双胍类药物在制备预防或减弱肺纤维化的药物中的应用的制作方法

本发明属于医药用途领域，特别涉及双胍类药物在制备预防或减弱肺纤维化的药物中的应用。

背景技术：

肺癌是全球范围内发病率和死亡率最高的恶性肿瘤。非小细胞肺癌(Non Small Cell Lung Cancer，NSCLC)占所有肺癌病例的80％-85％；表皮生长因子受体(Epidermal growth factor receptor，EGFR)和间变性淋巴瘤激酶(anaplasticlymphoma kinase，ALK)在NSCLC的发生发展过程中起着重要作用。EGFR酪氨酸激酶抑制剂(Tyrosine kinase inhibitor，TKI)和ALK-TKI为代表的靶向药物对特定NSCLC患者取得了显著的疗效，但是研究人员发现，TKI治疗过程中会出现严重的并发症--间质性肺炎；目前临床上尚无有效的预防EGFR-TKI和ALK-TKI引起间质性肺炎的措施。因此，发现有效预防间质性肺炎的措施对于改善TKI的安全应用、改善患者预后具有非常重要的科学意义和临床价值。

经研究表明，肺纤维化是间质性肺炎最基本的病理改变，其发病机制主要包括成纤维细胞的聚集和细胞外基质过量沉积等。目前临床上多数是通过预防或减弱肺纤维化的产生，来预防间质性肺炎的发生。

以二甲双胍为代表性的双胍类药物广泛用于2型糖尿病的治疗；随着研究的不断深入，CN103371991还公开了二甲双胍具有预防或治疗 肝细胞癌的作用；CN103446080公开了二甲双胍具有降低乙型肝炎病毒表面抗原水平的作用；CN102743364公开了二甲双胍具有治疗帕金森病的作用，等。

目前尚未发现有文献报道以二甲双胍为主的双胍类药物在制备预防或减弱肺纤维化的药物中的应用。

技术实现要素：

本发明提供一种双胍类药物的新用途，即双胍类药物在制备预防或减弱肺纤维化的药物中的应用。

本发明提供的双胍类药物可预防或减弱肺纤维化，进一步可起到预防或减缓间质性肺炎的发生和发展。

本发明的双胍类药物选自二甲双胍及其盐、苯乙双胍或氯胍。

双胍类药物优选二甲双胍时，对肺纤维化尤其是间质性肺炎的预防和减弱效果更加显著。

其中，所述肺纤维化是由EGFR-TKI或ALK-TKI治疗非小细胞肺癌时引起的。

EGFR-TKI或ALK-TKI在治疗NSCLC患者中会出现严重的并发症--间质性肺炎；肺纤维化是间质性肺炎最基本的病理改变；为了有效地控制间质性肺炎的发生和发展，预防或减弱肺纤维化的发生，是改善EGFR-TKI或ALK-TKI治疗过程中的隐患，使其用药更安全的有效措施。本发明通过大量的实验得出，双胍类药物可预防或减弱肺纤维化的发生。

EGFR-TKI类药物包括很多，本发明的EGFR-TKI选自第一代的吉非替尼、厄洛替尼或埃克替尼；第二代的阿法替尼；及第三代的AZD9291、CO-1686或HM61713；ALK-TKI选自克唑替尼或色瑞替尼。

优选地，所述EGFR-TKI为吉非替尼。

本发明意外的发现，当二甲双胍的使用剂量范围为250-2000mg时，优选为500-1000mg；其对肺纤维化的减弱和预防效果更明显。

更进一步的是，当二甲双胍的使用剂量为750mg时，其对肺纤维化的减弱和预防效果最明显。

本发明另一方面提供了二甲双胍和辅料制成的缓释制剂，该缓释制剂也可预防或减弱肺纤维化。

优选的缓释制剂为缓释片，该缓释片包括二甲双胍和辅料；所用辅料包括麦芽糖醇、月桂酸、缓释材料、崩解剂和润滑剂，其中，缓释材料为甲基丙烯酸甲酯和山梨醇酐三硬脂酸酯的混合物，崩解剂为微晶纤维素和刺梧桐胶的混合物，润滑剂为硬脂酸镁，所述缓释片各成分的重量份如下：

