一种无籽刺梨总黄酮及其制备方法与应用与流程

本发明属于药物技术领域，具体涉及一种植物有效成分提取制备方法，更具体地，涉及一种无籽刺梨中总黄酮及其制备方法与其在制备抗氧化、降血糖和降血脂药物中的应用。

背景技术：

贵州省特有种无籽刺梨(Rosa sterilis S.D.Shi)与刺梨(R.roxburghii Tratt)同为蔷薇科(Rosaceae)蔷薇属(Rosa)多年生攀援小灌木，别名搭钩刺梨、光枝无籽刺梨和安顺金刺梨等。其果实口感清香爽口，酸甜适度，富含Vc及多种矿物营养元素，其鲜果的Vc含量高达1133mg/100g，比梨高377倍，比苹果高225倍，被誉为“新山珍”，鲜食加工均可。近年来，有关刺梨的化学成分和生物活性的研究报道较多，研究表明黄酮类化合物是刺梨的主要有效成分，具有提高免疫功能、延缓衰老、抗动脉粥样硬化、抗氧化、预防癌症、降血脂等生理活性。

近年来，国内学者采用单因素试验或正交试验法，或结合微波辅助提取法和超声辅助提取法对刺梨黄酮提取工艺开展了一些研究，研究发现超声辅助提取法的提取效率明显优于其他传统提取方法。与传统的正交试验法相比较，响应面法作为一种工艺条件优化的有效设计分析方法，在食品、农业、医药和生物等领域得到了广泛应用。近年来高血糖、高血脂等已成为主要威胁我国人民生命健康的问题之一，人体代谢产生的自由基对机体机能造成的损伤，引发衰老、癌症等问题也越来越引起极大的重视。

目前对无籽刺梨研究主要集中在其形态学与分类、繁殖、亲缘关系、光合生理、果实营养成分及挥发性成分等方面，而对无籽刺梨黄酮等有效成分的研究尚未见报道。

技术实现要素：

本发明的目的在于针对现有技术存在的上述不足之处，提供一种以无籽刺梨为原料，经过优选工艺分离得到精制总黄酮的方法及其在制备抗氧化、降血糖和降血脂药物中的应用。本发明所述的无籽刺梨中的总黄酮具有抗氧化活性，可以用于抗氧化治疗，可应用于制备抗氧化药物；所述的无籽刺梨中的总黄酮具有降血糖和降血脂活性，可应用于制备降血糖药物及降血脂药物。

为了实现本发明的上述目的，本发明采取的技术方案为：

本发明提供一种无籽刺梨总黄酮，其是通过以下方法制备所得到的：

(1)将无籽刺梨果实洗净自然晾干后置于50℃烘箱烘干至恒重，粉碎过40目筛后备用；

(2)取步骤(1)制备得到的无籽刺梨粉末，采用超声辅助提取工艺进行提取，收集提取液，合并，于50℃减压浓缩至无醇味，得到浓缩液；

(3)取步骤(2)制备得到的浓缩液，用色谱柱吸附，以蒸馏水洗脱去杂后，用乙醇溶液洗脱，收集乙醇洗脱液，经减压浓缩干燥，得到无籽刺梨总黄酮提取物。

如所述的一种无籽刺梨总黄酮，其中无籽刺梨总黄酮提取物纯化后的总黄酮含量为116.21±0.05mg/g。

如所述的一种无籽刺梨总黄酮，其中所述的超声辅助提取无籽刺梨总黄酮采用提取时间50‐70min、料液比1:20‐1:25、乙醇体积分数40％‐60％、提取次数3‐5次。

本发明同时提供一种无籽刺梨总黄酮的制备方法，所述的制备方法包括下述步骤：

(1)将无籽刺梨果实洗净自然晾干后置于50℃烘箱烘干至恒重，粉碎过40目筛后备用；

(2)取步骤(1)制备得到的无籽刺梨粉末，采用超声辅助提取工艺进行提取，收集提取液，合并，于50℃减压浓缩至无醇味，得到浓缩液；

(3)取步骤(2)制备得到的浓缩液，用色谱柱吸附，以蒸馏水洗脱去杂后，用乙醇溶液洗脱，收集乙醇洗脱液，经减压浓缩干燥，得到无籽刺梨总黄酮提取物。

如所述的一种无籽刺梨总黄酮的制备方法，其中通过单因素试验和采用响应面法分析优化无籽刺梨总黄酮超声辅助提取工艺，步骤(2)中超声辅助提取无籽刺梨总黄酮采用提取时间50‐70min、料液比1:20‐1:25、乙醇体积分数40％‐60％、提取次数3‐5次。

