本发明涉及适于将治疗性肽口服递送至下肠(lowerintestine)的凝胶微粒。本发明还涉及制备该凝胶微粒的方法。
背景技术：
：：治疗性肽是一种成功的药物类别，其特征通常包括高效力、良好的疗效和低毒性。世界范围内有超过60种肽药物被许可用于临床应用。合成肽的市场从2004年的50亿美元增长到目前的超过130亿美元[1]。根据市场调查，临床开发中肽的数量超过100种，而临床前开发中肽的数量已超过400种[2]。与传统小分子相比，日益成功的肽治疗剂凸显出稳定性差、口服生物利用度低且可变、血浆清除率快以及生产成本高。这些限制往往使行业没有选择，除了形成肽的可注射剂型外，而可注射剂型产生了显著的生产成本。将肽重新配制为口服剂型能够降低与注射剂型的无菌生产相关的成本。然而，这取决于口服剂型中所需的生物活性肽的量，同时影响递送系统的效率和合成治疗性肽的成本。除了其效力、结构复杂性和给药频率之外，治疗性肽口服递送的经济限制还涉及肽的分子量。对于专门的药物递送，仔细选择候选肽用于重新配制。例如，选择由昂贵的重组方法生产的复合高分子量的肽或蛋白质，随后需要重复的每日给药，不太可能以口服形式在商业上可行；因考虑到该肽可能具有低的口服生物利用度。因此，在选择候选肽时，需要解决这些经济障碍。以口服形式，胰岛素例如可以在糖尿病发展中更早地给药。在某些情况下，对针头的要求可以降低患者的依从性，特别是那些正在接受慢性、未危及生命的疾病的治疗的患者。因此，口服形式可以提高依从性。从治疗角度来看，与注射形式相比，一些肽的口服递送能够代表更生理的途径，因为注射途径可以使糖尿病患者出现高胰岛素血症低血糖[4]。这个问题在开发口服递送系统时也必须考虑。通过消除熟练的专业人员施用某些剂型的需要，口服途径递送肽还可以降低初级保健成本。改善的患者依从性也降低了对初级(primary)干预的要求。通过口服途径递送的好处明显超过了胃肠外途径递送，这在实际中体现为所有药物剂型中有三分之二是口服产品[5]。近年来，基于口服药物递送中新颖的和已建立的概念，许多口服肽剂型已经进展到具有不同程度成功的临床评估。重大的研发努力导致了许多口服胰岛素制剂达到临床试验评估。迄今为止，并没有口服胰岛素制剂被许可用于治疗糖尿病。临床开发中最先进的口服肽制剂是固体剂型制剂，其由用于制备肠溶衣片剂的常规混合固体组成。尽管有这么多的研究，但是很少有解决口服胰岛素剂量递送方式和设计的披露，因此与固体剂型发展有关的开发问题尚待解决。临床开发中的主要肽包括胰高血糖素样肽-1(glp-1)、胰岛素和艾塞那肽、鲑鱼降钙素(sct)、奥曲肽、甲状旁腺激素(pth)和人生长激素(hgh)以及多糖药物、低分子量肝素(lmwh)。在大多数情况中，临床开发中的口服肽形式是已建立的胃肠外治疗剂的新制剂，因此特别地，口服形式的成功与药物功效无关，而是取决于新的药物递送系统的性能。相对于通过胃肠外途径递送的那些，许多口服剂型中肽的量明显更高，这通过肽合成的更高效的方法是可行的。开发口服制剂的一些公司也正在出版专利以提高生产效率(例如biocon，印度us8058391)。口服肽形式的活性物质的数量较多，可以允许一定的肽损失，因为它协调了循环中的每一种前体系(pre-systemic)障碍。很明显，相比于实现安全、有效的再现性，肽生物利用度的价值变得不那么重要。被许可的肽去氨加压素(ddvmp，ferring，switzerland)进一步强调了这一点，其是仅有的被许可通过口服途径在制剂中递送的两种肽之一，生物利用度仅为0.1％。从生物制药方面来看，口服肽递送中遇到的关键挑战是前体系降解、跨肠上皮渗透性差和肝代谢。肽在生产过程如挤出、压制或干燥、产品储存和随后的吸收和全身降解过程中易于化学不稳定、构象不稳定和酶降解。肽的生物活性在胃环境中非常快地丧失，因为苛刻的酸性条件可以减少三级和四级二硫桥，并且还可以促进完整的肽水解成较短的非活性序列。通过用弱酸性聚合物膜进行肠溶包衣可以避免胃环境，其以ph依赖的方式在超过其pka时融化而延迟释放。然而在口服肽递送中药物溶解性至关重要，并且大量的研究尝试提高肽的溶解性来满足该需要。大多数肽药物及其靶受体的结构活性功能使得难以减少氨基酸的数量，而氨基酸的数量有助于分子中氢键供体的量或分子量或logp；没有非常实质的结构活性关系研究。方法包括通过可水解键的烷基化而增加分子量，同时这增加了logp，还增加了分子量。