所需的富含石榴酸的甘油二酯油组合物。
作为优选，所述步骤(2)中的萃取溶剂为正己烷、石油醚、乙醚、乙醇、甲醇、氯仿、正丁醇、丙酮、环己烷中的一种或几种混合物。
作为优选，所述两步结晶法包括第一步结晶和第二步结晶，该第一步结晶的结晶温度为4℃，结晶时间为8～16h，结晶压力为常压；第二步结晶的结晶温度为-20℃～-70℃，结晶次数为3-5次，每次结晶时间为8～16h，结晶压力为常压。
本发明解决第三个技术问题所采用的技术方案为：该富含石榴酸的甘油二酯油组合物在功能食品和药物中的应用，所述功能食品和药物至少用于控制体重、改善血脂或提高免疫力中的其中一方面。
与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明中的富含石榴酸的甘油二酯油组合物以甘油二酯形式与石榴酸组合，与常规的甘油二酯产品相比，可增强对脂肪积聚的预防效果，从而达到控制体重的目的，并且该组合物除具有油的结构稳定性外还具有石榴酸的各种营养成分和生理学优点，因此使得以该组合物为活性成分制备的产品与常规产品相比更具优越性，尤其是既具有甘油二酯的减肥功效，同时也具有石榴酸的抗炎、减肥等功效，因而使得该组合物可大量应用于控制体重、改善血脂以及提高免疫力的功能食品和药物中。同时，该组合物的制备过程中，以石榴籽或瓜蒌籽为原料制备石榴酸，原料来源丰富，食用安全性高，且制得的石榴酸纯度高达94～97％，总之，该组合物的制备工艺简单，成本低，具有广阔的应用前景。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明作进一步详细描述。
实施例1：
收集石榴籽，在40℃烘箱烘干后粉碎得干粉1000g，以5倍体积的石油醚在低于60℃下回流提取6h后得到绿色的甘油三酯粗提物，出油率为28.2％。取甘油三酯粗提物50mL加入2M 90％的氢氧化钾乙醇溶液200mL于氮气保护下60℃下皂化2h，加入50mL水后再加入50mL石油醚三次抽提除去不皂化合物，再加入6M盐酸100mL中和酸化后用石油醚抽提去上层得到石油醚溶液，再经过真空旋转蒸发后得到石榴酸粗提物。石榴酸粗提物溶解在乙醇中，常压下4℃结晶8h除去饱和脂肪酸，得到的乙醇溶液进一步在常压下于零下20℃结晶16h，重复3次冷冻结晶分离得到高纯度的石榴酸。本实施例中 采用上述工艺制得的石榴酸经气相色谱分析纯度达97％。
将上述提取的石榴酸与甘油以2:1的比例混合形成混合物，在该混合物中加入lipozyme RMIM(丹麦诺维信公司)在真空下进行酶催化反应制得富含石榴酸的甘油二酯油组合物粗品，反应温度为30℃，反应时间10h，上述混合物与lipozyme RMIM的质量比为200:1。对上述制得的富含石榴酸的甘油二酯油组合物粗品通过分子蒸馏分离脂肪酸和甘油一酯，再采用脱色、脱臭和过滤的方法精制获得所需的富含石榴酸的甘油二酯油组合物。
经检测，本实施例制备的富含石榴酸的甘油二酯油组合物按质量分数计由以下组分构成：55％的甘油二酯、28％的甘油三酯、8％的甘油一酯和9％的残留物，由上述甘油一酯、甘油二酯及甘油三酯组成的全部甘油酯中石榴酸与脂肪酸的质量比为0.3:1，上述残留物为游离脂肪酸和甘油。
实施例2：
