一种丝素蛋白/石墨烯复合纳米纤维支架材料的制备方法与流程

本发明属于静电纺丝复合纳米纤维的制备领域，具体涉及一种丝素蛋白/石墨烯复合纳米纤维支架材料的制备方法。

背景技术：

丝素蛋白是由蚕茧脱胶而来，是一种天然的蛋白质，具有良好的生物相容性、生物可降解性、良好的透气、无免疫原性等优异的性能，被广泛的应用于皮肤、骨、软骨、肌腱、神经导管等组织的修复和再生。

采用静电纺丝技术制备出的支架材料能够有效的仿生人体细胞外基质(ecm)的结构与功能特点，能够有效的解决材料的生物相容性，调控生物信号的传导，诱导细胞和组织生长，促进机体再生与修复。

石墨烯是一种具有单层碳原子紧密堆积而成的二维蜂窝晶格结构的碳材料，具有高模量、高强度高、良好的导电性等优点，而且石墨烯具有较大的比表面积以及良好的生物相容性，使之可以应用于生物医用领域，且有研究表明石墨烯能够促进各种神经种子细胞的生长、增殖。许多研究将石墨烯或是氧化石墨烯对丝素蛋白进行改性，如专利申请号cn201610806923.5：基于氧化石墨烯复合纳米纤维组织工程支架的制备方法，氧化石墨烯的加入虽然能够使复合膜力学性能得到了良好的改善，但是此复合支架材料导电性较低，神经元之间电化学信号较弱，不能够良好的促进细胞的增殖；专利申请号cn201510106514.x:一种丝素/石墨烯导电纤维的制备方法，采用部分还原的氧化石墨烯对丝素蛋白进行改性，虽然能够有效的解决了石墨烯易团聚问题，有效的改善了丝素蛋白的性能，但是与石墨烯的性能相比还存在一定的差距，主要是用量小而且分散性较差。

技术实现要素：

本发明提供了一种丝素蛋白/石墨烯复合纳米纤维支架材料的制备方法，该制备方法简单易行，原材料资源丰富，易实现工业化生产；制得的丝素蛋白/石墨烯复合纳米纤维支架材料具有良好的生物相容性、良好的机械性能，并且通过加入不同含量的石墨烯，得到了不同性能的复合纳米纤维，满足不同的组织工程支架的需要。

本发明的技术方案如下：

一种丝素蛋白/石墨烯复合纳米纤维支架材料的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：

1)制备丝素蛋白样品；

2)将石墨烯乙醇分散液进行高速离心，获得石墨烯；

3)将步骤1)得到的丝素蛋白加入到六氟异丙醇中，搅拌使之完全溶解，得到溶液a；

4)将步骤2)得到的石墨烯用六氟异丙醇转移到溶液a中，超声分散得到溶液b，其中，溶液b中丝素蛋白的浓度为0.04～0.08g/ml，石墨烯与丝素蛋白的质量比1:400～1:100；

5)将溶液b转移至注射器中，通过调控静电纺丝工艺参数进行静电纺丝，控制电压8～16kv，接收距离为10～15cm，纺丝速率为0.05～0.2mm/min，接收辊辊速100r/min，纺丝针头为21号；

6)将制得的静电纺丝薄膜放置于无水乙醇中后处理4h，自然干燥，干燥后储存在干燥器中，获得丝素蛋白/石墨烯复合纳米纤维支架材料。

上述方案中，步骤1)中制备丝素蛋白样品的具体步骤为：

1)将蚕丝放入质量浓度为0.5％的na2co3的水溶液中煮沸并恒温2h，除去蚕丝表面的丝胶，取出蚕丝并用去离子水洗涤，置于50℃烘箱中干燥；

2)将干燥后的蚕丝加入到摩尔比为1:8:2的氯化钙、无水乙醇和水的70℃三元混合溶液，溶解成丝素蛋白溶液，经过去离子水透析72h除去溶液中的乙醇和氯化钙，制得丝素蛋白水溶液，再经过-80℃冷冻干燥制得纯的丝素蛋白样品。

