口蹄疫病毒样颗粒在作为重组质粒运载载体中的应用的制作方法

本发明涉及一种口蹄疫病毒样颗粒(vlps)的新用途，特别涉及口蹄疫病毒样颗粒在作为重组质粒运载载体中的应用。本发明属于农业科学畜牧兽医科学技术领域。

背景技术：

dna疫苗是近年来发展起来的一种新型疫苗，它是一种表达某种抗原基因的真核表达质粒，该质粒表达的蛋白在细胞内合成、加工、递呈的过程与完整病毒很相似，能够诱导较强的免疫反应和保护力，而且比传统疫苗具有安全、稳定、更容易构建和生产等优点。因此，目前dna疫苗已经成为国际疫苗研究领域中的热点，并己在人和动物的多种传染病、寄生虫病以及肿瘤治疗等方面取得进展。实现dna疫苗有效免疫的前提条件之一是能够将重组质粒dna运载到细胞内，目前作为质粒dna的载体有病毒载体及非病毒载体，前者包括腺病毒、痘病毒等，后者主要包括多聚物，如鲑鱼精蛋白、多溶素、peg、pla、多聚糖以及以惰性基质材料为主的无机纳米颗粒。但由于这些载体或多或少存在缺陷，其优化还在进行中，为了寻找更有效、更具生物相容性的质粒dna载体，近年来出现的病毒样颗粒(vlps)引起了研究者的关注。vlps是一类形态结构与自然病毒粒子相似的生物形式，主要由病毒的单个或多个衣壳蛋白构成。由于其不携带病毒遗传物质，不具有感染性；它作为纳米级生物载体，有较大的体表面积，可承载大量外源物质；具有比合成材料更优越的生物相容性，几乎对生物组织没有毒性，且容易降解。因此，目前vlps在呈递药物和运载外源小分子等方面表现出独特的优势。

本发明初次尝试将口蹄疫病毒vlps作为质粒dna载体进行应用，并进行了一系列验证和条件摸索，证实口蹄疫病毒vlps能成功运载外源质粒dna，这为口蹄疫病毒vlps作为疫苗应用之外，进一步扩展了其生物应用范围，也为dna疫苗的成功应用，提供了新的优势载体。

技术实现要素：

为了有效运载质粒dna，寻找更具生物安全性和生物相容性的载体，本发明充分利用vlps的优势，尝试以口蹄疫病毒vlps作为质粒dna运载载体，通过体外、细胞内、动物体内的试验验证，确定了口蹄疫病毒vlps能够成功运载质粒dna，为dna免疫提供了新的载体选择。

为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：

本发明利用口蹄疫病毒vlps承载质粒dna，通过体外复合物的稳定性研究、细胞内质粒dna的释放观察以及动物体内特异免疫反应的检测等，证实口蹄疫病毒vlps能够有效承载质粒dna，并实现外源质粒dna的生物功能。

在上述研究的基础上，一方面，本发明提出了口蹄疫病毒样颗粒(vlps)在制备重组质粒运载载体中的应用，优选的，所述的重组质粒为dna疫苗。

另一方面，本发明还提出了一种口蹄疫病毒vlps/dna疫苗复合物，所述的dna疫苗以o型口蹄疫vlps作为载体，所述的o型口蹄疫vlps内包被有含有asia1型口蹄疫病毒编码基因的重组质粒，所述的含有asia1型口蹄疫病毒编码基因的重组质粒是将asia1型口蹄疫病毒的p1-2a和3c片段串联构建到真核表达载体上得到的。

在本发明中，优选的，所述的o型口蹄疫vlps由o型口蹄疫病毒的结构蛋白vp0、vp3和vp1组装而成，其中vp1的基因序列为seqidno.1所示，vp3的基因序列为seqidno.2所示，vp0的基因序列为seqidno.3所示。