收集瓜蒌籽，太阳光下自然风干后粉碎得粒径0.4～0.5mm的干粉1000g，在30MPa、40℃条件下采用超临界CO2萃取(江苏南通市华安超临界萃取装置生产的HA221-50-06型超临界萃取装置)2h，在分离压力15MPa、分离温度50℃下得到绿色的甘油三酯粗提物(毛油)，出油率为30.2％；毛油经脱胶、脱酸、脱色、脱臭、脱腊后精炼制得甘油三酯。取甘油三酯粗提物50mL加入2M 90％的氢氧化钾乙醇溶液200mL于氮气保护下60℃下皂化2h，加入50mL水后再加入50mL石油醚三次抽提除去不皂化合物，再加入6M盐酸100mL中和酸化后用石油醚抽提去上层得到石油醚溶液，再经过真空旋转蒸发后得到石榴酸粗提物。石榴酸粗提物溶解在丙酮中，常压下4℃结晶8h除去饱和脂肪酸，再在常压下于零下45℃结晶8h，重复5多次冷冻结晶分离得到高纯度的石榴酸。本实施例中采用上述工艺制得的石榴酸经气相色谱分析纯度达94％。
将上述提取的石榴酸与甘油以9:1的比例混合形成混合物，在该混合物中加入lipozyme RMIM(丹麦诺维信公司)在真空下进行酶催化反应制得富含石榴酸的甘油二酯油组合物粗品，反应温度为60℃，反应时间12h，上述混合物与lipozyme RMIM的质量比为500:1。对上述制得的富含石榴酸的甘油二酯油组合物粗品通过分子蒸馏分离脂肪酸和甘油一酯，再采用脱色、脱臭和过滤的方法精制获得所需的富含石榴酸的甘油二酯油组合物。
经检测，本实施例制备的富含石榴酸的甘油二酯油组合物按质量分数计由以下组分构成：70％的甘油二酯、19％的甘油三酯、5％的甘油一酯和6％的残留物，由上述甘油一酯、甘油二酯及甘油三酯组成的全部甘油酯中石榴酸与脂肪酸的质量比为0.7:1，上述残留物为游离脂肪酸和甘油。
实施例3：
收集石榴籽，在40℃烘箱烘干后粉碎得干粉1000g，以5倍体积的氯仿和甲醇混合溶液(体积比为1：1)在室温下浸提24h后得到绿色的石榴酸甘油三酯粗提物，出油率为29.7％。取甘油三酯粗提物100mL加入2M 90％的氢氧化钠乙醇溶液400mL于氮气保护下60℃下皂化2h，加入1000mL水后再加入100mL石油醚三次抽提除去不皂化合物，再加入6M盐酸200mL中和酸化后用石油醚抽提去上层得到石油醚溶液，石榴酸粗提物在常压下4℃结晶10h除去饱和脂肪酸，然后再在常压下于零下40℃结晶12h，重复4次冷冻结晶分离得到高纯度的石榴酸。本实施例中采用上述工艺制得的石榴酸经气相色谱分析纯度达96％。
将上述提取的石榴酸与甘油以6:1的比例混合形成混合物，在该混合物中加入lipozyme RMIM(丹麦诺维信公司)在真空下进行酶催化反应制得富含石榴酸的甘油二酯油组合物粗品，反应温度为45℃，反应时间8h，上述混合物与lipozyme RMIM的质量比为300:1。对上述制得的富含石榴酸的甘油二酯油组合物粗品通过分子蒸馏分离脂肪酸和甘油一酯，再采用脱色、脱臭和过滤的方法精制获得所需的富含石榴酸的甘油二酯油组合物。
经检测，本实施例制备的富含石榴酸的甘油二酯油组合物按质量分数计由以下组分构成：85％的甘油二酯、10％的甘油三酯、0.2％的甘油一酯和4.8％的残留物，由上述甘油一酯、甘油二酯及甘油三酯组成的全部甘油酯中石榴酸与脂肪酸的质量比为0.5:1，上述残留物为游离脂肪酸和甘油。
实施例4：
