本发明涉及从中药植物中提取总黄酮的技术领域，具体涉及一种玫瑰花总黄酮提取纯化工艺。
背景技术：
玫瑰花为蔷薇科植物玫瑰（RosarugosaThunb）的干燥花蕾，其性味甘温，归肝、脾经，具有行气解郁，和血止痛之功效。玫瑰花含有挥发油、氨基酸、多糖类及多种黄酮类化合物， 其中的黄酮类成分具有抗癌、免疫调节、降血糖、抗氧化等多种药理活性。但是目前，从玫瑰花中提供总黄酮的工艺路线不成熟，主要表现为提取的有效成分总量不高（即纯度低）、工艺路线不够合理或工业化条件不具备等。如公开号为CN102796066A，名称为一种黄酮类化合物及其制备方法与应用，以玫瑰花为原料，经浸膏提取、硅胶柱层析、石油醚～乙酸乙酯柱层析、高压液相色谱分离步骤，具体为：取玫瑰花，粉碎，用90～99%乙醇超声提取合并提取液、过滤，减压浓缩成浸膏；浸膏用硅胶干法装柱进行硅胶柱层析；以体积配比为20:1～1:1的氯仿～甲醇溶液进行梯度洗脱，合并相同的部分；9:1部分用体积配比为9:1～0:1的石油醚～乙酸乙酯溶液进行梯度洗脱，收集各部分洗脱液并浓缩；7:3部分进一步用高压液相色谱分离纯化即得所述的黄酮类化合物。该方法存在下述问题黄酮类化合物大多具有酚羟基，易溶于碱性水或稀醇（50%～70%）中，该方法采用90～99%乙醇提取，黄酮类物质在其中溶解度较低， 且硅胶会对部分黄酮形成死吸附，造成产品损失，使得黄酮得率较低。
又如公开号为CN104083476A，名称为一种玫瑰花提取物在制备抗抑郁药物中的应用及公开号为CN103417679A，名称为一种玫瑰花中提取抗脑缺血物质的方法及其应用，是将玫瑰花干燥粉碎成粗粉，用石油醚回流萃取脱脂，弃去石油醚液，脱脂后的玫瑰花药渣挥干石油醚，用乙醇浸泡回流提取，滤液减压回收乙醇至无醇味，浓缩，浓缩液加蒸馏水分散；分散液上AB～8型大孔吸附树脂，用蒸馏水洗脱，弃去水液；继用乙醇洗脱，弃去洗脱液；再用乙醇洗脱，收集洗脱液，减压回收乙醇，干燥粉碎，即得，其总黄酮质量含量为63%以上。如公开号为CN103006899A，名称为一种枸杞子总黄酮的提取纯化工艺、检测方法及其应用，提取工艺是枸杞子烘干粉碎、加乙醇，提取合并滤液、浓缩、萃取、得到枸杞子黄酮粗提液；提取纯化工艺：采用大孔树脂D101，对粗提液进行纯化，采用聚酰胺对黄酮进一步的纯化等，其黄酮纯度只有42.8% 。
技术实现要素：
本发明旨在解决现有技术中玫瑰总黄酮提取纯化工艺存在的纯度和得率低的问题，提供一种方法合理、稳定、生产周期短，适合工业化生产且得到的总黄酮纯度高的玫瑰花总黄酮的提取纯化工艺。
为解决上述技术问题，本发明通过以下技术方案实现：
玫瑰花总黄酮提取纯化工艺，包括下述步骤：
A、取玫瑰花干燥药材，粉碎后，加入乙醇回流提取，提取液过滤，备用；
B、将步骤A得到的提取液除去乙醇，得到一次浓缩液，一次浓缩液加入到AB ～8型大孔树脂中，依次经水、5～10%乙醇洗至水澄清，乙醇颜色较浅，最后用80～85%乙醇洗脱，洗脱液除去乙醇，得二次浓缩液；