在本发明中，优选的，所述的asia1型口蹄疫病毒毒株为asia1/jiangsu/china/2005，所述的真核表达载体为pcdna3.1(+)。

在本发明中，优选的，所述的重组质粒的核苷酸序列如seqidno.4所示。

再一方面，本发明还提出了一种构建所述的口蹄疫病毒vlpss/dna疫苗复合物的方法，包括以下步骤：

(1)小泛素样修饰蛋白融合表达载体psma以及psmk的构建：

a.以酿酒酵母基因组dna为模板，以smt3f与smt3r为引物扩增smt3基因，引物序列如下：

smt3f：5’gccatgggtcatcaccatcatcatcacgggtcggactcagaagtcaatcaa3’，

smt3r：5’ggatccgagaccttaaggtctcaacctccaatctgttcgcggtg3’，

b.经ncoi和bamhi双酶切后将smt3基因插入到用同样内切酶处理的pet-28a载体中，所得载体为psmk，将psmk的卡那霉素抗性基因替换为氨苄青霉素抗性基因，得载体psma；

(2)口蹄疫结构蛋白基因重组表达载体的构建

根据已公布的genbank登陆号为jn998085.1的o型口蹄疫病毒的序列，进行密码子优化并合成结构蛋白基因vp0，vp3和vp1；以合成的基因为模板，以下引物对分别扩增vp0，vp3和vp1基因片段：

vp1f：5’ggtctctaggtaccaccagcacgggcgaa3’

vp1r：5’cgcggatcctcacagactttgtttgaccgg3’

vp0f：5’ggtctctaggtggtgcgggccagtcatctcc3’

vp0r：5’cgcggatcctcattctttactcggaaattc3’

vp3f：5’ggtctctaggtggtatcttcccggtggcgtg3’

vp3r：5’cgcggatcctcattgctgacgggcatcaacc3’

采用聚合酶链式反应(pcr)方法，分别用引物vp1f/vp1r、vp3f/vp3r和vp0f/vp0r扩增获得vp1、vp3和vp0基因；扩增得到的vp1、vp3和vp0基因片段分别经bsmbi/bamhi双酶切后分别插入经bsai酶切处理的psmk和psma，所构建重组表达载体分别命名为psmk/vp0，psmk/vp1和psma/vp3，以psmk/vp1为模板，以t7bamhi/vp1xhoi为引物扩增获得含t7启动子等原核表达元件和vp1基因的dna片段，经bamhi/xhoi双酶切后插入用同样酶切处理的psmk/vp0中，所得双表达重组载体命名为psmk/vp0-vp1；所述t7bamhi/vp1xhoi引物序列为：

t7bamhi：5’gcaattggatcccgtccggcgtagaggatcga3’

vp1xhoi：5’gcgcacctcgagtcacagagtctgtttctcagg3’

(3)衣壳蛋白的表达及纯化

将表达载体psma/vp3和psmk/vp0-vp1共转化到表达菌bl21(de3)，用卡那霉素和氨苄青霉素筛选阳性克隆进行蛋白表达和纯化；

(4)含有asia1型口蹄疫病毒编码基因的重组质粒pcdna3.1/p12a3c的构建

根据已公布的genbank登陆号为ef149009的asia1型口蹄疫病毒的序列，分别设计包含酶切位点的p1-2a和3c引物，以asia1型口蹄疫病毒的基因组为模板，分别扩增含酶切位点kpni和ecori的p1-2a片段和含酶切位点ecori和xhoi的3c片段，先用kpni/ecori双酶切p1-2a片段和pcdna3.1(+)载体，连接构建重组载体pcdna3.1/p1-2a，再用ecori/xhoi双酶切3c片段和pcdna3.1/p1-2a重组载体，连接转化获得重组质粒，命名为pcdna3.1/p12a3c，扩增p1-2a和3c所用引物序列如下：

p12akpni：5’atgggtaccatgggagccgggcaatccagtccggcga3’

p12aecori：5’acggaattcgtttgacctgacatcagagaagaag3’

3cecori：5’acggaattcgtgaagaagcctgtcgctttgaa3’