收集瓜蒌籽，太阳光下自然风干后粉碎得粒径0.4～0.5mm的干粉1000g，以5倍体积的石油醚在低于80℃下回流提取6h后得到石榴酸甘油三酯粗提物，出油率为28.8％。石榴酸甘油三酯粗提物经脱胶、脱酸、脱色、脱臭、脱腊后精炼制得甘油三酯。取甘油三酯粗提物50mL加入2M 90％的氢氧化钾乙醇溶液200mL于氮气保护下60℃下皂化2h，加入50mL水后再加入50mL石油醚三次抽提除去不皂化合物，再加入6M盐酸100mL中和酸化后用石油醚抽提去上层得到石油醚溶液，再经过真空旋转蒸发后得到石榴酸粗提物。石榴酸粗提物溶解在丙酮中，常压下4℃结晶8h除去饱和脂肪酸，再在常压下于零下45℃结晶8h，重复5多次冷冻结晶分离得到高纯度的石榴酸。本实施例中采用上述工艺制得的石榴酸经气相色谱分析纯度达94％。
将上述提取的石榴酸与甘油以4:1的比例混合形成混合物，在该混合物中加入lipozyme RMIM(丹麦诺维信公司)在真空下进行酶催化反应制得富含石榴酸的甘油二酯油组合物粗品，反应温度为40℃，反应时间10h，上述混合物与lipozyme RMIM的质量比为200:1。对上述制得的富含石榴酸的甘油二酯油组合物粗品通过分子蒸馏分离脂 肪酸和甘油一酯，再采用脱色、脱臭和过滤的方法精制获得所需的富含石榴酸的甘油二酯油组合物。
经检测，本实施例制备的富含石榴酸的甘油二酯油组合物按质量分数计由以下组分构成：53.97％的甘油二酯、45％的甘油三酯、1％的甘油一酯和0.03％的残留物，由上述甘油一酯、甘油二酯及甘油三酯组成的全部甘油酯中石榴酸与脂肪酸的质量比为0.4:1，上述残留物为游离脂肪酸和甘油。
实施例5：
5.1、富含石榴酸(Punicic acid)的甘油二酯油组合物对体重的控制作用
任取由上述实施例1～4中所制备的富含石榴酸的甘油二酯油组合物进行动物实验，研究该组合物对体重和体脂的增加是否具有抑制作用。
6周龄的雄性ICR小鼠由浙江省实验动物中心提供，ICR小鼠适应7天后随机分为2组，每组10只。接下来6个星期，2组小鼠除给喂饲料外，分别以富含石榴酸的甘油二酯油组合物和石榴酸甘油三酯油(其石榴酸含量为78％)每天50mg/kg体重的用量一次经口灌胃给各小鼠，每两周测定各小鼠的体重，所测体重的平均值如表1所示。从表1可以看出，与石榴酸甘油三酯油组相比，富含石榴酸的甘油二酯油组合物能显著抑制小鼠体重增加速度，控制体重的增长。
表1 富含石榴酸的甘油二酯油组合物对小鼠体重的影响
5.2、对血脂的影响
任取由上述实施例1～4中所制备的富含石榴酸的甘油二酯油组合物进行动物实验，研究该组合物对血脂是否有改善作用。
6周龄的雄性ICR小鼠由浙江省实验动物中心提供，ICR小鼠适应7天后随机分为2组，每组10只。接下来6个星期，2组小鼠除给喂饲料外，分别以富含石榴酸的甘油二酯油组合物和石榴酸甘油三酯油(其石榴酸含量为78％)每天50mg/kg体重的用量一 次经口灌胃给各小鼠，实验结束后取雪测定测定小鼠血脂。所测血脂的平均值如表2所示。从表2可以看出，与石榴酸甘油三酯油组相比，富含石榴酸的甘油二酯油组合物能显著提高小鼠高密度脂蛋白胆固醇含量(HDL-C)，降低低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)含量，提高LDL-C与HDL-C的比值，这表明富含石榴酸的甘油二酯油组合物能显著改善小鼠血脂。
表2 富含石榴酸的甘油二酯油组合物对小鼠血脂的影响