GPR35受体激动剂及其应用的制作方法

本发明属于GPR35受体激动剂领域，涉及茜草科蒽醌类化合物作用靶点的发现，具体地说是蒽醌类化合物中羟基茜草素作用靶点的发现。所述蒽醌类化合物为羟基茜草素和它药学上可接受成盐的化合物；所述靶点为GPR35受体；所述应用为治疗哮喘、心力衰竭、高血压、炎症、冠状动脉性心脏病、代谢综合症和疼痛等疾病的预防和治疗。

背景技术：

茜草科植物(Rubia cordifolia L.)的干燥根及根茎中含大量的蒽醌类化合物(Anthraquinone compounds)，种类繁多，结构类型复杂多样，具有行血、止血、通筋活络和止咳祛痰等功效，且表现出多种的药理活性，如抗菌、抗病毒、抗炎、抗过敏、抗氧化、免疫调节、保肝、解热镇痛、抗凝血和抗肿瘤等，但是目前对于此类化合物研究大多集中在细胞水平，对于纯化合物作用靶点研究甚少(Pharmacopoeia of the People’s Republic of China(2010).[S].Vol 1.2010:218–219；许兰芝,赵世琴,胡庆伟,冷萍,高尔.茜草总蒽醌抗炎抗风湿作用及机制.潍坊医学院学报,2002,24(1):11-13；Li X,Liu Z,Chen Y,et al.Rubiacordone A:a new anthraquinone glycoside from the roots of Rubia cordifolia.Molecules,2009,14(1):566-572；Tsang P W,Wong A P,Yang H P,et al.Purpurin triggers caspase-independent apoptosis in Candida dubliniensis biofilms.PloS one,2013,8(12):e86032；Itokawa H,Takeya K,Mihara K,et al.Studies on the Anti-Tumor Cyclic Hexapeptides Obtained from Rubiae Radix.Chem Pharm Bull,1983,31(4):1424-1427；Itokawa H,Ibraheim Z Z,Qiao Y F,et al.Anthraquinones,Naphthohydroquinones and Naphthohydroquinone Dimers from Rubia-Cordifolia and Their Cytotoxic Activity.Chem Pharm Bull,1993,41(10):1869-1872；Rao G M,Rao C V,Pushpangadan P,et al.Hepatoprotective effects of rubiadin,a major constituent of Rubia cordifolia Linn.Journal of ethnopharmacology,2006,103(3):484-490；KastureS B,KastureV S,Chopde C T.Anti-inflammatory activity of Rubia cordifolia roots,1998,1(2):135-153)。

GPR35受体是一个含有309个氨基酸的孤儿受体属于G蛋白偶联受体超家族成员。GPR35受体在包括免疫细胞、结肠、胰腺、小肠和脾脏等各种组织中表达，其中在人结肠癌细胞HT-29细胞中表达水平较高。目前研究表明GPR35受体与哮喘、心力衰竭、高血压、炎症、冠状动脉性心脏病、代谢综合症、疼痛和癌症等疾病相关。GPR35受体的新配体的发现和确认，对于阐明其药理学和生物学功能有非常大的意义，这将为疾病的靶向治疗提供新的方向(O’Dowd B F,Nguyen T,Marchese A,Cheng R,Lynch K R,Heng H H Q,Kolakowski L F,George S R.Genomics 47(1998)310-313；Taniguchi Y,Tonai-Kachi H,Shijo K. FEBS Lett 580(2006)5003-5008；Wang J,Simonavicius N,Wu X,Swaminath G,Reagan J,Tian H,Ling L.J Biol Chem 281(2006)22021-22028；Y Yang,J Y L Lu,X Wu,S Summer,J Whoriskey,C Saris,J D Reagan.Pharmacology 86(2010)1-5；H Deng,Y Fang.Pharmacology 89(2012)211-219；Huayun Deng,Ye Fang.Med Chem Commun 3(2012)1270-1274)。

目前关于茜草科蒽醌类化合物中羟基茜草素作用于GPR35受体的内容尚未见报道。

技术实现要素：

本发明涉及蒽醌类化合物中羟基茜草素及其衍生物的作用靶点的发现及此类化合物的应用，目的之一是提供羟基茜草素及其衍生物的作用靶点为GPR35受体；目的之二是提供此类化合物在临床上的应用范围。

本发明的技术方案为：

所述GPR35受体激动剂为羟基茜草素和/或羟基茜草素对应药学上可接受的盐中的一种或两种以上为活性成分。

羟基茜草素及其衍生物化学结构如下：

所述的对应药学上可接受的盐是指对活生物体基本无毒的本发明化合物的盐，优选的可接受的盐为盐酸盐、钠盐、硫酸盐、钾盐、磷酸盐、钙盐、枸橼酸盐中的一种或两种以上，最佳的可接受的盐为盐酸盐、钠盐中的一种或两种以上。

一种药物组合物，包括所述的GPR35受体激动剂，其中还可添加药学上可接受的载体或赋形剂，对载体或赋形剂的选择不做限制，如：淀粉、氯化钠、微晶纤维素、山梨酸和/或甘露醇等。该组合物的给药方式可以是但不限于经静脉注射、口服、肌肉、皮下、皮肤表面、局部注射等方式给药，其剂型可以但不限于是注射液、冻干粉针剂、注射微球、脂质体、片剂、双层/多层片、口含片、舌下片、胶囊剂、水剂、散剂、糊剂、喷雾剂、颗粒剂、软胶囊、滴丸剂、凝胶剂、贴片、膏剂等，其中优选注射液、冻干粉针剂、片剂和胶囊剂。