3cxhoi：5’agcctcgagctactcgtggtgtggttcggggtcgat3’

经酶切鉴定和测序正确后，提取质粒备用；

(5)vlps-质粒复合物的包装

将纯化得到的o型口蹄疫病毒结构蛋白和携带asia1型衣壳编码基因p1-2a和非结构蛋白3c基因的质粒pcdna3.1/p12a3c加入透析袋中，同时加入小泛素样修饰蛋白酶，并置于含有500mmnacl，ph8.0的20mmtris-hcl组装缓冲液中，在4℃组装过夜，得到vlps-质粒复合物，即为所述的口蹄疫病毒vlps/dna疫苗复合物。

在本发明所述的方法中，优选的，扩增得到的vp1、vp3和vp0基因片段的核苷酸序列分别如seqidno.1-3所示。

在本发明所述的方法中，优选的，构建得到的asia1型口蹄疫病毒重组质粒pcdna3.1/p12a3c的核苷酸序列如seqidno.4所示。

在本发明所述的方法中，优选的，o型口蹄疫病毒样颗粒和携带asiai型衣壳编码基因p1-2a和非结构蛋白3c基因的质粒pcdna3.1/p12a3c是按照10:2(w/w)的比例加入透析袋中。

最后，本发明还提出了所述的口蹄疫病毒vlps/dna疫苗复合物在制备口蹄疫疫苗中的用途。

本发明尝试将口蹄疫病毒vlps作为质粒载体，应用其潜在的运载能力和控释特性，试图将质粒dna成功运载并能在动物体内释放，最终刺激机体产生有效免疫应答反应。结果显示，vlps可以运载质粒dna进入细胞并有效释放，在注射进动物体内后，能够有效释放承载的外源dna，最终诱导特异的抗体免疫反应和显著的t-淋巴细胞免疫反应。这些结果表明，vlps可以作为载体运载质粒进入细胞并成功释放，且能在动物机体内有效刺激机体产生特异的免疫反应。本发明为扩展vlps的生物学应用进行了一次新的尝试和创新。

附图说明

图1为融合蛋白诱导表达及纯化；

注：泳道1：marker，泳道2-6：纯化的目的蛋白

图2为体外组装的口蹄疫vlps电镜观察结果；

图3为口蹄疫vlps包被质粒后电泳图；

a、b:vlps-质粒c:质粒

图4为口蹄疫vlps包被质粒后dnasei酶解；

泳道1、3:质粒；泳道2:质粒+dnasei；泳道4：vlps/质粒；泳道5：vlps/质粒+dnasei；

图5为vlps/质粒复合物进入细胞并释放质粒；

fitc标记的口蹄疫vlps发出绿色荧光；popo-3标记的质粒发出红色荧光；dapi染色的细胞核发出蓝色荧光；

图6为豚鼠血清抗体效价的elisa检测结果；

图7为t淋巴细胞增殖实验结果。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例1口蹄疫结构蛋白基因重组表达载体的构建

1、小泛素样修饰蛋白融合表达载体psma的构建：

a.以酿酒酵母基因组dna为模板，以smt3f与smt3r为引物扩增smt3基因，引物序列如下：

上游引物smt3f：5’gccatgggtcatcaccatcatcatcacgggtcggactcagaagtcaatcaa3’，

下游引物smt3r：5’ggatccgagaccttaaggtctcaacctccaatctgttcgcggtg3’，

b.经ncoi和bamhi双酶切后将smt3基因插入到用同样内切酶处理的pet-28a载体中，所得载体为psmk，将psmk的卡那霉素抗性基因替换为氨苄青霉素抗性基因，得载体psma。

2、口蹄疫结构蛋白基因重组表达载体的构建

根据已公布的o型口蹄疫病毒的序列(genbank登陆号：jn998085.1)，参考hoover等的方法(hooverdm1,lubkowskij.dnaworks:anautomatedmethodfordesigningoligonucleotidesforpcr-basedgenesynthesis.nucl.acidsres.(2002)30(10):e43.)进行密码子优化并合成结构蛋白基因vp0，vp3和vp1。