因此，能够促进口服肽递送的合适剂型的重要性是至关重要的。尽管剂型中肽的浓度足够，但是对降解的防止不充分或肽穿过肠上皮的渗透增强的缺乏将导致临床前和临床开发中的失败。大量研究集中在通过化学修饰或非共价复合改善肽的稳定性和渗透性。结构修饰，包括形成前药，是一种成功的药物递送方法，其通常用于改善药物(包括肽和蛋白质)的物理化学性质。聚乙二醇化，即将蛋白质与聚乙二醇的聚合物结合，是增加生物技术药物的血清半衰期的有用途径，该生物技术药物通过胃肠外途径递送。用d-氨基酸合成所有的肽可以预防肽消化并提高肽的生物利用度。例如，当大鼠口服阿米他汀(amistatin)时，五肽脑啡肽中两个d-氨基酸(丙氨酸和亮氨酸)的取代将口服生物利用度提高了20倍以上。2005年，biocon收购了nobex公司(美国)，并获得了名为in-105的聚乙二醇化和烷基化口服胰岛素形式的知识产权(us5359030、us5681811a、us6770625b2、ep1430082b1、us6309633b1)。使用酰基链接头，在b29位置使用聚乙二醇共价修饰胰岛素，这提高了肽对蛋白水解的稳定性并降低致突变性，而肽的药理活性没有明显改变。肽对载体物质的物理复合是化学修饰的可能替代，其可以改善肽的亲脂性特征，并且在一些情况下提高肽的稳定性。离子复合广泛应用于常规小分子药物的配制，由此估计所有药物中有50％被配制成盐。此外，研究还旨在克服胰岛素-b12结合物(1：1)的低效率和蛋白水解，已经导致对负载胰岛素且包覆b12的纳米结构(accesspharmaceutical，usa)的评估，其保护肽免于降解并提高其渗透效率。这种战略方法的另一个实例包括将目标肽与修饰的转铁蛋白结合从而导致更有利的药代动力学(us8129504)。然而，与饱和受体相关的问题仍然受到关注，所述饱和受体能够可重复地改善肽的渗透性，特别是当在研究设计中考虑广泛和多样的饮食时。本发明的目的是克服至少一个上述问题。技术实现要素：令人惊讶地，发明人发现，具有由酪蛋白和壳聚糖形成的基质的微粒对胃酶具有协同抑制作用(图2)，并且与胃粘附(adhesion)相比对肠粘附具有协同作用(图3)。因此，微粒在胃中完整转运并粘附于肠粘膜的能力提高。申请人还发现，在基质中包含渗透增强剂改善了[14c甘露醇]穿过肠粘膜的转运(图5)。选择甘露醇作为替代活性剂，因为其具有与治疗性肽如胰岛素相似的大小和分子量。在第一方面，本发明提供了一种适于通过口服途径完整递送至哺乳动物下肠的凝胶微粒，该凝胶微粒包含由至少部分水解的酪蛋白、壳聚糖和活性剂形成的单分散基质，并且包含少量的至少一种渗透增强剂，所述渗透增强剂分散在整个基质中。另一方面，本发明提供了一种适于通过口服途径完整递送至哺乳动物下肠的凝胶微粒，该凝胶微粒包含由至少部分水解的酪蛋白和/或壳聚糖和活性剂形成的单分散基质，并且通常包含少量的至少一种渗透增强剂，所述渗透增强剂分散在整个基质中。优选地，所述至少一种渗透增强剂选自tca和维生素b12。与其他渗透增强剂相比，tca与壳聚糖的组合显示出优异的渗透增强作用(图9a和图11)。将10、25和50mg的tca加入到包封系统中降低了teer，并且使甘露醇的渗透性增加了5、8和11倍，至10-5cm/s的量级范围内，通常用具有良好的渗透性的物质才观察到的系数范围。令人惊讶地，维生素b12的存在有助于通过受体介导的胞吞作用(例如维生素b12受体)的肽转运(图9b和图10)。维生素b12在2小时内显著降低teer，另外增加甘露醇通量，在25mg浓度的包封体系中显示出11.5倍的增加。受体介导递送肽，该肽通过使用维生素b12受体负载，代表了对直接结合的有吸引力的替代，因为它保护治疗性肽并提高渗透效率。在一个实施例中，活性剂是低分子量的治疗剂。理想地，该至少一种渗透增强剂包括tca和维生素b12。优选地，低分子量的治疗剂是治疗性肽。在一个实施例中，微粒包含50-80％的酪蛋白(w/w)。在一个实施例中，微粒包含68-75％酪蛋白(w/w)。在一个实施例中，微粒包含1-5％壳聚糖(w/w)。在一个实施例中，微粒包含2-4％的壳聚糖(w/w)。在一个实施例中，微粒包含20-40％的活性剂(w/w)。在一个实施例中，微粒包含24-35％的活性剂(w/w)。在一个实施例中，微粒包含0.001-0.1％的渗透增强剂(w/w)。