C、将步骤B中得到的二次浓缩液倒入装好的聚酰胺柱中，依次用水、5～10%乙醇洗至水澄清，乙醇颜色较浅，最后用70～75%乙醇洗脱，洗脱液浓缩至干，得玫瑰花总黄酮粗品；
D、将步骤C中得到的玫瑰花总黄酮粗品用甲醇溶解，用聚酰胺拌样、干燥得样品，然后将样品干法上样到柱层析聚酰胺为填料，二氯甲烷和甲醇为溶剂湿法装柱的柱子上，采用二氯甲烷：甲醇为 10：1～1：1的比例进行梯度洗脱，根据TLC点板收集含总黄酮的洗脱液，洗脱液浓缩至干得纯化玫瑰花总黄酮；
E、将步骤D得到的纯化玫瑰花总黄酮用甲醇溶解后过滤，滤液到入C18柱中，以20%～70%的甲醇溶液为溶剂，在254nm波长下梯度洗脱，收集含黄酮部分洗脱液，回收甲醇并浓缩，将浓缩液用C18柱富集，然后用甲醇解析，收集甲醇解析液，解析液除去甲醇并浓缩至干得玫瑰花总黄酮。
进一步的，所述工艺还包括将步骤E得到的玫瑰花总黄酮再次按照步骤D操作进行处理，即步骤E得到的玫瑰花总黄酮用甲醇溶解，用聚酰胺拌样、干燥得样品，然后将样品干法上样到柱层析聚酰胺为填料，二氯甲烷和甲醇为溶剂湿法装柱的柱子上，采用二氯甲烷：甲醇为 10：1～1：1的比例进行梯度洗脱，根据TLC点板收集含总黄酮的洗脱液，洗脱液浓缩至干。
优选的，在步骤A中，所述乙醇的加入量为玫瑰花药材重量的5～15倍，所述乙醇的体积浓度为70～75%，回流提取2～3次，每次1.5～2小时。
在步骤D中，所述柱层析聚酰胺用量为玫瑰花总黄酮粗品总重80～120倍。
在步骤D中，所述湿法装柱时用二氯甲烷和甲醇的体积比为10:1。
在步骤D中，采用二氯甲烷：甲醇为10：1～1：1比例进行梯度洗脱的过程为 10：1流动相洗脱15L，8：1流动相洗脱10L，6：1流动相洗脱10L，3：1流动相洗脱10L，1：1流动相洗脱15L，TLC点板收集黄酮反应的洗脱液部分。
在步骤E中， 20%～70%的甲醇溶液梯度洗脱的过程为使用二元泵梯度制备，每2min分段收集，通过TLC点板检测，收集黄酮反应的洗脱液。
在步骤E中，所述解析用甲醇浓度为90%。
提取纯化得到的玫瑰花总黄酮可按照下述步骤检测：
A仪器与试剂
仪器：紫外～可见分光光度仪
试剂：芦丁对照品，甲醇，亚硝酸钠，硝酸铝，氢氧化钠；
B溶液制备
A、对照品贮备液制备：精密称取芦丁对照品50mg，置于25ml容量瓶中，加甲醇适量，置水浴上微热溶解，放冷，加甲醇至刻度，摇匀。精密量取10ml，置100ml容量瓶中，加水至刻度，摇匀，即得（每1ml中含芦丁0.2mg）；
B、标准曲线的绘制：精密量取对照品溶液1ml、2ml、3ml、4ml、5ml、6ml，分别置于25ml容量瓶中，各加水至6.0ml，加5%亚硝酸钠溶液1ml，混匀，放置6分钟，加氢氧化钠试液10ml，再加水至刻度，摇匀，放置15分钟，以相应试剂为空白，使用紫外～可见分光光度仪，在500nm波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线，得回归方程：A=8.1046C+0.0113,相关系数γ=0.9985。