以合成的基因为模板，以下引物对分别扩增vp0，vp3和vp1基因片段：

vp1f：5’ggtctctaggtaccaccagcacgggcgaa3’

vp1r：5’cgcggatcctcacagactttgtttgaccgg3’

vp0f：5’ggtctctaggtggtgcgggccagtcatctcc3’

vp0r：5’cgcggatcctcattctttactcggaaattc3’

vp3f：5’ggtctctaggtggtatcttcccggtggcgtg3’

vp3r：5’cgcggatcctcattgctgacgggcatcaacc3’

采用聚合酶链式反应(pcr)方法，分别用引物vp1f/vp1r、vp3f/vp3r和vp0f/vp0r扩增获得vp1、vp3和vp0基因，扩增得到的vp1、vp3和vp0基因片段分别如seqidno.1-3所示。扩增得到的vp1、vp3和vp0基因片段分别经bsmbi/bamhi双酶切后插入经bsai酶切处理的psmk或psma，所构建重组表达载体分别命名为psmk/vp0，psmk/vp1和psma/vp3。以psmk/vp1为模板，以t7bamhi/vp1xhoi为引物扩增获得含t7启动子等原核表达元件和vp1基因的dna片段，经bamhi/xhoi双酶切后插入用同样酶切处理的psmk/vp0中，所得双表达重组载体命名为psmk/vp0-vp1。所述t7bamhi/vp1xhoi引物序列为：

t7bamhi：5’gcaattggatcccgtccggcgtagaggatcga3’

vp1xhoi：5’gcgcacctcgagtcacagagtctgtttctcagg3’

3、衣壳蛋白的表达及纯化

将表达载体psma/vp3和psmk/vp0-vp1共转化到表达菌bl21(de3)。用卡那霉素和氨苄青霉素筛选阳性克隆。挑选阳性克隆菌于双抗性lb培养基中37℃220rpm过夜培养。将上述菌液以1:100接种lb培养基，于37℃、220rpm培养至菌液的od600达0.6左右，以终浓度为1mmiptg、25℃过夜诱导表达，随后以5000rpm、30min离心收集菌体沉淀，-20℃储存备用。

用10-20ml冰浴的缓冲液a(20mmtris-hcl，500mmnacl，20mmimidazol，ph＝8.4)重悬细菌沉淀，超声破碎菌体细胞(超声时间3s，间隔时间3s，共8min，功率200w)。12,000×g离心30min，取上清，弃沉淀，上清与ni-ntahis·bindresins混匀，4℃结合1h左右。用缓冲液a洗去非特异性结合的杂蛋白，用缓冲液b(20mmtris-hcl，500mmnacl，300mmimidazol，ph＝8.4)洗脱目的蛋白，-70℃保存。sds-page和免疫印记(westernblot)检测结果显示获得了预期大小的蛋白质(如图1)。

4、口蹄疫病毒样颗粒体外组装

参照invitrogn的试剂使用说明，用小泛素化修饰蛋白酶酶切融合蛋白，按照如下方法和比例进行：20μg上述纯化的融合蛋白，200μl酶切缓冲液(50mmtris-hcl，150mmnacl，ph8.0,0.2％igepal(np-40)，1mmdtt)，10μl小泛素化修饰蛋白酶(1u/μl)，37℃酶切30min或4℃过夜。将酶切混合物通过histraphp除去小泛素化修饰标签蛋白，收集含有vp0、vp1和vp3的流穿液在组装缓冲液(20mmtris-hcl，500mmnacl，ph8.0)中，4℃过夜组装vlps。

过夜组装的vlps经截留分子量100kd的超滤管浓缩后，透射电镜观察：将10μl含vlps的浓缩液加到200目的铜网上，室温吸附2-3min，用滤纸吸干铜网上剩余的液体后用3％的磷钨酸染色，用hitachi,h-7100fa透射电镜观察，组装的vlps电镜观察，如图2所示，在此条件下组装的病毒样颗粒直径主要分布在20-30nm之间。