上述方案中，步骤1)中所述的蚕丝是桑蚕丝、天蚕丝或蓖麻蚕丝中的一种或是两种以上任意比例的混合；其用量为nɑ2co3水溶液总质量的2～15％。

上述方案中，步骤2)中所述的蚕丝质量为三元混合溶液质量的5～10％。

上述方案中，步骤2)中石墨烯乙醇分散液浓度为1mg/ml。

上述方案中，步骤3)中溶液a中丝素蛋白的浓度为0.08g/ml。

上述方案中，步骤4)中超声分散温度为20～35℃，超声时间为2～4h。

上述方案中，步骤5)中21号纺丝针头口径为0.5mm。

上述方案中，所述丝素蛋白/石墨烯复合纳米纤维支架材料的纤维平均直径为80-300nm。

本发明的有益效果是：本发明基于静电纺丝法，制备出微纳米数量级的复合纤维，使这种丝素蛋白具有良好的生物相容性，同时又具备石墨烯优良的生物活性、力学机械性能，可以应用于皮肤、软骨、神经导管等组织再生、修复领域。

附图说明

图1为实施例1得到产物的扫描电镜图。

图2为实施例2得到产物的扫描电镜图。

图3为实施例3得到产物的扫描电镜图。

图4为丝素蛋白/石墨烯复合纳米纤维支架材料的拉曼光谱图。其中a、b、c分别代表实施例1、2、3产物的拉曼光谱图，说明石墨烯成功的复合在丝素蛋白纤维中。

图5为雪旺细胞在丝素蛋白/石墨烯复合纳米纤维支架材料增殖情况。其中a、b、c分别代表实施例1、2、3产物的在培养时间分别为1、3、5天的od值，说明石墨烯含量的增加能够有效的促进雪旺细胞在丝素蛋白/石墨烯复合纳米纤维支架材料的增殖。

图6、图7、图8分别为雪旺细胞在实施例1、2、3得到产物上的粘附扫描电镜图。说明石墨烯含量的增加能够有效的促进雪旺细胞在丝素蛋白/石墨烯复合纳米纤维支架材料的增殖。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐明本发明，但本发明的内容不仅仅局限于下面的实施例。

实施例1

本实施例提供一种丝素蛋白/石墨烯复合纳米纤维支架材料的制备方法，所述方法包括如下步骤：

先将30g蚕茧加入到1l0.5％nɑ2co3水溶液中，煮沸40min并恒温2h，重复处理三次，用去离子水充分洗净，洗净后置于50℃干燥箱中恒温烘干，得到脱胶后的蚕丝。将干燥后的蚕丝加入到摩尔比为1:8:2的氯化钙、无水乙醇和水的70℃三元混合溶液，溶解成丝素蛋白溶液，经过去离子水透析72h除去溶液中的乙醇和氯化钙，制得丝素蛋白水溶液，再经过-80℃冷冻干燥制得纯的丝素蛋白样品。

将0.32g丝素蛋白溶于4ml六氟异丙醇中，搅拌至完全溶解，得到0.08g/ml的丝素蛋白液a，用移液枪取800μl石墨烯乙醇分散液高速离心，吸出乙醇，用六氟异丙醇将离心管内的石墨烯转移到丝素蛋白液中，并加入一定量的六氟异丙醇使丝素蛋白液体积至6ml，超声60min，最终得到石墨烯与丝素蛋白质量比为1:400的溶液b，溶液b中丝素蛋白的浓度为0.06g/ml。

将所述的纺丝液注入10ml注射器中进行静电纺丝，工艺条件为：纺丝电压16kv，推速0.05mm/min，接收距离12cm，辊速100r/min。将所得的静电纺丝膜用无水乙醇处理4h，随后置于50℃的真空干燥箱中干燥24h，获得丝素蛋白/石墨烯复合纳米纤维支架材料。

通过本发明的上述方法制备的丝素蛋白/石墨烯复合纳米纤维支架材料，纤维平均直径为280nm。

实施例2

称取按照实施例1中制备的丝素蛋白0.32g溶于4ml六氟异丙醇中，搅拌至完全溶解，得到0.08g/ml的丝素蛋白液a，用移液枪取1.6ml石墨烯乙醇分散液高速离心，吸出乙醇，用六氟异丙醇将离心管内的石墨烯转移到丝素蛋白液中，并加入一定量的六氟异丙醇使丝素蛋白液至6ml，超声60min，最终得到石墨烯与丝素蛋白质量比为1:200的0.06g/ml丝素蛋白纺丝液b，将所述的纺丝液注入10ml注射器中进行静电纺丝，工艺条件为：纺丝电压16kv，推速0.05mm/min，接收距离12cm，辊速100r/min。将所得的静电纺丝膜用无水乙醇处理4h，随后置于50℃的真空干燥箱中干燥24h，获得丝素蛋白/石墨烯复合纳米纤维支架材料。