C、供试品溶液制备：精密称取样品40mg，置10ml量瓶中，加入甲醇适量，在水浴上微热溶解，放冷，加甲醇至刻度，后置于1000ml量瓶中，加水至刻度线，摇匀，即得；
D、空白溶液制备：以相应溶液作为空白；
C、样品测定
精密吸取供试品溶液3ml，置于25ml容量瓶中，照标准曲线制备项下的方法，加水至6.0ml，加5%亚硝酸钠溶液1ml，混匀，放置6分钟，加氢氧化钠试液10ml，再加水至刻度，摇匀，放置15分钟，以相应试剂为空白，使用紫外～可见分光光度仪，在500nm波长处测定吸光度，总黄酮含量以芦丁计算；
D结果计算
从回归方程计算供试品溶液中总黄酮的含量。采用该方法检测本发明方法提取纯化的玫瑰花总黄酮，总黄酮含量以芦丁计算大于等于90%。
本发明具有以下有益效果：
本发明将玫瑰花干燥药材的提取液依次经过AB-8大孔树脂、聚酰胺柱、柱层析聚酰胺、C18柱这一特定的分离纯化步骤，从而制备出含量达90%以上的玫瑰花总黄酮，为药材资源的充分利用及提高其应用价值提供科学的依据。
2、本发明设计合理，工艺合理、稳定、可行，采用本发明方法提取，纯化玫瑰花中总黄酮、分离速度快，生产周期短，适合工业化生产，有很好的应用前景。
2、本发明将提取液浓缩后加入到AB-8大孔树脂总，并依次用水和低浓度乙醇洗，除去了水溶性色素及杂质如糖类，除去去大极性的色素及杂质，且都不会将目标物洗脱下来；方便后续聚酰胺和C18分离，降低对填料的污染； AB-8型大孔树脂，是一种吸附范围较广的填料，能吸附大部分的色素及杂质。
3、本发明将经过AB-8型大孔树脂后进一步用聚酰胺柱子处理，聚酰胺填料对黄酮类物质有较专一的分离效果，为了提高分离纯化效率，采用高浓度乙醇洗脱前先用水和低浓度乙醇洗，先除色素和杂质，只需经过依次洗脱，就能使高比例洗脱下的黄酮类物质部分更纯，更方便下一步正相洗脱，同时避免杂质、多糖等物质对后续分离柱污染和堵塞。
4、本发明将样品采用聚酰胺拌样可以使总黄酮粗品均匀的分散被吸附在聚酰胺上，加入流动相洗脱时，样品溶解均匀，使得梯度洗脱时杂质与产品分布更均匀、集中，达到有效分离；拌样后干燥使样品中的甲醇完全挥发，让聚酰胺拌样中不含甲醇，避免在梯度洗脱初期低极性有机溶剂洗脱时改变流动相极性，而造成杂质与产品分离不好。
5、本发明将经过AB-8大孔树脂、聚酰胺柱、柱层析聚酰胺处理的玫瑰提取物进一步用C18柱处理，能定向得到大部分黄酮类物质使黄酮含量有较大提高，且分离时间较短，而且能明确其中的一种或几种黄酮物质，有利于其进一步开发。
6、本发明将经过AB-8大孔树脂、聚酰胺柱、柱层析聚酰胺、C18柱处理后的玫瑰提取物重新经过柱层析聚酰胺处理，不但能进一步提高总黄酮的纯度，将黄酮含量提高到90%以上；且能提高总黄酮的收率，操作更加简便快速。
具体实施方式
实施例1
玫瑰花总黄酮提取纯化工艺，包括下述步骤：
A、取玫瑰花干燥药材，粉碎后，加入玫瑰花干燥药材重量5倍的70%乙醇回流提取3次，每次2小时，提取液过滤，合并滤液；