在一个实施例中，微粒包含0.001-0.1％额渗透增强剂(w/w)。在一个实施例中，微粒包含0.005-0.02％的tca(w/w)。在一个实施例中，微粒包含0.02-0.06％的维生素b12(w/w)。通常，凝胶微粒包含：至少50-80％的酪蛋白(w/w)；至少3％的壳聚糖(w/w)；和至少20-40％的活性剂(w/w)。优选地，凝胶微粒包含：68-75％的酪蛋白(w/w)；5-8％的壳聚糖(w/w)；和24-35％的活性剂(w/w)。更优选地，凝胶微粒包含：68-75％的酪蛋白(w/w)；5-8％的壳聚糖(w/w)；24-35％的活性剂(w/w)；0.005-0.02％的tca(w/w)；和0.02-0.06％的维生素b12(w/w)。本发明还提供了本发明的凝胶化微粒的干燥形式。本发明还提供了包含本发明的凝胶微粒的固体口服剂型。本发明还提供了包含本发明的凝胶微粒与至少一种药物赋形剂的直接压制片剂。本发明还提供了包含本发明的凝胶微粒与合适的药物载体的药剂。在第二方面，本发明涉及一种制备凝胶微粒的方法，该凝胶微粒包含活性剂并且适于通过口服途径将活性剂完整地递送至哺乳动物下肠，该方法包括以下步骤：在合适的溶剂中提供部分水解的酪蛋白和壳聚糖的溶液，其中部分水解的酪蛋白带负电荷而壳聚糖带正电；向溶液中加入活性剂和渗透增强剂以提供微滴形成溶液；通过装置挤出微滴形成溶液以形成微滴；将微滴浸入酸化浴中以形成凝胶微滴；和任选地，干燥凝胶微滴。通常，微滴形成溶液通过喷射切割装置挤出以形成微滴。在一个实施例中，本发明包括制备分开的酪蛋白和壳聚糖溶液的初始步骤，混合分开的溶液以提供复合溶液，然后加热复合溶液以提供部分水解的酪蛋白和壳聚糖的溶液，其中部分水解的酪蛋白带负电荷而壳聚糖带正电荷。优选地，微滴形成溶液包含20-30％的酪蛋白(w/v)和1-5％的壳聚糖(w/v)。本发明还涉及将本发明的凝胶微粒(或包含本发明的凝胶微粒的药物或口服剂型)用于治疗哺乳动物糖尿病的方法中，其中本发明的凝胶微粒包含治疗有效量的胰岛素或胰岛素类似物，任选地与胰岛素敏化剂组合。定义“凝胶微粒”是指平均尺寸为10-250微米的颗粒，如通过电子显微镜测定的，其最初形成为液体微滴，将液体微滴立即浸入凝胶浴中以形成凝胶微粒。“适于通过口服途径完整地递送至哺乳动物下肠”是指当口服递送时微粒能够在胃转运存活并且基本上完整地递送到下肠。“单分散基质”是指微粒的组分在单相中均匀混合。这与具有核-壳形态的微胶囊不同。在单分散基质中，所有组分都暴露在表面，并且可与其环境相互作用以提供功能性的益处。“酪蛋白”是指乳(dairy)酪蛋白，其可以以酪蛋白粉(例如酪蛋白酸钠)，或含有总蛋白重量15-85％的酪蛋白的牛奶衍生粉末或液体提供。牛奶衍生粉末的实例是脱脂奶粉，牛奶衍生液体的实例是uht牛奶。优选地，酪蛋白源包含占酪蛋白源中总蛋白重量至少50％的酪蛋白，优选地至少60％，优选地至少70％，优选地至少80％。“部分水解的酪蛋白”是指酪蛋白部分水解以使至少一些蛋白质分解成较小的多肽，从而当微滴浸入凝胶浴中时促进随后的凝胶化。水解程度是可变的，并且可以通过常规实验确定。通常，酪蛋白水解至20-78％水解的水解程度，使用(hydrolysisofproteinsperformedathightemperaturesandforshorttimeswithreducedracemization,inordertodeterminetheenantiomersofd-andl-aminoacids,csapo,j.等,actauniv.sapientiae,alimentaria,2008；31–48页)方法来测定。水解方法是本领域技术人员已知的，并且包括热水解和蛋白水解。在一个实施例中，酪蛋白在80-90℃下水解10-20分钟。应当理解，在较低温度下水解更长时间能够实现相同程度的水解。“壳聚糖”是本领域公认的术语，为了本说明书的目的，其包括天然壳聚糖(聚-(d)葡糖胺)和壳聚糖衍生物，包括三甲基壳聚糖、二甲基乙基壳聚糖、三乙基壳聚糖。壳聚糖不需要水解——然而，通常优选地在121℃下灭菌15分钟。因此，理想地，将壳聚糖灭菌(即进行商业灭菌处理)。“渗透增强剂”是指能够增强胰岛素转运穿过肠上皮的分子。在一个实施例中，该术语是指使用尤斯灌流室(ussingchamber)能够增强[14c]-甘露醇从一段大鼠肠组织的顶端转运至基底侧的分子，如下所述。