如所述的一种无籽刺梨总黄酮的制备方法，其中步骤(3)所述的色谱柱为大孔树脂色谱柱，洗脱液为70％‐90％的乙醇。

本发明另外还提供了一种无籽刺梨总黄酮在制备抗氧化药物、降血糖药物和降血脂药物中的应用。

本发明通过单因素试验和采用响应面法分析优化无籽刺梨总黄酮超声辅助提取工艺，优选出步骤(2)中最佳的超声辅助提取无籽刺梨总黄酮的工艺为：提取时间50‐70min、料液比1:20‐1:25、乙醇体积分数40％‐60％、提取次数3‐5次，可最大程度上提取出无籽刺梨中的黄酮类化合物。

作为优选方案，步骤(3)所述的色谱柱为大孔树脂色谱柱，同时，本发明通过大量实验优选出最佳体积浓度的乙醇洗脱液为70％‐90％的乙醇，采用该浓度的乙醇洗脱液，可最大程度上将黄酮类化合物洗脱，杂质少。

本发明制备得到的无籽刺梨总黄酮具有很好的抗氧化活性和降血糖活性，且具有显著的降血脂作用，可用于制备抗氧化药物、降血糖药物及降血脂药物。

与现有技术相比，本发明的优点和积极效果在于：

本发明所述的无籽刺梨总黄酮的制备方法简单，避免采取回流提取等加热提取方法，制备出的无籽刺梨总黄酮活性强。且采用了响应面法分析优化无籽刺梨总黄酮超声辅助提取工艺，提取效率高；并通过大量实验优选出利用大孔树脂柱吸附，并采用优选洗脱液洗脱，分离得到的精制总黄酮纯度高，杂质含量少。

所述的无籽刺梨总黄酮的制备及其在制备抗氧化和降血糖、降血脂药物中的应用，其特征在于：所述无籽刺梨总黄酮，利用体外化学评价法测评其抗氧化活性，结果表明无籽刺梨总黄酮具有抗氧化活性，同时运用了斑马鱼为实验动物模型评价其降血糖和降血脂活性，实验研究表明，无籽刺梨中的总黄酮具有很好的降血糖活性，且具有显著的降血脂作用。

附图说明

图1为无籽刺梨总黄酮对DPPH自由基清除作用曲线。

图2为无籽刺梨总黄酮对ABTS自由基清除作用曲线。

图3为无籽刺梨总黄酮提取物配制成的水溶液(3μg/mL)和阿卡波糖降糖率与模型对照组比较

图4为无籽刺梨总黄酮提取物配制成的水溶液处理后斑马鱼血脂降低率与模型对照组比较

具体实施方式

为了更好的理解本发明，下面结合附图，用本发明的实施例对本发明作进一步说明。下述实施例是说明性的，不是限定性的，不以下述实施例来限定本发明的保护范围。

实施例1

无籽刺梨中总黄酮的制备：

(1)将无籽刺梨果实洗净自然晾干后置于50℃烘箱烘干至恒重，粉碎过40目筛后备用；

(2)精确称取步骤(1)制备得到的无籽刺梨粉末15g，采用超声辅助提取工艺进行提取，提取时间60min、料液比1:25、乙醇体积分数50％、提取次数4次，在此条件下提取无籽刺梨总黄酮，收集提取液，合并，于50℃减压浓缩至无醇味，得到浓缩液；

(3)取步骤(2)制备得到的浓缩液，用大孔树脂色谱柱Diaion HP20(35×550mm)吸附，以蒸馏水洗脱去杂后，用80％乙醇溶液洗脱，收集乙醇洗脱液，经减压浓缩干燥，得到无籽刺梨总黄酮提取物。纯化后的总黄酮含量为116.21±0.05mg/g。

实施例2

无籽刺梨总黄酮体外化学评价法测评其抗氧化活性：

取实施例1制备得到的无籽刺梨总黄酮提取物分别用70％乙醇溶解配制成不同浓度的溶液，并各取2mL不同质量浓度的溶液于棕色小瓶中，分别加入0.2mmol/L的DPPH乙醇溶液2mL，在避光条件下混均，反应20min后，在波长517nm处测定吸光度。以70％乙醇调零，用70％乙醇2mL加入0.2mmol/L的DPPH乙醇溶液2mL作为空白对照。以Vc作为阳性对照，DPPH自由基清除能力强弱以SC₅₀来表示，测定时每个样品进行3次平行重复实验。

