抗肿瘤海鞘多肽CS5931冻干粉针制剂及其制备方法与流程

文档序号:11090406阅读:来源:国知局

技术特征:

1.一种抗肿瘤海鞘多肽CS5931冻干粉针制剂,其特征在于:所述制剂包括海鞘多肽CS5931和赋形剂。

2.根据权利要求1所述的抗肿瘤海鞘多肽CS5931冻干粉针制剂,其特征在于:所述赋形剂选自糖类、多元醇类、聚合物类中的一种或几种;所述糖类选自葡萄糖、果糖、半乳糖、核糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、海藻糖、棉子糖、菊糖、纤维素中的一种或几种,多元醇选自甘油、甘露醇、山梨醇、聚乙二醇、肌醇和硫醇中的一种或几种,聚合物选自聚乙烯吡咯烷酮、牛血清白蛋白、右旋糖苷、聚乙二醇、明胶、β-环糊精、纤维素中的一种或几种。

3.根据权利要求1所述的抗肿瘤海鞘多肽CS5931冻干粉针制剂,其特征在于:所述海鞘多肽CS5931与赋形剂的重量份数1:1~4,优选1:2。

4.一种如权利要求1中所述的抗肿瘤海鞘多肽CS5931冻干粉针制剂的制备方法,其特征在于:称取海鞘多肽,加入适量注射用水溶解,加入赋形剂使溶解,补加注射用水至全量,用0.22μm滤膜无菌过滤,灌装,将混合后的溶液装入清洁无菌的西林瓶中,用胶塞半扣塞,冷冻干燥,即得。

5.根据权利要求1所述的抗肿瘤海鞘多肽CS5931冻干粉针制剂的制备方法,其特征在于:冻干过程是:预冻:板层温度为-35℃~-25℃,保温4-5小时;低温升华干燥:真空度0~30Pa,板层温度为-35℃~0℃,保温15-17小时;二次干燥:板层温度20~30℃,保温4-5小时以上。

6.一种如权利要求1中所述的抗肿瘤海鞘多肽CS5931冻干粉针制剂的制备方法,其特征在于:冻干过程是:预冻:板层温度为-35℃,保温4小时;低温升华干燥:真空度0~30Pa,板层温度为-35℃~0℃,保温16小时;二次干燥:板层温度25℃,保温4小时以上。

7.一种如权利要求1中所述的抗肿瘤海鞘多肽CS5931的制备方法,其特征在于:将克隆编码多肽CS5931的基因在大肠杆菌中表达,并通过DEAE离子交换和Superdex75分子筛凝胶层析制备目的多肽;经变性复性后,制备好不带His标签的有活性的目的多肽;具体步骤如下:

1)海鞘多肽CS5931大肠杆菌表达体系发酵:克隆编码多肽CS5931的基因连接入质粒PET-21a载体上,导入表达菌BL21构成工程菌BL21/pET21a-CS5931,简称pET21a-CS5931,将pET21a-CS5931接种在含有氨苄的培养基上进行活化,活化后的种子液转接入含有氨苄的LB培养基中培养,接种后4-5h时加入IPTG进行诱导,继续发酵培养4.5-8.5h;

所述的IPTG添加的终浓度为0.4mM-0.7mM;所述的活化后的种子液转接入含有氨苄的LB培养基中的接种量在3-6%;所述的pET21a-CS5931活化后接种入LB培养基中发酵的装液量在20-45%;所述IPTG加入后的发酵温度为23℃-30℃;

2)海鞘多肽CS5931的分离纯化:通过DEAE阴离子交换柱层析和Superdex75分子筛凝胶层析制备;使目的多肽得到纯化;

3)所述的变性复性:向纯化好的目的多肽溶液中分次缓慢加入8M尿素,1-3mML-半胱氨酸,0.3-0.6mML-精氨酸,0.3-0.6mMEDTA,反应3-5h;多肽样品变性完成后,将变性样品放于透析袋中,在复性液中透析24-30h,期间换1次复性液;复性完成后,将复性液更换为透析液,透析3-5h,将透析完成的样品浓缩冻干得到纯化后的抗肿瘤海鞘多肽CS5931。

8.根据权利要求1中所述的抗肿瘤海鞘多肽CS5931的制备方法,其特征在于:步骤1)中,所述IPTG添加的终浓度为0.6mM时诱导表达效果最好;所述IPTG的添加时间为接种后4.5h;所述活化后的种子液转接入含有氨苄的LB培养基中接种量在4%,加入IPTG后发酵培养温度30℃,所述的pET21a-CS5931活化后接种入LB培养基发酵的装液量在20%;

所述的复性液的成份及其终浓度为0.3-0.6mML-精氨酸、0.5M尿素、1-3mML-半胱氨酸或还原型谷胱甘肽作为还原剂,0.1-0.3mML-胱氨酸或氧化型谷胱甘肽作为氧化剂,还原剂和氧化剂两者摩尔比为10:1,上述物质溶解在TGE缓冲液中;TGE缓冲液的成份及其终浓度为是:0.05-0.15MTris,0.25-0.75mMEDTA,0.05-0.15MNaCl,加1.0L蒸馏水,1M盐酸调pH到8.0,加20-100mL甘油,混匀后定容至2L。透析液的成份及其终浓度为:0.05-0.15MTris,0.3-0.6mML-精氨酸、加600mL蒸馏水,1M盐酸调pH到8.0,溶解后定容到1000mL。

9.根据权利要求1中所述的抗肿瘤海鞘多肽CS5931的制备方法,其特征在于:步骤1)中,多肽CS5931大肠杆菌表达体系发酵:取-80℃保存的甘油菌pET21a-CS5931于含100μg/mLAmp的3mLLB培养基中,37℃,200r/min培养过夜后涂平板,37℃倒置培养12h,从平板上挑含有目的基因的表达菌BL21(DE3)的单菌落接于含100μg/mLAmp的10mLLB培养基中,37℃,200r/min活化培养12h,将活化的种子液以4%的接种量转接入50mLLB培养基中,培养基中含有100μg/mL的Amp,装液量为20%,37℃,200r/min培养,待OD600达到0.6左右时加入IPTG进行诱导,继续培养6.5h。

10.根据权利要求1中所述的抗肿瘤海鞘多肽CS5931的制备方法,其特征在于:步骤2)中,所述的海鞘多肽CS5931的分离纯化:将发酵所得菌体离心,收集菌体沉淀,称量菌重;冰上融解菌体沉淀,按每克菌加3-5mL细菌裂解液的比例加细菌裂解液,冰上裂解40-60min;超声波破碎菌体后,离心,取上清,用滤膜过滤;利用蛋白纯化系统,以0.05-0.5M的NaCl缓冲液作为洗脱液进行DEAE阴离子交换柱层析,收集0.15MNaCl缓冲液洗脱组分,待用;将上述收集的洗脱组分经Superdex75分子筛凝胶层析,用超纯水做洗脱液,流速为0.5-1.2mL/min,收集洗脱组分,待用。

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