本发明提供的二甲双胍缓释片加入了麦芽糖醇和月桂酸的混合物，可使该缓释片具有很好的稳定性，经过加速试验及长期试验验证 该缓释片的性状、含二甲双胍的量、有关物质、崩解时限及溶出度均没有变化；在缓释片中加入甲基丙烯酸甲酯和山梨醇酐三硬脂酸酯混合物的缓释材料，使该缓释片在1、2、6、12和24小时的累积溶出百分率分别达到33-35％、68-70％、80-82％、87-89％和90％以上，该缓释片具有释药平稳、缓慢释药的效果，并且能够达到24h释药；在缓释片内加入的微晶纤维素和刺梧桐胶能够使该缓释片快速崩解，崩解时限在10min内，到达体内迅速起效。

本发明的有益效果在于：

1.本发明提供一种双胍类药物的新用途，该双胍类药物可用于预防或减弱肺纤维化，双胍类药物不但可以显著减弱转化生长因子β(TGF-β)引起的肺纤维化，还可以显著EGFR-TKI或ALK-TKI治疗非小细胞肺癌时产生的肺纤维化，同时可以显著减弱EGFR-TKI或ALK-TKI加重的博来霉素引起的肺纤维化；从而起到预防或减缓间质性肺炎的效果，其可避免EGFR-TKI或ALK-TKI治疗非小细胞肺癌时产生的并发症，有效地提高EGFR-TKI或ALK-TKI的治疗效果，减少患者并发症的发生及发。

附图说明

图1为免疫荧光技术检测肺纤维化指标α-actin表达的结果；

图2为采用western blot技术检测肺纤维化标志物α-actin及COL1A1的表达及检测TGF-β下游关键信号通路蛋白的表达的结果；

图3为免疫荧光技术检测纤维化指标α-actin表达的结果；

图4为western blot技术检测纤维化标志物α-actin及COL1A1的表达，检测TGF-β下游关键信号通路蛋白的表达的结果；

图5为HE染色及Masson染色的结果；

图6为Elisa方法检测羟脯氨酸含量的结果；

图7为免疫组化检测α-actin表达的结果；

图8为western blot检测COL1A1、α-actin及TGF-β下游关键信号通路蛋白的表达的结果。

具体实施方式

实施例1 一种二甲双胍缓释片

按照常规的方法制备。

实施例2 一种二甲双胍缓释片

按照常规的方法制备。

动物实验

实验例1 二甲双胍显著减弱转化生长因子β(TGF-β)引起的肺纤维化的研究

1.1 实验方法

将肺成纤维细胞株HFL-1随机分成四组，分别为对照组，TGF-β组、二甲双胍组和TGF-β+二甲双胍组；

对照组无特殊处理；TGF-β组给予TGF-β处理(10μg/L，作用时间48h)；二甲双胍组给予二甲双胍处理(10μM，作用时间48h)；TGF-β+二甲双胍组给予TGF-β联合二甲双胍处理(10μg/L+10μM，作用时间48h)；

48h后，采用免疫荧光技术检测肺纤维化指标α-actin的表达；采用western blot技术检测肺纤维化标志物α-actin、COL1A1及TGF-β下游关键信号通路蛋白的表达。

1.2 实验结果

从图1中可以看出，与对照组相比，TGF-β处理的肺成纤维细胞株HFL-148h后，α-actin蛋白的表达明显增加；而只给予二甲双胍处理后，α-actin蛋白的表达没有明显变化；与TGF-β组比较，TGF-β联合二甲双胍处理后，α-actin蛋白的表达显著降低；由此得出，二甲双胍可显著减弱转化生长因子β(TGF-β)引起的肺纤维化标志物α-actin蛋白的表达。

从图2中可以看出，与对照组相比，TGF-β处理的肺成纤维细胞株HFL-148h后，COL1A1、α-actin、pSmad3、pSTAT3、pAKT和dpERK1/2蛋白的表达明显增加；而只给予二甲双胍处理后，这些蛋白的表达明显降低；与TGF-β组比较，TGF-β联合二甲双胍处理后，COL1A1、α-actin、pSmad3、pSTAT3、pAKT和dpERK1/2蛋白的表达显著降低； 由此得出，二甲双胍可显著减弱转化生长因子β(TGF-β)引起的肺纤维化标志物α-actin和COL1A1蛋白的表达，显著抑制TGF-β信号通路关键下游蛋白的表达，显著抑制肺纤维化的关键机制。