本发明所述的蒽醌类化合物在制备预防和/或治疗哮喘、心力衰竭、高血压、炎症、冠状动脉性心脏病、代谢综合症和疼痛等疾病药物中的应用，其中，蒽醌类化合物为羟基茜草素以及羟基茜草素对应的药学上可接受的盐中的一种或两种以上。

所述药物是以羟基茜草素和/或羟基茜草素对应的药学上可接受的盐中的一种或两种以上为活性成分，其中还可添加有药学上可接受的载体或赋形剂。

所述GPR35受体激动剂是以羟基茜草素以及羟基茜草素药学上可接受的盐中的一种或两种以上为活性成分，其中还可添加药学上可接受的载体或赋形 剂。

本发明的有益效果：

体外细胞实验表明，本发明中的羟基茜草素及其衍生物作用于GPR35受体，此受体为G蛋白偶联受体，GPR35受体与哮喘、心力衰竭、高血压、炎症、冠状动脉性心脏病、代谢综合症、疼痛和癌症等疾病相关，根据靶点与疾病的相关性，可以拓宽此化合物的临床应用范围。

附图说明

图1为实施例1在HT-29细胞上的DMR响应；

其中，图1a为10μM羟基茜草素(Purpurin)、1μM敏喘宁(Zaprinast)、10μM羟基茜草素预处理后1μM敏喘宁在HT-29细胞上的50min内最大DMR响应；

图1b为不同浓度的羟基茜草素在HT-29细胞上的DMR响应曲线。

图2为实施例2中羟基茜草素在HT-29细胞上的DMR剂量响应曲线；

其中，图2a为羟基茜草素(Purpurin)、羟基茜草素预处理1h后1μM的敏喘宁(Zaprinast)在HT-29细胞上的剂量响应曲线；图2b为不同浓度的ML145预处理10min后羟基茜草素在HT-29细胞上的DMR剂量响应曲线。

具体实施方式

现结合实例(羟基茜草素)，对本发明做进一步说明，实例仅限于说明本发明，而非对本发明的限定。

实施例1：蒽醌类化合物羟基茜草素作用于GPR35受体的发现

HT-29细胞购于中国科学院上海细胞库；敏喘宁购于Sigma公司；ML145购于Tocris公司。检测平台为康宁第三代成像仪，检测的信号为细胞动态质量重置(DMR)引起的波长位移。

将处于对数生长期的HT-29细胞接种到384孔生物感应器微型板中，每孔接种细胞悬液的体积为40μL，每孔接种的细胞数目为3.2×10⁴个，然后将384孔板置于细胞培养箱(5％的CO₂、37℃)中培养22-24h，当细胞融合度达95％左右时，进行实验。

首先，分别实时监测10μM的羟基茜草素和1μM的敏喘宁在HT-29细胞上引起的DMR响应信号，然后选择部分前述的10μM羟基茜草素，向其中加入1μM的敏喘宁继续监测，以50min内检测到的最大DMR响应信号为纵坐标作图，如图1a。敏喘宁是一个已知的GPR35受体激动剂，以其作为阳性对照比较羟基茜草素的激动活性。结果表明，10μM的羟基茜草素在HT-29细胞上引起的DMR响应信号为敏喘宁(1μM)的86％，而HT-29细胞经10μM的羟基茜草素处理后，再用1μM的敏喘宁处理时引起的DMR响应信号只有敏喘宁单独作用时的9％。这说明羟基茜草素与敏喘宁可能作用于同一受体——GPR35受 体，因此我们对其激动活性进行了量效关系考察。

激动分析：将羟基茜草素(最高工作浓度100草素，2倍稀释，9个浓度梯度)加入已接种HT-29细胞的384孔生物感应器微型板中，在系统上监测1h，得羟基茜草素的DMR响应曲线(图1b)。结果表明羟基茜草素引起的DMR响应信号呈剂量依赖性，其EC50值为6.142量依赖性，其起的能作，且响应曲线类型与GPR35受体激动剂敏喘宁一致。

实施例2：蒽醌类化合物羟基茜草素作用于GPR35受体的验证

我们通过脱敏分析和拮抗分析验证了羟基茜草素对GPR35受体的激动活性。

脱敏分析：将羟基茜草素(最高工作浓度100草素，2倍稀释，14个浓度梯度)加入已接种HT-29细胞的384孔生物感应器微型板中，在系统上监测1h，再加入敏喘宁(工作浓度1μM)继续监测1h，以羟基茜草素的对数剂量对1μM敏喘宁的DMR响应作图，如图2a。从图中可以看出，用羟基茜草素单独处理时引起剂量依赖性DMR响应信号，继续加入固定浓度的敏喘宁处理，GPR35受体对激动剂敏喘宁的敏感性下降而显示出脱敏现象，且羟基茜草素浓度越高脱敏越明显，呈剂量依赖性，其IC50值为3.668±0.189μM。这说明羟基茜草素与敏喘宁作用于同一靶点，GPR35受体。

拮抗分析：以ML145(最高工作浓度32μM，2倍稀释，14个浓度梯度)预处理HT-29细胞10min，然后加入羟基茜草素(200μM)继续监测1h，结果如图2b所示。ML145为GPR35受体的拮抗剂，以ML145处理后，ML145呈剂量依赖性地拮抗羟基茜草的激动活性，其IC50值为3.931±0.267μM。这进一步说明羟基茜草素的作用靶点为GPR35受体。

通过激动、脱敏和拮抗分析三个实验表明GPR35受体是羟基茜草素的作用靶点。目前研究表明GPR35受体与疼痛、高血压、糖尿病、早发性炎症性疾病、炎症、哮喘以及癌症等疾病相关，根据靶点与疾病的相关性，可以拓宽此化合物的临床应用范围。