适于增强转运穿过肠上皮的渗透增强剂的实例是本领域技术人员已知的，并且包括胆汁盐。在本发明的一个实施例中，渗透增强剂选自胆汁酸和维生素b12。在一个优选的实施例中，使用两种渗透增强剂，即牛黄胆酸(tca)和维生素b12，或其衍生物。用于渗透增强剂的“少量”指少于干燥微粒的1％(w/w)，优选小于干燥微粒的0.1％(w/w)。“活性剂”是指意在以口服剂型递并且通过肠上皮送至哺乳动物体内的药物或药物活性剂。在一个实施例中，活性剂是低分子量的治疗剂，具有小于20kda的分子量(mw)，优选地小于15kda，理想地小于10kda。在一个实施例中，活性剂是治疗性肽或低分子量的肝素。“治疗性肽”是指药物活性肽(或包含治疗性肽的类似物或结合物)，其通常是疏水性的且不溶于水并通过注射手段常规地递送。其实例是本领域技术人员已知的，包括胰岛素、艾塞那肽、glp-1、鲑鱼降钙素(sct)、奥曲肽、甲状旁腺激素(pth)和人生长激素(hgh)。术语肽通常是指由多达50个的氨基酸单体通过肽键连接组成的聚合物。这些肽可以通过常规方法制备，即化学合成或重组技术。必要时，本发明中使用的任何肽都可以进行化学修饰以提高其稳定性。化学修饰的肽或肽类似物包括肽的任何功能化学等价物，其特征在于本发明的实践中其在体内或体外增加的稳定性和/或功效。术语肽类似物还指本文所述的肽的任何氨基酸衍生物。肽类似物可以通过包括但不限于侧链修饰、肽合成期间非天然氨基酸和/或其衍生物的引入以及使用交联剂和其它对肽或其类似物施加构象约束的方法来制备。侧链修饰的实例包括氨基修饰，例如通过与醛反应然后用nabh4还原来还原烷基化；用乙酰亚氨酸甲酯(methylacetimidate)酰胺化；用乙酸酐乙酰化；氨基与氰酸酯的氨基甲酰化；氨基与2,4,6-三硝基苯磺酸(tnbs)的三硝基苯甲酰化；氨基与琥珀酸酐和四氢邻苯二甲酸酐的烷基化；以及赖氨酸与吡哆醛-5'-磷酸的吡哆醛化反应，然后用nabh4还原。精氨酸残基上的胍基可以通过与试剂(例如2,3-丁二酮、苯乙二醛和乙二醛)反应形成杂环缩合产物进行改性。羧基可以通过碳化二亚胺活化进行修饰，形成邻酰基异脲，然后衍生成例如相应的酰胺。巯基可以通过以下方法修饰，例如用碘乙酸或碘乙酰胺进行羧甲基化；过甲酸氧化成半胱氨酸；与其他硫醇化合物形成混合的二硫化物；与马来酰亚胺、马来酸酐或其它取代的马来酰亚胺反应；使用4-氯汞苯甲酸酯、4-氯汞苯磺酸、苯基氯化汞、2-氯汞-4-硝基苯酚和其它汞制剂形成汞衍生物；在碱性ph下用氰酸酯进行氨基甲酰化。色氨酸残基可以通过，例如用n-溴代琥珀酰亚胺氧化或用2-羟基-5-硝基苄基溴或磺酰卤化物使吲哚环烷基化来修饰。可以通过用四硝基甲烷硝化以形成3-硝基酪氨酸衍生物来改变酪氨酸残基。组氨酸残基的咪唑环的修饰可以通过用碘乙酸衍生物烷基化或用碳酸二乙酯进行n-碳乙氧基化(n-carbethoxylation)来完成。在肽合成中引入非天然氨基酸和衍生物的实例包括但不限于使用正亮氨酸、4-氨基丁酸、4-氨基-3-羟基-5-苯基戊酸、6-氨基己酸、叔丁基甘氨酸、正缬氨酸、苯基甘氨酸、鸟氨酸、肌氨酸、4-氨基-3-羟基-6-甲基庚酸、氨基酸的2-噻吩丙氨酸和/或d-异构体。“胰岛素类似物”是指在体内模拟胰岛素作用的分子。在文献中描述了许多类似物，包括艾塞那肽、芳基烷基钒盐、硒、α-硫辛酸等。“胆汁酸”是指主要在哺乳动物胆汁中发现的类固醇酸。该术语不包括胆汁盐，胆汁盐是与牛磺酸或甘氨酸结合的胆汁酸。胆汁酸的实例包括胆酸衍生物，例如牛磺胆酸(tca)和甘氨胆酸，以及鹅去氧胆酸衍生物，例如牛磺鹅去氧胆酸和甘氨鹅去氧胆酸(clycochenodeoxycholicacid)衍生物。胆汁酸的一些实例示于图13中。“tca”是指牛磺胆酸。优选地，tca是中等粘度的tca，具有300-400kda的分子量，理想地约350kda。“维生素b12”是指钴胺素和钴胺素衍生物，如氰钴胺素、羟钴胺素、甲基钴胺素、腺苷钴胺素。通常，维生素b12包括平面四吡咯的和络合的钴。“(w/w)”是指干重，即组分x的重量占干燥至水分活度(aw)为0.20的微粒总重量的a％。“水分活度(aw)”，食物/成分的水分活度(aw)是当处于与周围空气介质完全不受干扰的平衡时，成分本身的蒸气压与同等条件下蒸馏水的蒸气压的比例。用于测量水分活度最常用的方法是平衡相对湿度方程(erh)，用百分比表示，或以十进制的水分活度表示。