一种具有核壳结构的复合药物微载体的制作方法

本发明属生物材料领域。具体涉及一种核壳结构的复合药物微载体及其制备方法和应用，这种微载体可用于同时运输亲水和疏水性药物，为协同缓释给药提供了一种新型材料。

背景技术：

一般的给药方式进入人体内的药物浓度只能维持较短时间，必须依靠频繁给药来维持血药浓度，这样使组织中的药物浓度上下波动较大，这样可能会产生副作用，患者依从性低。生物学领域涉及的药物释放是以一定的基质材料为载体，包埋特定的药物成分，并以特定的形式和可控速率持续释放作用于患者，其中，载体的材料和形貌对药物的释放有至关重要的影响。现在已有许多天然人工合成的高分子材料可作为缓释材料。

制备微载体的方法多种多样，传统的方法包括相分离法、喷雾干燥法、乳化溶剂挥发法、机械搅拌法等，但是这些方法制备出的微载体尺寸分布大，粒径不均一，单分散性差，由于机械搅拌的剧烈性微球之间相互碰撞导致微球破裂从而使包裹的药物流失，导致药物包封率差；另外，由于传统的微载体为空心微球或包裹液体的微球，外壳一旦降解会造成内部药物的突释，缓释效果大大的受到了限制。多种药物共同输送，尤其是亲水和疏水药物共同输送难以实现。因此，具有大小可控、结构可控、可协同输送多种类药物的微载体具有极大的前景。

基于微流控技术制备的微载体具有良好的单分散性，并且大小可控，结构可控，可以一步法制备出双乳液，三重乳液甚至更高阶的乳液。制备过程简单，无机械外力引入，依靠互不相溶的各相溶液相互剪切作用而形成液滴，可同时包裹多种不同属性的药物，药物包封率高，缓释性能好。

技术实现要素：

本发明目的在于提供一种基于微流控技术制备的核壳结构复合药物微载体及其应用，可同时包裹亲水性和疏水性药物，实现药物共输送，其制备过程简单，大小形态可控，单分散性好，可重复性好。

本发明提供的技术方案是：利用微流控装置芯片，制备包含有药物的W/O/W或O/W/O双乳液模板，通过固化模板，制备得到大小均一、形貌均一、具有特殊核壳结构并同时包含有亲水性和疏水性药物的微载体。

优选的，所述方法中使用的微流控装置为协流式或汇聚式微流控装置，微流控装置的管道材料选用二氧化硅、特氟龙、PDMS的一种或两种以上的任意组合。

本发明提供的核壳结构微胶囊，亲水部分可负载任意亲水性药物，疏水部分可负载任意疏水性药物。

本发明的另一目的在于提供了基于微流控技术制备的核壳结构复合微载体在药物缓释中的应用，所述微载体可以持续释放药物。

本发明提供了一种基于微流控技术制备核壳结构复合药物微载体的方法，可同时包裹亲疏水性药物应用于药物缓释，其特征在于所述方法包括以下步骤：

(1)制备双乳液模板：根据微胶囊性质,配制各相高分子聚合物溶液，并将药物溶解于相应的溶液中，利用微流控装置在微流控通道内注入互不相溶的各相溶液，利用各相溶液之间的相互剪切作用形成单分散的W/O/W或O/W/O双乳液液滴；

(2)通过调节各相溶液的流速，可以生成不同大小和包裹不同数量内核的双乳液液滴模板；

(3)将所得到的双乳液模板内核和外壳分别固化,去离子水漂洗，冷冻干燥，保存在干燥器中。

优选的，所述方法中步骤(1)使用的油相溶液为疏水性高分子材料溶液，水相溶液为亲水性高分子材料，可通过调控油相或水相溶液的浓度来控制外壳的厚度。

优选的，所述方法步骤(1)使用的油相疏水性高分子材料溶液的浓度为5％-30％，亲水性材料溶液的浓度为10％-30％；溶液浓度太低，固化后壁层太薄，易造成药物突释；溶液浓度太高，固化后壁层太厚，药物释放过慢，不能达到有效药物浓度。