取实施例1制备得到的无籽刺梨总黄酮提取物分别用70％乙醇溶解配制成不同浓度的溶液，取0.1mL不同质量浓度的溶液于棕色小瓶中，分别加入ABTS工作液(精确称取38.5mg的ABTS，6.6mg的过硫酸钾用70％乙醇溶解定容于10mL的棕色容量瓶，避光反应12～16h之后，用70％乙醇不断稀释调和，使其吸光度值在734nm处的值为0.70±0.02，即得ABTS工作液。)3.9mL，在避光条件下混均，反应6min后，在波长734nm处测定吸光度。以70％乙醇调零，用70％乙醇0.1mL加入ABTS工作液3.9mL作为空白对照。以Vc作为对照，ABTS自由基清除能力强弱以SC₅₀来表示，测定时每个样品进行3次平行重复实验。

实验结果显示，无籽刺梨总黄酮提取物对DPPH自由基的半清除浓度(SC₅₀＝6.75±0.54μg/mL)和ABTS自由基半清除浓度(11.43±0.17μg/mL)明显低于Vc对DPPH半清除浓度(SC₅₀＝15.96±0.28μg/mL)和ABTS自由基半清除浓度(SC₅₀＝81.61±0.63μg/mL)，表明无子刺梨总黄酮提取物对DPPH自由基和ABTS自由基清除能力较强，具有较强的抗氧化活性。

实施例3

实验动物模型评价无籽刺梨总黄酮的降血糖和降血脂活性：

随机选取野生型AB系斑马鱼于六孔板中，每孔30尾，用四氧嘧啶与葡萄糖联合处理建立斑马鱼高血糖模型，分别给予实施例1制备得到的无籽刺梨总黄酮提取物配制成的水溶液(RS)3μg/mL、10μg/mL和30μg/mL浓度，阳性对照药阿卡波糖50μg/mL浓度，每孔3mL溶液，同时设置模型对照组、溶剂对照组(四氧嘧啶与葡萄糖联合+DMSO)和正常对照组(不作任何处理)。给药24小时后，移除诱导剂及药物，药物处理组补充药物处理，2小时后收集斑马鱼，使用血糖仪进行葡萄糖含量测定，并计算RS降糖率。结果显示：模型对照组斑马鱼葡萄糖值是正常对照组的3.4倍，两者比较p<0.001，说明斑马鱼高血糖模型建立成功；50μg/mL阿卡波糖降糖率为45％，与模型对照组相比p<0.001，说明阿卡波糖有明显的降糖作用。RS 3μg/mL组降糖率为18％，与模型对照组比较p<0.05，说明无籽刺梨总黄酮提取物配制成的水溶液在3μg/mL时有降糖作用。

随机选取黑色素等位基因突变型Albino系斑马鱼于六孔板中，每孔30尾，用蛋黄粉喂食斑马鱼建立高血脂模型，分别给予实施例1制备得到的无籽刺梨总黄酮提取物配制成的水溶液(RS)3μg/mL、10μg/mL和30μg/mL浓度，阳性对照药洛伐他汀0.081μg/mL浓度，每孔3mL溶液，同时设置模型对照组。给药2天后，用油红O进行染色，染色后每个实验组随机选取10尾斑马鱼在解剖显微镜下拍照并采集数据，分析统计斑马鱼尾部血管血脂光密度总和，计算血脂降低率，定量评价RS降血脂作用。结果显示：阳性对照药洛伐他汀斑马鱼尾部血管血脂光密度总和(1588)与模型对照组(1981)比较p<0.05，其对斑马鱼血脂降低率为26％，说明0.081μg/mL洛伐他汀有降血脂作用。RS 3μg/mL、10μg/mL和30μg/mL组斑马鱼尾部血管血脂光密度总和分别为1959、1395和1159，血脂降低率分别为8％、35％和46％，与模型对照组比较3μg/mL组p>0.05，10μg/mL和30μg/mL组p<0.001，说明无籽刺梨总黄酮提取物配制成的水溶液在本实验浓度条件下对蛋黄粉诱发的斑马鱼高血脂具有显著的降血脂作用，且呈现剂量相关性。