实施例2含有asia1型口蹄疫病毒编码基因的重组质粒pcdna3.1/p12a3c的构建

1、pcdna3.1/p12a3c的构建

根据已公布的genbank登陆号为ef149009的asia1型口蹄疫病毒的序列，分别设计包含酶切位点的p1-2a和3c引物，以asia1型口蹄疫病毒的基因组为模板，分别扩增含酶切位点kpni和ecori的p1-2a片段和含酶切位点ecori和xhoi的3c片段，先用kpni/ecori双酶切p1-2a片段和pcdna3.1(+)载体，连接构建重组载体pcdna3.1/p1-2a，再用ecori/xhoi双酶切3c片段和pcdna3.1/p1-2a重组载体，连接转化获得重组质粒，命名为pcdna3.1/p12a3c。

扩增p1-2a和3c所用引物序列如下：

p12akpni：5’atgggtaccatgggagccgggcaatccagtccggcga3’

p12aecori：5’acggaattcgtttgacctgacatcagagaagaag3’

3cecori：5’acggaattcgtgaagaagcctgtcgctttgaa3’

3cxhoi：5’agcctcgagctactcgtggtgtggttcggggtcgat3’

经酶切鉴定和测序正确后，提取质粒备用，pcdna3.1/p12a3c测序结果如seqidno.4所示。

2、vlps包被质粒及对质粒的保护作用

将实施例1制备得到的o型口蹄疫病毒结构蛋白和携带asiai型衣壳编码基因p1-2a和非结构蛋白3c基因的质粒pcdna3.1/p12a3c按10:2(w/w)比例加入透析袋中，同时参照invitrogn的试剂使用说明，加入小泛素化修饰蛋白酶，并置于含有500mmnacl，ph8.0的20mmtris-hcl组装缓冲液中，在4℃组装过夜，对组装后的vlps-质粒复合物进行核酸电泳，检测质粒是否能够被vlps包被进去。结果表明，vlps包被质粒后由于分子量变大电泳条带出现滞后现象，说明质粒被vlps包被，形成了vlps-质粒复合物(图3)。用dnasei分别酶解质粒和vlps-质粒复合物。结果表明，质粒被dnasei降解，而vlps-质粒复合物没有被降解，说明vlps包被质粒后对质粒有保护作用(图4)。

3、vlps运载质粒进入细胞并释放

先用popo-3染色液加入质粒混匀后在室温孵育一小时，根据上述方法用vlps将质粒包被形成vlps-质粒复合物，将vlps/质粒复合物加入bhk-21细胞中在37℃孵育1h，弃去培养液，用pbs洗三遍，加入多聚甲醛固定细胞20min，用pbs洗三遍，加入0.1％tritonx-100室温作用15min，用pbs洗三遍，加入5％nbs封闭15min，然后细胞中加入o猪血清(1:200稀释)在37℃孵育1h，用pbs洗5遍，接着在细胞中加入fitc标记的山羊抗猪二抗(1：200稀释)，用pbs洗5遍，用dapi对细胞核进行染色，最后在激光共聚焦显微镜下进行观察，结果表明，在vlps-质粒复合物作用细胞1h后，细胞周围出现绿色荧光并且细胞核内出现红色的荧光，说明o型口蹄疫vlps包被asia1型口蹄疫病毒重组质粒后可以携带质粒进入细胞，并将质粒释放到细胞内，结果如图5所示。

实施例3vlps-质粒复合物的免疫效力实验

1、抗体效价的elisa检测

将32只4周龄的豚鼠分为4组，第一组用pbs免疫作为对照，第二组用质粒pcdna3.1/p12a3c免疫，第三组用实施例2制备得到的口蹄疫病毒vlps-质粒复合物进行免疫。分别在免疫前和免疫后第一周开始每周对各组豚鼠进行采血。在第一次免疫后检测到抗体水平下降时对豚鼠进行二次免疫。分别对第一次免疫后第4周和第二次免疫后第3周每组各随机取1只豚鼠处死，无菌条件下取其脾脏分离淋巴细胞进行细胞增殖实验。