B、将步骤A得到的提取液除去乙醇，得到一次浓缩液，一次浓缩液加入到AB ～8型大孔树脂中，依次经水、10%乙醇洗至水澄清，乙醇颜色较浅，最后用80%乙醇洗脱，洗脱液除去乙醇，得二次浓缩液；
C、将步骤B中得到的二次浓缩液倒入装好的聚酰胺柱中，依次用水、10%乙醇洗至水澄清，乙醇颜色较浅，最后用70%乙醇洗脱，洗脱液浓缩至干，得玫瑰花总黄酮粗品；
D、将步骤C中得到的玫瑰花总黄酮粗品用甲醇溶解，甲醇的加入量以玫瑰花总黄酮粗品全部溶解为好，溶解后用聚酰胺拌样、干燥得样品，然后将样品干法上样到柱层析聚酰胺为填料，二氯甲烷和甲醇为溶剂湿法装柱的柱子上，采用二氯甲烷：甲醇为10：1～1：1的比例进行梯度洗脱，根据TLC点板收集含总黄酮的洗脱液，洗脱液浓缩至干得纯化玫瑰花总黄酮；
E、将步骤D得到的纯化玫瑰花总黄酮用甲醇溶解后过滤，滤液到入C18柱中，以20%～70%的甲醇溶液为溶剂，在254nm波长下梯度洗脱，收集含黄酮部分洗脱液，回收甲醇并浓缩，将浓缩液用C18柱富集，然后用甲醇解析，收集甲醇解析液，解析液除去甲醇并浓缩至干得玫瑰花总黄酮。
测定并计算计算，本实施例玫瑰花总黄酮提取物中总黄酮含量以芦丁计算总黄酮含量为90.10%。
实施例2
本实施例与实施例1的区别在于：本实施例还包括将步骤E得到的玫瑰花总黄酮再一次按照步骤D过程进行处理，即用甲醇溶解，用聚酰胺拌样、干燥得样品，然后将样品干法上样到柱层析聚酰胺为填料，二氯甲烷和甲醇为溶剂湿法装柱的柱子上，采用二氯甲烷：甲醇为10：1～1：1的比例进行梯度洗脱，根据TLC点板收集含总黄酮的洗脱液，洗脱液浓缩至干。其中，该步骤中，所述柱层析聚酰胺用量为玫瑰花总黄酮粗品总重120倍。所述湿法装柱时用二氯甲烷和甲醇的体积比为10:1。
测定并计算计算，本实施例玫瑰花总黄酮提取物中总黄酮含量以芦丁计算总黄酮含量为91.16%
实施例3
玫瑰花总黄酮提取纯化工艺，包括下述步骤：
A、取玫瑰花干燥药材，粉碎后，加入玫瑰花干燥药材重量10倍的75%乙醇回流提取3次，每次2小时，提取液过滤，合并滤液；
B、将步骤A得到的提取液除去乙醇，得到一次浓缩液，一次浓缩液加入到AB ～8型大孔树脂中，依次经水、5%乙醇洗至水澄清，乙醇颜色较浅，最后用85%乙醇洗脱，洗脱液除去乙醇，得二次浓缩液；
C、将步骤B中得到的二次浓缩液倒入装好的聚酰胺柱中，依次用水、5%乙醇洗至水澄清，乙醇颜色较浅，最后用75%乙醇洗脱，洗脱液浓缩至干，得玫瑰花总黄酮粗品；
D、将步骤C中得到的玫瑰花总黄酮粗品用甲醇溶解，用聚酰胺拌样、干燥得样品，然后将样品干法上样到柱层析聚酰胺为填料，二氯甲烷和甲醇为溶剂湿法装柱的柱子上，采用二氯甲烷：甲醇为10：1～1：1的比例进行梯度洗脱，根据TLC点板收集含总黄酮的洗脱液，洗脱液浓缩至干得纯化玫瑰花总黄酮；
E、将步骤D得到的纯化玫瑰花总黄酮用甲醇溶解后过滤，滤液到入C18柱中，以20%～70%的甲醇溶液为溶剂，在254nm波长下梯度洗脱，收集含黄酮部分洗脱液，回收甲醇并浓缩，将浓缩液用C18柱富集，然后用甲醇解析，收集甲醇解析液，解析液除去甲醇并浓缩至干得玫瑰花总黄酮。