优选的，所述微载体的外壳和内核高分子材料均具有良好的生物相容性及生物可降解性。

优选的，根据所述微载体具有核壳结构，直径在1μm-1mm范围内。

优选的，所述方法步骤(3)中固化内核和外壳的方法可使用溶剂挥发法、紫外光固化法、温度改变法等，根据所选材料选取合适的固化方法。

本发明基于微流控技术制备的核壳结构复合药物微载体，相对于现有技术中的方案，本发明的优点：

(1)一步法制备W/O/W或O/W/O双乳液模板，大小可控，单分散性好，成本低，适合规模化生产；

(2)微载体内核和外壳可在双乳液模板生成后及时固化，大大的提高了包封率和载药量；

(3)其外壳和内核材料本身可选范围广，由于微流体技术的可控性，能够制备出不同尺寸和包裹不同数量内核的微胶囊，由于微载体具有良好的生物相容性，不仅可适用于生物分析，还可用于细胞培养及细胞检测等领域，具有极大的临床应用价值。

附图说明

下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述：

图1制备双乳液模板的微流控装置示意图；

图2为核壳结构复合药物微载体制备流程图；

图3为核壳结构载药微胶囊释放药物的过程图；

图4为固化后GelMa-PLGA核壳结构微载体光镜图及尺寸分布；

图5为DOX和CPT体外释放曲线；

图6微载体再抗癌药物作用于肝癌细胞24h后细胞生长状况具体实施方式。

具体实施方式

实施例1载阿霉素-喜树碱的明胶-甲基丙烯酸甲酯-聚乳酸羟基乙酸(DOX-CPT-GelMa-PLGA)核壳结构微载体的制备：

1.双乳液微流控芯片的制作：使用乙炔喷灯拉制玻璃毛细管，再通过砂纸磨制管口至需要尺寸，酒精中超声清洗，中间油相PLGA溶液的玻璃毛细管使用3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)的2％-10％乙醇溶液进行亲水处理；内相明胶-甲基丙烯酸甲酯的毛细管使用十八烷基三甲氧基硅烷的2％-10％丙酮溶液进行疏水处理。用经过亲疏水处理的玻璃毛细管、载玻片、盖玻片、点样针头和速干胶组装玻璃毛细管微流控芯片。

2.双乳液模板的制备：配制各相溶液，将0.5mg DOX溶解于1mL 15％GelMa水溶液中作为内水相，将1g PLGA溶解于10mL二氯甲烷中，再将0.5mg CPT溶于其中作为油相，2％PVA水溶液作为外水相，分别装入三个注射器，连接特氟龙管通入微流控装置的三相入口，控制蠕动泵的流速，使三相流体在流动相中剪切成单分散的W/O/W双乳液液滴。

3.双乳液模板的固化：将生成的液滴进行紫外光垂直照射20s，使其内核固化，然后再进行旋转蒸发4h，温度控制在39℃，转速为70rpm，油相有机溶剂溶剂挥发，PLGA析出后固化成球，形成稳定的核壳结构，并将其进行清洗干燥，保存。

4.载体微球的表征：在体视显微镜下观察微球的形貌并利用显微镜自带软件测量微球的粒径，测得微载体的半径为100μm左右，壁厚为30μm左右，尺度均一，球形度与单分散性好。

实施例2载喜树碱—阿霉素的甲基丙烯酸甲酯—聚乳酸羟基乙酸—明胶-甲基丙烯酸甲酯(CPT-DOX-PLGA-GelMa)核壳结构微载体的制备：

1.双乳液微流控芯片的制作：使用乙炔喷灯拉制玻璃毛细管，再通过砂纸磨制管口至需要尺寸，酒精中超声清洗，中间相注入明胶-甲基丙烯酸甲酯的毛细管使用十八烷基三甲氧基硅烷的2％-10％丙酮溶液进行疏水处理，内相注入油相PLGA溶液的玻璃毛细管使用3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)的2％-10％乙醇溶液进行亲水处理；。用经过亲疏水处理的玻璃毛细管、载玻片、盖玻片、点样针头和速干胶组装玻璃毛细管微流控芯片。

2.双乳液模板的制备：配制各相溶液，将1g PLGA溶解于10mL二氯甲烷中，再将0.5mg CPT溶于其中作为内油相，将0.5mg DOX溶解于1mL 15％GelMa水溶液中作为中间水相，加入表面活性剂的正十六烷作为外油相，分别装入三个注射器，连接特氟龙管通入微流控装置的三相入口，控制蠕动泵的流速，使三相流体在流动相中剪切成单分散的O/W/O双乳液液滴。