1.3 结论

从以上可以得出二甲双胍能够显著减弱转化生长因子β(TGF-β)引起的肺纤维化。

实验例2 二甲双胍显著减弱吉非替尼刺激引起的肺纤维化的研究

2.1 实验方法

将肺成纤维细胞株HFL-1分为6组，分别为对照组，P9-CM组，P9-CM+吉非替尼组，P9-CM+吉非替尼+二甲双胍组，R9-CM组，R9-CM+二甲双胍组；

对照组无特殊处理；P9-CM组给予来自PC-9细胞的条件培养基处理细胞48h；PC-9+吉非替尼组给予来自吉非替尼30μM处理的PC-9细胞的条件培养基处理细胞48h；PC-9+吉非替尼+二甲双胍组给予来自吉非替尼30μM处理的PC-9细胞的条件培养基联合二甲双胍20μM处理细胞48h；R9-CM组给予来自PC-9GR细胞的条件培养基处理细胞48h；R9-CM+二甲双胍组给予来自PC-9GR细胞的条件培养基联合二甲双胍20μM处理细胞48h；

48h后，采用免疫荧光技术检测纤维化指标α-actin的表达；采用western blot技术检测纤维化标志物α-actin、COL1A1及TGF-β下游关键信号通路蛋白的表达。

2.2 实验结果

从图3中可以看出，与对照组相比，经过P9-CM组、R9-CM组和P9-CM+吉非替尼组处理的HFL-1细胞48h后，α-actin蛋白的表达明显增加；与P9-CM组比较，经过P9-CM+吉非替尼组处理的HFL-1细胞48h后，α-actin蛋白的表达也明显增加，由此得出，吉非替尼不但能够显著提高肺纤维化标志物α-actin蛋白的含量，并且能够进一步 提高P9-CM组处理后的HFL-1细胞内的α-actin蛋白的含量；与P9-CM+吉非替尼组比较，经过P9-CM+吉非替尼+二甲双胍组处理后的HFL-1细胞，α-actin蛋白的表达显著降低；与R9-CM组比较，经过R9-CM+二甲双胍组处理后的HFL-1细胞，α-actin蛋白的表达显著降低；由此得出，二甲双胍不但可以显著减弱来自PC-9细胞株的条件培养基和来自PC-9GR细胞株的条件培养基引起的肺纤维化标志物α-actin蛋白的表达；而且能够显著减弱吉非替尼刺引起的肺纤维化标志物α-actin蛋白的表达。

从图4中可以看出，与对照组相比，经过R9-CM组和P9-CM+吉非替尼组处理的HFL-1细胞48h后，COL1A1、α-actin、pSmad2、pSmad3、pSTAT3、pAKT和dpERK1/2蛋白的表达明显增加；与P9-CM组比较，经过P9-CM+吉非替尼组处理的HFL-1细胞48h后，COL1A1、α-actin、pSmad2、pSmad3、pSTAT3、pAKT和dpERK1/2蛋白的表达明显增加；与P9-CM+吉非替尼组比较，经过P9-CM+吉非替尼+二甲双胍组处理后的HFL-1细胞中，COL1A1、α-actin、pSmad2、pSmad3、pSTAT3、pAKT和dpERK1/2蛋白的表达明显降低；与R9-CM组比较，经过R9-CM+二甲双胍组处理后的HFL-1细胞中，COL1A1、α-actin、pSmad2、pSmad3、pSTAT3、pAKT和dpERK1/2蛋白的表达明显降低；由此得出，二甲双胍可显著减弱吉非替尼和来自PC-9GR细胞株的条件培养基引起的肺纤维化标志物α-actin和COL1A1蛋白的表达，显著抑制TGF-β信号通路关键下游蛋白的表达，显著抑制肺纤维化的关键机制。

2.3 结论

从以上可以得出二甲双胍能够显著减弱吉非替尼引起的肺纤维化。

实验例3 二甲双胍显著减弱吉非替尼加重的博来霉素引起的肺纤维化的研究

3.1 实验材料

6周龄健康雄性SD大鼠75只(购自第三军医大学大坪医院实验动物中心)，体重200g-210g；

吉非替尼，购自英国Tocris Bioscience公司；

二甲双胍，购自美国sigma公司；

HE及Masson染色试剂盒，由福州迈新生物技术公司生产；

酶联免疫吸附(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)试剂盒，由武汉优尔生公司生产。

3.2 动物模型的制备及分组

将75只SD大鼠适应性喂养一周以后，按随机数字表的方法分为对照组，博莱霉素组，二甲双胍组，吉非替尼组和吉非替尼二甲双胍联用组，每组各15只；

将75只SD大鼠分别用1％戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后，仰卧固定于鼠板上，颈部去毛后乙醇消毒，纵行切开颈前皮肤，分离组织后暴露气管；