存在于食品中的总水量的一部分与特定位点强烈结合而不能作为溶剂。这些位点包括多糖的羟基、蛋白质的羰基和氨基、以及通过氢键、离子-偶极键或其他强相互作用能够保留水的其他位点。这种结合作用被称为食物的吸附行为。用于研究食品中水的吸附性的最成功的方法是制备“吸附等温线”，或者是食品中水的分压与其恒定温度下的含水量的相关曲线。按照相同的做法研究平衡条件下的水分活度与含水量的相关曲线。使已知含水量的食物在紧密外壳中具有小的顶部空间中达到平衡，并通过压力计测量水分活度的分压，或使用比重计测量相对湿度。水分活度等于平衡相对湿度除以100：(aw＝erh/100)…其中erh是平衡相对湿度(％)。种类繁多的相对湿度传感器可用于此目的，包括电比重计、露点计、干湿球温度计等。“干燥形式”是指将微粒干燥至水分活度(aw)小于0.40，优选地小于0.30，更优选地约0.20，使用与平衡相对湿度(erh)相关的方法和方程测定，其以百分比表示，或以十进制的水分活度表示。“口服剂型”是指适合口服给药的剂型。实例包括片剂、丸剂、胶囊剂、粉剂、颗粒剂、薄片剂等。“固体口服剂型”是指可以通过直接压制形成并且可以包含直接压制赋形剂(如dc甘露醇和崩解剂或超级崩解剂、调味剂)的片剂、丸剂或胶囊。用于口服给药的组合物可以是任何口服可接受的剂型，包括胶囊、片剂、乳剂和含水悬浮液、分散体和溶液。在片剂的情况中，常用的载体包括乳糖和玉米淀粉。还通常加入润滑剂，例如硬脂酸镁。对于以胶囊形式口服给药，有用的稀释剂包括乳糖和干玉米淀粉。当口服含水悬浮液或乳剂时，活性成分可以悬浮或溶解在油相中，该油相与乳化剂或悬浮剂组合。如果需要，可以加入某些甜味剂、调味剂或着色剂。通常药学上可接受的载体与一种或多种上述活性化合物一起使用。药物组合物中的载体在某种意义上必须是“可接受的”，即它与组合物的活性成分相容(优选地能够稳定活性成分)并且对于待治疗对象无害。一种或多种增溶剂可用作递送上述化合物的药物赋形剂。载体的其他实例包括胶体氧化硅、硬脂酸镁、纤维素、月桂基硫酸钠和d&c黄色10号(d&cyellow#10)。“合适的溶剂”通常是指具有ph的缓冲溶液，在该ph下，酪蛋白带负电荷而壳聚糖带正电荷，从而允许酪蛋白和壳聚糖相互作用形成微粒。通常，ph为6-7的溶剂确保酪蛋白和壳聚糖的电荷正确，理想地约6.5。在一个实施例中，酪蛋白和壳聚糖在组合之前分开溶解。“酪蛋白溶液”：在一个实施例中，首先将酪蛋白溶解在ph为7-9的水中，优选地约7.5-8.5，理想地约为ph8。在一个实施例中，使用20-30％酪蛋白，优选地22-26％，理想地约24％(w/v)。在一个实施例中，将酪蛋白溶解至少12小时，优选地至少18小时，理想地约24小时。“壳聚糖溶液”：在一个实施例中，首先将壳聚糖溶解在弱酸中，例如乙酸或柠檬酸，优选地0.005-0.02％的有机弱酸。在一个实施例中，使用1-5％的壳聚糖，优选地2-4％，理想地约3％(w/v)。在一个实施例中，将壳聚糖脱气至少12小时，优选地至少18小时，理想地约24小时。“通过装置挤出”是指使微滴形成溶液通过装置，该装置将溶液分成微滴。合适的装置的实例包括喷嘴(包括振动喷嘴)、喷雾干燥器、喷射切割器和旋转盘式切割机、静电挤出机。喷射切割器在vorlup和bredford[47]中描述。“酸化浴”是指缓冲至pka约4-5的浴，优选地约4.7-4.8。在一个实施例中，浴包含有机酸缓冲溶液，优选柠檬酸缓冲液。在一个实施例中，有机酸缓冲溶液的浓度为0.4-0.8m，优选地为0.5-0.7m，理想地为约0.6m。“弱酸”是指在水中仅部分解离的酸，例如乙酸或碳酸。附图说明图1：用于聚合聚合材料的喷射切割器技术以进行肽包封；图2：相对于nacas微粒或壳聚糖颗粒(n＝6)，nacas-壳聚糖-b12-tca微粒对胰蛋白酶和α-糜蛋白酶活性的酶抑制作用率(p<0.05)；图3：相对于nacas和壳聚糖微粒(n＝6)，nacas-壳聚糖-b12-tca微粒在猪胃(a)和肠(b)中的生物粘附率(p<0.05，n＝6)；图4：nacas-壳聚糖-b12-tca微粒对安装在尤斯灌流室中分离的大鼠结肠粘膜中teer的影响，图例为不同浓度的nacas-壳聚糖-b12-tca混合物(n＝3)；图5：nacas-壳聚糖-tca微粒对卡巴胆碱诱导的分离大鼠结肠粘膜中生电氯化物分泌变化的影响，通过短路电流(μa)的变化来测量。