3.双乳液模板的固化：将生成的液滴进行紫外光垂直照射20s，使其外壳固化，然后静置于室温待油相有机溶剂溶剂挥发后PLGA析出形成稳定的核壳结构，并将其进行清洗，保存。

实施例3载5-氟尿嘧啶-紫杉醇的甲基丙烯酸缩水甘油酯壳聚糖-聚乳酸(5-Fu-PTX-DexGMa-PLLA)核壳结构微胶囊体外药物释放：

1.双乳液微流控芯片的制作：使用乙炔喷灯拉制玻璃毛细管，再通过砂纸磨制管口至需要尺寸，酒精中超声清洗，注入油相PLLA溶液的玻璃毛细管使用3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)的2％-10％乙醇溶液进行亲水处理；注入Dex-GMa的毛细管使用十八烷基三甲氧基硅烷的2％-10％丙酮溶液进行疏水处理。用经过亲疏水处理的玻璃毛细管、载玻片、盖玻片、点样针头和速干胶组装玻璃毛细管微流控芯片。

2.双乳液模板的制备：配制各相溶液，将0.5mg 5-Fu溶解于1mL 15％DexGMa水溶液中作为内水相，将1g PLLA溶解于10mL二氯甲烷中，再将0.5mg PTX溶于其中作为油相，2％PVA水溶液作为外水相，分别装入三个注射器，连接特氟龙管通入微流控装置的三相入口，控制蠕动泵的流速，使三相流体在流动相中剪切成单分散的W/O/W双乳液液滴。

3.双乳液模板的固化：将生成的液滴进行紫外光垂直照射20s，使其内核固化，然后再进行旋转蒸发4h，温度控制在39℃，转速为70rpm，油相有机溶剂溶剂挥发，PLLA析出后固化成球，形成稳定的核壳结构，并将其进行清洗干燥，保存。

4.载体微球的表征：在体视显微镜下观察微球的形貌并利用显微镜自带软件测量微球的粒径，测得微载体的半径为100μm左右，壁厚为30μm左右，尺度均一，球形度与单分散性好。

实施例4 DOX-CPT-GelMa-PLGA微载体用于体外药物释放

1.将得到的载药DOX-CPT-GelMa-PLGA核壳结构复合微载体，清洗干燥后，称量5mg，分散于1mL PBS(PH＝7.4)溶液中，至于37℃恒温振荡器中，转速设为100rpm。前12h每一个小时分别离心后取上清液200μL，并添加200μL新鲜PBS继续振荡；之后每天离心取样一次，同样取样之后添加新鲜PBS继续振荡。所取的不同时间点的上清液分别进行紫外定量分析。

2.经两种药物的全波长扫描最终确定盐酸阿霉素的测定波长为490nm，无参比波长；喜树碱的测定波长为365nm，参比波长为570nm。通过检测取出的样品药物含量，计算其累积释放量，图4即为载药微胶囊DOX和CPT体外释放曲线。

实施例5 DOX-CPT-GelMa-PLGA核壳结构复合微载体作用于癌细胞：

1.细胞接种：实验中所用癌细胞为人类肝癌细胞(HepG2)，将已经消化好HepG2细胞接种于六孔板的五个孔中，培养24h。

2.药物载体作用于细胞：设置3组实验组：DOX-CPT-GelMa-PLGA，DOX-GelMa-PLGA，CPT-GelMa-PLGA，将GelMa-PLGA和PBS作为对照组，称取四种干燥微载体各5mg，紫外灯照射，过夜灭菌，然后分别加入上述六孔板的四个孔中，另一个孔加入PBS作为对照。

3.检测观察：培养24h后，观察各组细胞生长状况。对细胞进行染色，根据荧光强度的强弱，可判断细胞的存活率；。各组结果如图5。实验结果证明，载药微胶囊对癌细胞具有抑制生长或诱导凋亡的效果，并且两种药物具有协同作用，体现了该微胶囊作为药物载体的良好应用功能。

上述实例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人是能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所做的等效变换或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。