其中，对照组注入无菌生理盐水200μl，其余各组向气管内注入博莱霉素(5mg/kg，5g/L)，注射后迅速将动物直立，旋转，使药液在肺内分布均匀；

各实验组大鼠于气管内注射当天开始还需连续灌胃21天，其中，对照组与博莱霉素组给予生理盐水2ml灌胃，吉非替尼组给予吉非替尼200mg/kg灌胃；二甲双胍组给予二甲双胍300mg/kg灌胃；吉非替尼二甲双胍联用组给予吉非替尼200mg/kg联合二甲双胍300mg/kg灌胃；气管内注射后第21天，杀鼠取肺；

3.3 观察指标

左肺石蜡切片行HE染色及Masson染色；免疫组化检测α-actin的表达；取右肺Elisa方法检测羟脯氨酸含量；western blot检测COL1A1、α-actin及TGF-β下游关键信号通路蛋白的表达。

3.4 实验结果

从图5中可以看出，经HE染色法后，与对照组相比，经过博来霉素组和吉非替尼组处理小鼠的肺后，肺间隔增厚、肺间质水肿及纤维化毛细血管充血量均显著增加；与博来霉素组比较，经过吉非替尼组处理小鼠的肺后，肺间隔增厚、肺间质水肿及纤维化毛细血管充血量也显著增加；与博来霉素组比较，经过二甲双胍组处理小鼠的肺后，肺间隔增厚、肺间质水肿及纤维化毛细血管充血量均显著降低；与吉非替尼组比较，经过吉非替尼二甲双胍联用组处理小鼠的肺后，肺间隔增厚、肺间质水肿及纤维化毛细血管充血量均显著降低；由此得出，二甲双胍可显著降低肺间隔增厚、肺间质水肿及纤维化毛细血管充血，显著减弱肺组织损伤程度；经masson染色可得出，与对照组相比，经过博来霉素组和吉非替尼组处理小鼠的肺后，肺组织纤维化程度加重；与博来霉素组比较，经过吉非替尼组处理小鼠的肺后，肺组织纤维化程度也加重；与博来霉素组比较，经过二甲双胍组处理小鼠的肺后，肺组织纤维化程度明显减弱；与吉非替尼组比较，经过吉非替尼二甲双胍联用组处理小鼠的肺后，肺组织纤维化程度明显减弱；由此得出，二甲双胍显著减弱了肺组织的纤维化程度。

从图6中可以看出，与对照组比较，经过博来霉素组和吉非替尼组处理小鼠的肺后，羟脯氨酸的含量显著增加；与博来霉素组比较，经过吉非替尼组处理小鼠的肺后，羟脯氨酸的含量也显著增加；与博来霉素组比较，经过二甲双胍组处理小鼠的肺后，羟脯氨酸的含量显著降低；与吉非替尼组比较，经过吉非替尼二甲双胍联用组处理小鼠的肺后，羟脯氨酸的含量显著降低；由此得出，二甲双胍可显著降低羟脯氨酸的含量，显著减弱组织胶原沉积。

从图7中可以看出，与对照组相比，经过博来霉素组处理小鼠的肺后，α-actin蛋白的表达明显增加；与博来霉素组相比，经过吉非替尼组处理小鼠的肺后，α-actin蛋白的表达也明显增加，由此得出， 吉非替尼可加重博来霉素引起的肺纤维化标志物α-actin蛋白的表达；与博来霉素组比较，经过二甲双胍组处理小鼠的肺后，α-actin蛋白的表达明显降低；与吉非替尼组比较，经过吉非替尼二甲双胍联用组处理小鼠的肺后，α-actin蛋白的表达显著降低；由此得出，二甲双胍不但可以显著减弱博来霉素引起的肺纤维化标志物α-actin蛋白的表达；而且能够显著减弱吉非替尼加重的博来霉素引起的肺纤维化标志物α-actin蛋白的表达。