图例为不同浓度的nacas-壳聚糖-tca微粒(n＝5)；图6：0.9mg/ml胰岛素的色谱图；图7：胰岛素的标准曲线，线性范围为0.04-0.4mg/ml(n＝1)；图8a：负载胰岛素干燥前的共聚焦扫描激光显微镜(cslm)图像。微粒直径约为180μm；图8b：负载胰岛素微粒干燥后的扫描电子显微镜(sem)图像。微粒直径约为5μm(aw0.25)；图9a：nacas-壳聚糖微粒中存在tca时对安装在尤斯灌流室中分离的大鼠结肠粘膜中teer的影响。图例是不存在tca以及存在不同浓度(n＝3)的tca时的nacas-壳聚糖微粒；图9b：nacas-壳聚糖微粒中存在维生素b12时对安装在尤斯灌流室中分离的大鼠结肠粘膜中teer的影响；图例是不存在维生素b12以及存在不同浓度(n＝3)的维生素b12时的nacas-壳聚糖微粒；图10：掺入nacas-壳聚糖微粒时，对每种渗透增强剂(tca和vitb12)计算的papp值的总结(*p<0.01，**p<0.001，**<0.0001)。图11：胆汁酸组成元素。具体实施方式方法材料除了蓝色葡聚糖(bd)和维生素b12(氰钴胺素)外，还获得了酪蛋白酸钠(nacas)和壳聚糖(>90％干物质，350kda)。制备聚合物溶液-酪蛋白酸钠(nacas；24％，w/w总固体)在去离子水中并允许在室温下完全水合24小时。将分散液调节至所需的ph8.0(用1mhcl或1mnaoh)。-在0.01％乙酸中制备壳聚糖(3.0％w/w)并允许在冷藏温度下脱气24小时。-混合nacas和壳聚糖以实现最终蛋白质浓度为11％(w/w)和最终壳聚糖浓度为1.5％(w/w)。-将最终的ph调节至ph6.5(用hcl1m或naoh1m)。-在85℃搅拌进行热水解15分钟。-将分散液冷却至37℃，并与牛磺胆酸(tca)混合，以使最终混合物中tca的最终浓度为3500mg。-然后将分散液冷却至30℃。-在0.01mhcl中分散20mg/ml胰岛素和10mg/ml氰钴胺素(2:1比例)，并分散在上述混合物中。-通过喷射切割旋转圆盘工艺挤出分散液。-微粒在0.6mpka4.76的柠檬酸缓冲液中下降并聚合。-温和搅拌35分钟后回收聚合的微粒。-产生20-100微米的微粒。-将微粒在30℃真空干燥，直到水分活度(aw)达到0.20。测试和结果i)微粒渗透性方法将蓝色葡聚糖(bd)加入到nacas-壳聚糖-b12-tca混合物中(比率1:25)，并且使负载bd的微粒通过如上所述的喷射切割系统。-将负载bd的微粒悬浮于1mldmem中并加入到顶端室中(n＝3)。对等量的游离bd进行相同的操作。-计算表观渗透系数(papp)：papp(cm.s-1)＝(dq/dt)×[1/(a.c0)](方程1)其中dq/dt，bd跨越单层的通量(mol/s)，c0-在顶端室中bd的初始浓度(mol/ml)，以及a，单层的表面积(3.14cm2)。评论：bd(2000kda)是通常用作细胞旁(paracellular)标记的分子。通过nacas-壳聚糖-b12-tca微粒的负载，bd的转运显著增加(r＝1.98)(表1)。该结果与teer值良好对应，其中观察到teer降低。因此，nacas-壳聚糖-b12-tca微粒能够通过紧密的细胞连接开口促进细胞旁转运。这说明了游离bd和包封在nacas-壳聚糖-b12-tca微粒中的bd之间的统计学显著性(p<0.01)。这表示通过紧密的连接开口运输治疗性肽的潜力。表1.游离bd和包封的bd通过caco-2细胞的运输渗透性(p<0.01)。ii)研究对蛋白水解酶(胰蛋白酶/α-糜蛋白酶)的抑制作用方法-将nacas-壳聚糖-b12-tca微粒分散(1％w/w)在1ml磷酸盐缓冲溶液(0.3m，ph7.5)和1mlbapna(n-苯甲酰基dl-精氨酸对硝基苯胺，20mm，)中。在37℃下加入来自牛胰腺(fisherscientific)的胰蛋白酶溶液(30ui)。这种评价关注的是胰蛋白酶抑制。-将nacas-壳聚糖-b12-tca微粒进一步分散(1％w/w)在1mltris-hcl缓冲溶液(ph7.8)和1mlbtpna(n-苯甲酰基-l酪氨酸对硝基苯胺，1.18mm，)中。在37℃下加入来自牛胰腺的α-糜蛋白酶(40ui)。-45分钟后，用1％的三氯乙酸溶液停止酶反应，并在405nm处定量形成的代谢物对硝基苯胺。