将96孔板(nuncmaxisorp)以灭活的asia1型fmdv细胞毒为包被抗原(1:10稀释)。pbst清洗3次，96孔板用含5％脱脂奶粉的pbst(150μl)37℃封闭1h。pbst清洗3遍后，待检豚鼠血清及阳性阴性血清分别用含1％脱脂奶粉pbst按1:100稀释后，每孔100μl加于封闭孔板中，于37℃孵育1h。pbst清洗3次后，hrp标记的二抗(兔抗豚鼠igg，sigma)用含1％脱脂牛奶的pbst按1:20000稀释并每孔100μl加于封闭孔板中，于37℃孵育1h。pbst清洗3次后，50μl底物溶液(opd,sigma)加于各孔中于37℃孵育15min。然后用50μl2nh2so4加于各孔终止颜色反应，于490nm检测光密度(od值)。结果显示，和用pbs对照组豚鼠相比，质粒和vlps-质粒复合物免疫组的豚鼠血清抗体水平持续升高，免疫后第三周达到了最高峰，并且vlps-质粒复合物免疫组的抗体水平比质粒单独免疫组的水平高，抗体水平在第四周下降。而第二次免疫后，质粒免疫组抗体水平没有上升，vlps-质粒复合物免疫组的抗体水平持续上升并保持很高的水平。这说明口蹄疫病毒vlps对质粒有保护和缓释作用，并且口蹄疫病毒vlps能够进一步增强质粒的免疫效果，使动物机体产生更高水平的特异抗体(图6)。

2、t-淋巴细胞增殖实验

分别在第一次免疫后第4周和第二次免疫后第3周各组随机收取1只豚鼠将其处死，然后放入酒精中浸泡5min消毒，无菌取脾，加入1ml无血清rpmi1640培养液于200目铜网上研磨，用无血清rpmi1640培养液冲洗铜网，将研磨获得的脾细胞悬液加入装有2ml淋巴细胞分离液的离心管中，4℃2500r/min离心10min，用长针头吸出淋巴细胞层放入新离心管中，用无ca²⁺、mg²⁺hanks液洗两次并以rpmi1640培养液混匀，细胞计数后，以含10％fbs的rpmi1640培养液稀释成10⁷个/ml浓度。将稀释好的淋巴细胞悬液加入96孔细胞板中(100μl/孔)，每个样品设4个复孔，每孔加入终浓度为40μg/ml的cona特异性刺激物，同时以不加刺激物的淋巴细胞为对照，培养板在含5％co2的37℃恒温培养箱培养72h后，加入20μlmts试剂，于37℃培养4h，用酶标仪检测波长为490nm的光密度值。计算刺激指数(stimulationindex,si)。si＝(cona刺激孔的平均od490－未刺激组的平均od490)/(未刺激组的平均od490－空白1640培养液组的平均od490)。结果显示，质粒和vlps-质粒复合物免疫组豚鼠的淋巴细胞经cona刺激剂刺激后，t-淋巴细胞的增值效果高于pbs对照组。t-淋巴细胞增殖效果为：vlps-质粒复合物免疫组﹥质粒免疫组，这说明口蹄疫病毒vlps可作为疫苗载体，运载质粒进入细胞后，能够刺激机体产生比单独质粒更强的细胞免疫应答(图7)。