通过本发明的上述方法制备的丝素蛋白/石墨烯复合纳米纤维支架材料，纤维平均直径为110nm。

实施例3

称取按照实施例1中制备的丝素蛋白0.32g溶于4ml六氟异丙醇中，搅拌至完全溶解，得到0.08g/ml的丝素蛋白液a，用移液枪取3.2ml石墨烯乙醇分散液高速离心，吸出乙醇，用六氟异丙醇将离心管内的石墨烯转移到丝素蛋白液中，并加入一定量的六氟异丙醇使丝素蛋白液至6ml，超声60min，最终得到石墨烯与丝素蛋白质量比为1:100的0.06g/ml丝素蛋白纺丝液b，将所述的纺丝液注入10ml注射器中进行静电纺丝，工艺条件为：纺丝电压16kv，推速0.05mm/min，接收距离12cm，辊速100r/min。将所得的静电纺丝膜用无水乙醇处理4h，随后置于50℃的真空干燥箱中干燥24h，获得丝素蛋白/石墨烯复合纳米纤维支架材料。

通过本发明的上述方法制备的丝素蛋白/石墨烯复合纳米纤维支架材料，纤维平均直径为90nm。

表1为丝素蛋白/石墨烯复合纳米纤维支架材料的机械力学性能数据。其中a、b、c分别代表实施例1、2、3产物样品，说明石墨烯含量的增加能够有效的改善丝素蛋白的机械力学性能。

对比例1

本对比例和实施例1大致相同，不同的是改变了石墨烯的含量，使石墨烯与丝素蛋白质量比分别1:600并进行力学性能和导电性的对比，结果如表1所示。

对比例2

本对比例和实施例1大致相同，不同的是改变了石墨烯的含量，使石墨烯与丝素蛋白质量比分别1:50并进行力学性能和导电性的对比，结果如表1所示。

表1

由上表力学性能以及导电性数据可知，当石墨烯与丝素蛋白质量比在1：400～1:100范围内，随着石墨烯含量的增加丝素蛋白/石墨烯复合纤维支架材料的力学性能以及导电性能逐渐增强。对比例1制备出的复合纤维支架材料的力学性能以及导电性能与实施例相比均较小，难以满足组织工程支架的要求；对比例2虽然制备出了导电性良好的复合纤维支架材料，但是其机械力学性能与实施例3相比有所降低，甚至其力学性能比实施例2较差，说明当石墨烯含量过高时，复合纤维支架材料的力学性能亦难满足组织工程支架的要求。

对比例3

与申请号cn201610806923.5：基于氧化石墨烯复合纳米纤维组织工程支架的制备方法相在机械力学性能上进行比较，对比专利采用静电纺丝技术制备氧化石墨烯/丝素蛋白复合支架材料，与本专利较为类似。当氧化石墨烯浓度由0.5mg/ml增大1mg/ml时，其复合纤维膜断裂强度增加10％左右，然而本实例中同样的将石墨烯浓度增大到2倍，即当石墨烯浓度由0.13mg/ml增大到0.26mg/ml时其断裂强度增加了22％；当氧化石墨烯浓度由0.5mg/ml增大到2mg/ml时，其复合纤维膜力学性能有所降低，然而本实例中同样的将石墨烯浓度增大到4倍，即当石墨烯浓度由0.13mg/ml增大到0.52mg/ml时，其断裂强度则增加了35％；说明石墨烯在改善丝素蛋白机械力学性能方面相对于氧化石墨烯更有优势。

对比例4

与cn201510106514.x：一种丝素/石墨烯导电纤维的制备方法在机械力学性能以及导电性能上进行比较，对比专利采用静电纺丝技术制备部分还原氧化石墨烯/丝素蛋白复合支架材料，与本专利较为类似。当部分还原氧化石墨烯与丝素蛋白质量分数比为1:50时，其断裂强度为2.7mpa左右，其导电率大约为7.0ms/cm；本实施例中当石墨烯与丝素蛋白质量比为1:100时，其断裂强度为3.1mpa，其导电率为11.68ms/cm，较少比例含量的石墨烯在力学性能以及导电性能就要强于部分还原氧化石墨烯，说明石墨烯相对与氧化石墨烯更具有较强的力学性能和导电性能。