评论：孵育45分钟后，nacas-壳聚糖-b12-tca微粒抑制87.55％±1.43％的胰蛋白酶活性，和78.26％±3.09％的α-糜蛋白酶活性。该抑制效果相对于nacas微粒和壳聚糖-b12-tca微粒明显更好。因此，nacas-壳聚糖-b12-tca微粒的功效明显高于制剂的单个成分。这表明制剂中的组分的协同作用(图2)。iii)离体粘膜粘附试验方法：-在麻醉下将猪胃肠移除并插入陪替氏培养皿(petridish)中。-将30个微粒(n0，n＝15)置于动物组织内。-将陪替氏培养皿连接到usp崩解装置，120分钟(n)后，跟进在900mlph1.2或ph6.8usp缓冲液中粘附到组织上的微粒数以计算：％粘附＝(n0-nt)/n0×100(方程2)评论：孵育3小时后，nacas-壳聚糖-b12-tca微粒对猪肠道表现出明显的粘附(82.2％±1.43％)，但没有记录到对胃组织明显的粘附(图3b)。nacas-壳聚糖-b12-tca微粒的粘附能力明显大于制剂的单独元素，因nacas和壳聚糖微粒未能显示出有效的粘附能力(图3b)。iv)评估细胞相容性用于对细胞旁转运的影响方法：-如上所述制备nacas-壳聚糖-b12-tca微粒(n＝15)-将消化的混合物用细胞培养基稀释1/2，将dmem加入到caco-2细胞的顶端(40-45通道)。-去除聚合物后，在定义的时间长至2h和48h跟进上皮电阻(teer)。-通过台盼蓝排除(终浓度0.15％)评估细胞的存活率。评论：2小时的接触时间后，caco-2细胞存活率维持在98.5％-100％，优于95％(数据未显示)。因此，认为nacas-壳聚糖-b12-tca消化的微粒具有良好的生物相容性。v)渗透增强剂面板对[14c]-甘露醇的teer和papp的影响尤斯灌流室允许运输分子从一段肠组织(啮齿动物)的顶端到基底外侧的测量，从而模拟在体内通过肠壁的通道。所测试的渗透增强剂是(不限于)在食品中消耗时找到的物质，或在各种国家药典(nationalcompendia)中列出的物质。在分离的大鼠结肠粘膜中，通过测量[14c]-甘露醇的跨上皮电阻(teer)和渗透性来测试渗透增强剂增强肠道渗透性的能力。通过闪烁计数计算标记分子(放射标记的糖([c14]-甘露醇))的渗透性。通过在实验的持续时间内维持启动电阻(>70ω.cm-2)，测量到大鼠结肠的对照段的渗透性维持低渗透性。低渗透系数(papp)值(2.9×10-6cm/s±1.6×10-6cm/s(sd)或±0.3×10-6cm/s(sem))。在生物药剂学分类系统中10-6cm/s数量级的papp值被描述为渗透性差。方法：分离的大鼠肠粘膜中的电生理-将剥离的空肠或结肠粘膜安装在尤斯灌流室(wpi，英国)中，尤斯灌流室的圆形窗口面积为0.63cm2，两侧用5mlkh缓冲液浸浴，并在37℃下用95％o2/5％co2连续充气。-在开路结构中测量跨上皮电位差(pd，mv)，然后通过自动电压钳插入所需的短路电流(isc，μacm-2)将组织电压钳位为零pd(evc-4000放大器，wpi，英国)。-通过使用定时器(pro-4，wpi，uk)，每30秒切换至开路条件3秒来交替监测isc和pd。模拟数据用数据采集单元数字化并用软件包(ad仪器，英国)进行分析。-平衡45分钟后，测量基线pd和isc，根据欧姆定律计算teer(ωcm2)。[14c]-甘露醇的渗透性-使用放射标记的甘露醇从顶端腔室转运到基底室来测量肠渗透性。]-在顶端腔室中加入[14c]-甘露醇(0.2μci)后，在2小时内周期性地监测通量，通过在2小时内每20分钟在浆膜腔(100μl)中取样，并在0时置顶(100μl)，在每个采样点补充新鲜的kh缓冲液。-将含有[14c]-甘露醇的样品与闪烁液混合，并在闪烁分析仪(packardtricarb2900tr)中读数。-甘露醇和fd4的表观渗透系数(papp)根据等式计算：papp(cm/s)＝(dq/dt)(1/ac0)，其中dq/dt是运输速率(mol/s)；a是单层的表面积(cm2)，c0是供体室中的初始浓度(mol/ml)。评论：使用上述条件，在尤斯灌流室中消化并呈现nacas-壳聚糖-b12-tca微粒。teer的浓度和时间依赖性降低，同时2、4和10mg/ml的甘露醇papp存在增强，这对应于的10、20和50mg/单独的尤斯灌流室。