序列表

<110>中国农业科学院兰州兽医研究所

<120>口蹄疫病毒样颗粒在作为重组质粒载体中的应用

<130>klpi160938

<160>4

<170>patentin3.5

<210>1

<211>639

<212>dna

<213>vp1

<400>1

accaccagcacgggcgaatcggcagatccggttacggcaacggtcgaaaactacggcggc60

gaaacgcaggttcaacgtcgtcatcataccgatgttagctttattctggaccgtttcgtg120

aaagttacgccgaaggattctatcaacgtcctggacctgatgcagaccccgccgcatacc180

ctggtgggcgcactgctgcgcaccgccacgtattactttgcagatctggaagtcgctgtg240

aaacacgaaggcgacctgacctgggtcccgaatggtgcaccggaagcagcactggataac300

accacgaatccgacggcatatcataaagctccgctgacccgtctggcactgccgtacacg360

gccccgcaccgtgttctggcaaccgtctataacggcaattgcaaatacgctggcggtagt420

ctgccgaacgtgcgtggtgatctgcaggttctggcccaaaaggcagcttggccgctgccg480

accagcttcaattatggtgcgattaaagccacccgtgtgacggaactgctgtatcgtatg540

aagcgtgcagaaacctactgtccgcgtccgctgctggcagtccacccgtccgcagcacgc600

cataagcaaaaaatcgtcgccccggtcaaacaaagtctg639

<210>2

<211>660

<212>dna

<213>vp3

<400>2

ggtatcttcccggtggcgtgtagcgatggttacggtggcctggtgacgacggacccgaaa60

acggcagacccggtgtatggcaaagtttttaacccgccgcgtaatctgctgccgggtcgc120

ttcaccaacctgctggatgttgccgaagcatgcccgacgtttctgcatttcgatggcgac180

gtgccgtatgttaccacgaaaaccgattcggaccgtgtcctggcccagtttgacctgtcc240

ctggcggccaagcatatgtcaaacaccttcctggctggcctggcgcagtattacacccaa300

tacagcggtacggtgaatctgcactttatgttcaccggcccgacggatgctaaagcgcgc360

tatatgattgcctacgcaccgccgggtatggaaccgccaaagaccccggaagcagctgcg420

cattgcattcacgcggaatgggacaccggcctgaacagcaaatttacgttctctatcccg480

tatctgagtgccgcagattatgcctacaccgcaagtgacgctgcggaaaccacgaatgtc540

cagggttgggtgtgtctgtttcaaatcacgcacggcaaggctgaaggtgatgcactggtt600

gtgatggcgtcggcgggtaaagattttgaactgcgtctgccggttgatgcccgtcagcaa660

<210>3

<211>909

<212>dna

<213>vp0

<400>3

ggtgcgggccagtcatctccggcgacgggttcccagaatcaatcaggcaacacgggttcc60

atcatcaacaactactacatgcaacagtatcagaacagtgtggatacccaactgggcgac120

aacgcggtttcaggcggttcgaatgaaggtagtaccgacaccacgtccacgcataccacg180

aatacccagaacaatgattggtttagcaaactggcaagctctgctttttctggcctgttc240

ggtgcgctgctggccgacaaaaagaccgaagaaaccacgctgctggaagatcgtattctg300

accacgcgcaacggccataccacgagtaccacgcagagttccgtcggcatcacgcacggt360

tacgcgaccgccgaagatttcgtgtcaggcccgaatacgtcgggtctggaaacccgtgtg420

gttcaagccgaacgctttttcaaaacgcacctgtttgattgggtgacctccgacccgttc480

ggtcgttgctatctgctggaactgccgacggatcacaagggcgtttacggtagcctgacc540

gactcttatgcgtacatgcgcaacggctgggatgtggaagttaccgccgtgggtaaccag600

tttaatggcggttgcctgctggttgcaatggtcctggaactgtgttctattgaacgtcgc660

gaactgttccagctgaccctgtttccgcatcaattcattaacccgcgtaccaatatgacg720

gctcacatcaaagttccgtttgtcggcgtgaaccgctatgatcagtacaaagtccacaag780

ccgtggaccctggtcgtgatggttgtcgcaccgctgaccgttaatacggaaagcgctccg840

caaatcaaggtgtatgccaatatcgccccgacgaatgtccacgttgctggtgaatttccg900

agtaaagaa909

<210>4

<211>3314

<212>dna

<213>pcdna3.1-p1-2a/3c

<400>4

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