F、将步骤E得到的玫瑰花总黄酮用甲醇溶解，用聚酰胺拌样、干燥得样品，然后将样品干法上样到柱层析聚酰胺为填料，二氯甲烷和甲醇为溶剂湿法装柱的柱子上，采用二氯甲烷：甲醇梯度洗脱，根据TLC点板收集含总黄酮的洗脱液，洗脱液浓缩至干得玫瑰花总黄酮成品。
上述步骤D和F中，所述柱层析聚酰胺用量为玫瑰花总黄酮粗品总重80倍。所述湿法装柱时用二氯甲烷和甲醇的体积比为10:1。
在步骤E中，所述解析用甲醇浓度为90%。
测定并计算计算，本实施例玫瑰花总黄酮提取物中总黄酮含量以芦丁计算总黄酮含量为93.15%。
实施例4
玫瑰花总黄酮的提取纯化工艺，包括下述步骤：A、取玫瑰花干燥药材，粉碎后，加入玫瑰花干燥药材重量15倍的70%乙醇回流提取3次，每次2小时，提取液过滤，合并滤液；
B、将步骤A得到的提取液除去乙醇，得到一次浓缩液，一次浓缩液加入到AB ～8型大孔树脂中，依次经水、8%乙醇洗至水澄清，乙醇颜色较浅，最后用80%乙醇洗脱，洗脱液除去乙醇，得二次浓缩液；
C、将步骤B中得到的二次浓缩液倒入装好的聚酰胺柱中，依次用水、8%乙醇洗至水澄清，乙醇颜色较浅，最后用72%乙醇洗脱，洗脱液浓缩至干，得玫瑰花总黄酮粗品；
D、将步骤C中得到的玫瑰花总黄酮粗品用甲醇溶解，用聚酰胺拌样、干燥得样品，然后将样品干法上样到柱层析聚酰胺为填料，二氯甲烷和甲醇为溶剂湿法装柱的柱子上，采用二氯甲烷：甲醇为10：1～1：1的比例进行梯度洗脱，根据TLC点板收集含总黄酮的洗脱液，洗脱液浓缩至干得纯化玫瑰花总黄酮；
E、将步骤D得到的纯化玫瑰花总黄酮用甲醇溶解后过滤，滤液到入C18柱中，以20%～70%的甲醇溶液为溶剂，在254nm波长下梯度洗脱，收集含黄酮部分洗脱液，回收甲醇并浓缩，将浓缩液用C18柱富集，然后用甲醇解析，收集甲醇解析液，解析液除去甲醇并浓缩至干得玫瑰花总黄酮。
F、将步骤E得到的玫瑰花总黄酮用甲醇溶解，用聚酰胺拌样、干燥得样品，然后将样品干法上样到柱层析聚酰胺为填料，二氯甲烷和甲醇为溶剂湿法装柱的柱子上，采用二氯甲烷：甲醇梯度洗脱，根据TLC点板收集含总黄酮的洗脱液，洗脱液浓缩至干得玫瑰花总黄酮成品。
上述步骤D和F中，所述柱层析聚酰胺用量为玫瑰花总黄酮粗品总重100倍。所述湿法装柱时用二氯甲烷和甲醇的体积比为10:1。
在步骤E中，所述解析用甲醇浓度为90%。
测定并计算计算，本实施例玫瑰花总黄酮提取物中总黄酮含量以芦丁计算总黄酮含量为91.50%。
上述实施例1-4中，在步骤D中，采用二氯甲烷：甲醇为10：1～1：1比例进行梯度洗脱的过程为10：1流动相洗脱15L，8：1流动相洗脱10L，6：1流动相洗脱10L，3：1流动相洗脱10L，1：1流动相洗脱15L，TLC点板收集黄酮反应的洗脱液部分。在步骤E中， 20%～70%的甲醇溶液梯度洗脱的过程为使用二元泵梯度制备，每2min分段收集，通过TLC点板检测，收集黄酮反应的洗脱液。