加入nacas-壳聚糖-tca微粒混合物使14c甘露醇的papp增加了12倍，达到10-5cm/s的数量级，一个用具有良好渗透性物质(bcsi类)通常观察到的系数范围(图4)。该消化的聚合混合物表明在最低浓度下明显提高渗透性(papp)的能力(参见图4)。tca是一种粗胆汁酸，具有fdagras状态，可用作食品添加剂和补充剂。本发明的早期假说涉及tca的渗透增强能力，以增加肽的摄取如甘露醇和胰岛素。因此，nacas-壳聚糖-b12-tca微粒可用于递送有效的药物肽、食品补充剂或功能性食品中的肽。这表明nacas-壳聚糖-b12-tca微粒具有递送治疗性肽的潜力，所述治疗性肽具有与甘露醇即胰岛素相似的分子量。表2.对筛选的每种nacas-壳聚糖-tca混合物计算的papp值的总结(*p<0.01，**p<0.001，***<0.0001)vi)聚合混合物对卡巴胆碱响应的影响为了研究nacas-壳聚糖-b12-tca微粒对肠组织的任何可能的损伤作用，用增加浓度的卡巴胆碱处理组织。方法：卡巴胆碱制剂-卡巴胆碱(cch)是毒蕈碱受体激动剂，毒蕈碱受体激动剂通过顶端氯化物通道刺激ca2+依赖性氯化物分泌。cch的激活导致向内短路电流，通过电生理测量中的δisc测量。在健康组织中卡巴胆碱诱导氯化物分泌，可以通过组织上的负电荷的增加来测量。-组织对cch响应的能力表明它具有保留的功能，替代标记物无活力。-组织响应于毒蕈碱激动剂(卡巴胆碱)(0.1-10μm)的浆膜添加而产生向内短路电流的能力被用作实验终点时的上皮离子转运功能的量度。评论：从对照(典型的健康组织)可以看出氯化物分泌的浓度依赖性增加(图5)。nacas-壳聚糖-b12-tca微粒明显损害了组织响应卡巴胆碱的能力，但不能完全消除它，如在其他有害化合物中看到的。vii)检测微粒中的胰岛素高效液相色谱(hplc)方法经优化，可以检测出nacas-壳聚糖-tca微粒中0.8-0.05mg/ml范围内的胰岛素，以及nacas-壳聚糖-tca微粒中5-20mg/ml的胰岛素。图6是该方法的一个实例，显示出在8分钟时洗脱了胰岛素。后来发现，为了计算胰岛素在微粒中的包封效率的目的，该方法需要进一步优化以区分胰岛素和nacas。图7显示了为该方法开发的标准曲线，具有0.9-0.04mg/ml的线性范围。viii)迷你片剂的固体剂型方法：通过干混nacas-壳聚糖-tca微粒并进行直接压制来制备迷你片剂(50mg)的固体剂型。每个固体通过100μm丝网筛磨碎。接着将所有的添加剂在可密封容器中混合并以每分钟60反转的速率剧烈混合10分钟(5g固体悬浮液产生100个迷你片剂)。样品沉降后，加入所有崩解剂并以每分钟60反转的速度混合10分钟。这将最终取决于制造商的直接压制说明，这是在没有湿法制粒或干法制粒(碾压)的情况下在实验室水平所要求的。图9示出了加入到迷你片剂制剂中的喷射切割微粒的形态，图10示出了微型片剂。参考文献1.vlieghe，p.，etal.，synthetictherapeuticpeptides：scienceandmarket.drugdiscovtoday，2010.15(1-2)：p.40-56.2.lax，r.，thefutureofpeptidedevelopmentinthepharmaceuticalindustry.pharmanufacturing：theinternationalpeptidereview，2010(2)：p.10-15.3.owens，d.r.，newhorizons--alternativeroutesforinsulintherapy.natrevdrugdiscov，2002.1(7)：p.529-40.4.al-achi，a.，guptam.r.，stagnerw.c.，tabletproductdesignin：integratedphrmaceutics：appliedpreformulation，productdesign，andregulatoryscience(2013)wileypp215-318.5.colontargeting：anemergingfrontierfororalinsulindelivery.expertopinionondrugdelivery.10(6)：p.731-739.当前第1页12当前第1页12