本发明属于微生物次生代谢产物应用技术领域，具体涉及狭旋毛壳次生代谢产物可皆霉素在制备抗凝血药物中的应用。
背景技术：
狭旋毛壳（Chaetomium angustispirale）属于子囊菌门毛壳属真菌，世界性分布，具有重要的经济学价值和生态意义。研究表明：毛壳菌作为生防菌能够在防治植物病害方面发挥积极作用，且多数具有降解纤维素的能力，此外毛壳菌还具有重要的医学价值。从美登木植物中分离出的内生毛壳菌的代谢过程中，可产生具有显著抗癌作用的毛壳甲素。可皆霉素为狭旋毛壳（保藏分类学名称为狭旋毛壳CLC001，保藏号为CCTCC NO：M 2016231，保藏于中国典型培养物保藏中心）的次生代谢产物，分子式为C32H30N2O4；分子量：506.22；CAS登录号：11051-88-0，结构式为
。
血栓栓塞性疾病的防治问题一直是近年来的研究热点。血栓形成，即局部血液凝块形成，是导致心肌梗死和中风等动脉疾病以及静脉血栓栓塞性疾病（包括深部静脉血栓形成和肺栓塞）发生和患者死亡的主要原因，而药物治疗在防治过程中起着重要的作用，抗血栓形成药物可按作用机制分为抗凝血药物、抗血小板药物和直接溶血栓药物等，临床上均能用于预防和治疗血栓形成。其中抗凝血药物是通过影响凝血因子，从而阻止血液凝固过程的药物，临床主要用于血栓栓塞性疾病的预防与治疗。
凝血四项的测定是判断机体止血与凝血系统病理变化的重要指标，是临床上最常用的、最基本的凝血系统的筛选试验也是临床溶栓、抗凝治疗及手术前的必要检查项目，其测定结果分别反映体内外源性凝血途径、内源性凝血途径和凝血共同途径的状况。凝血四项包括凝血酶原时间（PT）、活化部分凝血活酶时间（APTT）、凝血酶时间（TT）、纤维蛋白原（FIB）。
目前临床应用的抗凝血药物主要可以分为直接抗凝血药(如肝素、低分子肝素、肝素类似物、直接血栓抑制剂) 和间接抗凝血药( 如香豆素、茚满二酮衍生物)。然而，天然产物分离原料稀少，纯度低，很少能够进入工业化生产；以天然产物为母体通过化学合成的方法进行修饰，可加强对酶的亲和特异性，但是对人体的毒副作用大。微生物代谢提取药物是利用菌株自身的天然产物合成途径产生比较复杂的大分子产物，生产可达工业化，人体副作用很少，且具有可持续发展性。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种狭旋毛壳次生代谢产物可皆霉素在制备抗凝血药物中的应用。
狭旋毛壳利用自身独特的生物合成途径产生大量次生代谢产物可皆霉素，可实现工业化生产，且具有可持续发展性。可皆霉素能够极显著地延长TT(P<0.001)，且能极显著地降低FIB(P<0.001)，说明其通过延长凝血酶时间以及降低血浆中纤维蛋白原的含量来抑制血液的凝固，具有开发为抗凝血药物的潜在价值。
具体实施方式
实施例1
1.1 实验动物
獭兔，雄性，体重2.0~2.5 kg，动物适应性饲养一周。温度25±2 ℃，光照12 小时/天，湿度在40~45 %，自由饮水摄食。
1.2 仪器试剂
HF6000-4半自动凝血分析仪(南方汉方医疗器械有限公司)；TGL-16gR高速台式冷冻离心机(上海安亭科学仪器厂)；电子天平（美国Mettle-Toledo公司），氯化钠注射液(河北天成药业股份有限公司，A14091701)；0.109 mol/L枸橼酸钠溶液(自制)、维生素K1注射液(天津药业集团新郑股份有限公司，1403112)；注射用灯盏花素(湖南恒生制药有限公司，20110202)；凝血酶原时间(PT)测定试剂盒(105241)；活化部分凝血酶时间(APTT)测定试剂盒(112175)；凝血酶时间(TT)测定试剂盒(121132)；纤维蛋白原(FIB)含量测定试剂盒(1320701)均由上海太阳生物技术有限公司生产。
1.3 试验方法
1.3.1 样品溶液的配制
精密称取1 mg可皆霉素溶解于80 μL溶剂(DMSO:Tween80:生理盐水=10%：5%：85%)制得浓度为12.5 mg/mL的可皆霉素溶液。精密称取灯盏花素8 mg溶解于240 μL溶剂制得浓度为33.33 mg/mL的灯盏花素溶液。维生素K1的浓度与可皆霉素浓度相同。
1.3.2 APTT的检测方法
獭兔耳缘静脉取血3.6 mL，置于含有400 μL浓度为0.109 mol/L的枸橼酸钠的离心管中，轻轻颠倒混匀，3000 rpm离心15 min，取上层清液备用。在测试杯中加入25 μL样品溶液，再加入100 μL血浆和37 ℃预温的APTT试剂100 μL，于37 ℃孵育5 min后加入37 ℃预温下的0.025 mol/L CaCl2溶液100 μL，记录凝固时间，即为APTT值。
1.3.3 PT的检测方法
血浆制备方法同1.3.2项下方法。在测试杯中加入25 μL的样品溶液，再加入100 μL的血浆，37 ℃孵育3 min后加入37 ℃预温的PT试剂200 μL，记录凝固时间，即为PT值。
1.3.4 TT的检测方法
血浆制备方法同1.3.2项下方法。在测试杯中加入50 μL样品溶液和200 μL的血浆，孵育3 min后加入TT试剂200 μL，记录凝固时间，即为TT值。
1.3.5 FIB的检测方法
血浆制备方法同1.3.2项下方法。按照试剂说明书测定标准曲线。取200 μL血浆和100 μL样品，然后加入700 μL缓冲液。混匀后，取稀释后的血浆200 μL，37℃预温3 min，加入凝血酶溶液100 μL，记录纤维蛋白原的含量，即为FIB值。
1.4 数据处理
结果采用算术平均值和标准差表示，数值统计采用SPSS19.0软件单因素方差分析(One-Way ANOVA)进行组间比较，组间差异采用LSD(least significant difference)检测方法，其中P<0.05说明具有统计学意义，图均用GrapPad Prism软件绘制。
1.5 试验结果
表1 活化部分凝血活酶时间(APTT)
注：与空白组比较，***p<0.001, 0.001<**p<0.01；
与维生素K1比较, ###p<0.001；
与灯盏花素比较，&&&p<0.001；
由表1可知，可皆霉素没有活性。
表 2 凝血酶时间(TT)
注：与空白组比较，***p<0.001;
与灯盏花素比较，&&&p<0.001;
由表2可知，与空白相比，可皆霉素可极显著地延长TT（p<0.001），且强于阳性对照灯盏花素，说明其可抑制纤维蛋白原转化为纤维蛋白，具有抗凝血的作用。
表3 凝血酶原时间(PT)
注：与空白组比较，***p<0.001;
与维生素K1比较, ###p<0.001;
与灯盏花素比较，&&&p<0.001
由表3可知，与空白相比，可皆霉素无活性。
表4 纤维蛋白原(FIB)
注：与空白组比较，***p<0.001, 0.001<**p<0.01;
与维生素K1比较, ###p<0.001;
与灯盏花素比较，&&&p<0.001
由表1可知，可皆霉素没有活性。