从图8中可以看出，与对照组相比，经过博来霉素组和吉非替尼组处理小鼠的肺后，COL1A1、α-actin、pSmad2、pSTAT3、pAKT和dpERK1/2蛋白的表达明显增加；与博来霉素组比较，经过吉非替尼组处理小鼠的肺后，COL1A1、α-actin、pSmad2、pSmad3、pSTAT3和pAKT蛋白的表达明显增加；与博来霉素组相比，经过二甲双胍组处理小鼠的肺后，COL1A1、α-actin、pSmad2、pSTAT3、pAKT和dpERK1/2蛋白的表达明显降低；与吉非替尼组相比，经过吉非替尼二甲双胍联用组处理小鼠的肺后，COL1A1、α-actin、pSmad2、pSTAT3、pAKT和dpERK1/2蛋白的表达明显降低；由此得出，二甲双胍可显著减弱博来霉素引起的肺纤维化标志物α-actin和COL1A1蛋白的表达；而且能够显著减弱吉非替尼加重的博来霉素引起的肺纤维化标志物α-actin和COL1A1蛋白的表达；并且显著抑制TGF-β信号通路关键下游蛋白的表达，显著抑制肺纤维化的关键机制。

3.5 结论

从以上可以得出二甲双胍能够显著减弱博来霉素引起的肺纤维化；并且显著减弱吉非替尼加重的博来霉素引起的肺纤维化。

实验例4 不同剂量的二甲双胍对博来霉素引起的肺纤维化的影响

4.1 实验材料

6周龄健康雄性SD大鼠90只(购自第三军医大学大坪医院实验动物中心)，体重200g-210g；

吉非替尼，购自英国Tocris Bioscience公司；

二甲双胍，购自美国sigma公司；

HE及Masson染色试剂盒，由福州迈新生物技术公司生产；

酶联免疫吸附(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)试剂盒，由武汉优尔生公司生产。

4.2 动物模型的制备及分组

将90只SD大鼠适应性喂养一周以后，按随机数字表的方法分为对照组，博莱霉素组，二甲双胍1组，二甲双胍2组，二甲双胍3组，二甲双胍4组、二甲双胍5组、二甲双胍6组和二甲双胍7组，每组各10只；

将90只SD大鼠分别用1％戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后，仰卧固定于鼠板上，颈部去毛后乙醇消毒，纵行切开颈前皮肤，分离组织后暴露气管；

其中，对照组注入无菌生理盐水200μl，其余各组向气管内注入博莱霉素(5mg/kg，5g/L)，注射后迅速将动物直立，旋转，使药液在肺内分布均匀；

各实验组大鼠于气管内注射当天开始还需连续灌胃21天，其中，对照组与博莱霉素组给予生理盐水2ml灌胃；二甲双胍1组给予二甲双胍200mg灌胃；二甲双胍2组给予二甲双胍250g灌胃；二甲双胍3组给予二甲双胍500mg灌胃；二甲双胍4组给予二甲双胍750mg灌胃；二甲双胍5组给予二甲双胍1000mg灌胃；二甲双胍6组给予二甲双胍2000mg灌胃；二甲双胍7组给予二甲双胍2250mg灌胃气管内注射后第21天，杀鼠取肺；称重，计算肺指数，形态学改变分级肺泡炎和肺纤维化分级。

肺泡炎和肺纤维化程度分为4级：0级无明显变化；1级轻度变化，病变范围小于全肺的20％；2级中度改变，病变范围占全肺的 20-50％；3级重度改变，病变范围占全肺的50％以上。Elisa方法检测羟脯氨酸含量。

4.3 实验结果

不同剂量的二甲双胍对博来霉素引起的肺纤维化的影响见表1。

表1 不同剂量的二甲双胍对博来霉素引起的肺纤维化的影响

与博来霉素组相比，P^*﹤0.05，P^a﹤0.01。

从表中可以看出，二甲双胍1组能够轻微的降低肺指数、纤维化分级及肺组织内羟脯氨酸含量；而二甲双胍2组到二甲双胍7组能够显著降低肺指数、纤维化分级及肺组织内羟脯氨酸含量；即，随着二甲双胍量的增加，肺指数、纤维化分级及肺组织内羟脯氨酸含量降低的越明显，而当二甲双胍的用量达到750mg时，肺指数、纤维化分级及肺组织内羟脯氨酸含量降低的水平已接近于对照组，继续增加量，对肺指数、纤维化分级及肺组织内羟脯氨酸含量影响不大。