pcDNA4Myc‑NCAM质粒在制备关节炎药物中的应用及该质粒的制备方法与流程

本发明涉及医药技术，具体涉及pcdna4/myc-ncam质粒在制备关节炎药物中的应用及该质粒的制备方法。

背景技术：

关节炎是一种常见的关节变性疾病，以软骨进行性破坏为主要特点。软骨的分化形成在关节炎的发病与治疗中有着重要的作用。在健康人中，关节软骨细胞正常增殖、正常分化形成软骨；而在关节炎患者中(即炎症环境下)，软骨细胞不断增殖而且软骨细胞过度肥大，软骨肥大标志物(hypertrophicchondrocytemarkers)如runx2和collagenx等异常高表达，并伴随钙沉积的显著增多。疼痛是关节炎最主要的表现。关节疼痛及炎症引起的关节周围组织水肿，导致关节活动受限。慢性关节炎患者由于长期关节活动受限，可能导致永久性关节功能丧失。可出现红斑、畸形、软组织肿胀、关节红肿、渗液、骨性肿胀、骨擦音、压痛、肌萎缩或肌无力、关节活动范围受限及神经根受压等体征。

神经细胞粘附分子(neuralcelladhesionmolecule,ncam；即cd56)属于免疫球蛋白超家族中的一员。ncam在神经细胞中起着非常重要的作用，包括：神经退化、迁移、分化、增殖、细胞粘附、信号传导以及学习和记忆的调节。

我们发现神经细胞粘附分子(neuralcelladhesionmolecule,ncam)能抑制炎症诱导的软骨细胞过度肥大分化。

技术实现要素：

为了解决现有技术的不足，本发明提供了pcdna4/myc-ncam质粒在制备关节炎药物中的应用及该质粒的制备方法。

pcdna4/myc-ncam质粒在制备缓解关节炎症药物中的应用。

pcdna4/myc-ncam质粒在制备治疗关节炎症药物中的应用

pcdna4/myc-ncam质粒的制备方法，其特征在于，从大鼠cdna文库中扩增ncam基因，将扩增出来的片段连接到pcdna4/myc真核表达载体上，转化感受态top10，氨苄霉素抗性lb琼脂板筛选单克隆菌落，摇菌并提取质粒。

附图说明

图1：atdc5细胞中ncam过表达。

图2a：ncam缓解il-1β刺激的软骨细胞肥大标志物runx2mrna的表达。

图2b：ncam缓解il-1β刺激的软骨细胞肥大标志物col10amrna的表达。

图3a：ncam缓解il-1β刺激的软骨细胞肥大标志物蛋白质runx2和colx的表达。

图3b：ncam缓解il-1β刺激的软骨细胞肥大标志物蛋白质colx的表达。

具体实施方式

下面结合附图对本发明做详细说明。

材料与试剂

pcdna4/myc载体购自addgene；atdc5细胞购自日本细胞库rikencellbank；dmem/f12培养基购自hyclone，胎牛血清(fbs)购自gibco，0.25％胰蛋白酶(含edta)、青霉素-链霉素、细胞裂解液、蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂、蛋白上样缓冲液购自上海碧云天生物技术有限公司，bradford购自bio-rad公司；逆转录试剂盒、real-timepcr试剂盒购自南京爱必梦生物材料有限公司；its诱导液、茜素红购自sigma公司；trizol试剂和lipofectamine2000购自invitrogen公司；runx2和β-actin抗体购自于cst公司，colx抗体购自abcam公司，ncam抗体购自上海生工生物工程有限公司。

表达质粒pcdna4/myc-ncam的构建

根据genbank中ncam基因的mrna序列(nm_001081445.1)，并利用dnaman8.0软件设计引物，从大鼠cdna文库中扩增ncam基因，将扩增出来的片段连接到pcdna4/myc真核表达载体上，转化感受态top10，氨苄霉素抗性lb琼脂板筛选单克隆菌落，摇菌并提取质粒，进行质粒酶切验证及电泳分析。将阳性质粒送苏州金唯智生物科技公司测序。

细胞培养与软骨细胞诱导分化

atdc5细胞用含5％fbs、100u/ml青霉素/链霉素的dmem/f12培养基，置于37℃、5％co2饱和湿度的细胞培养箱培养。

取生长状态良好的atdc5细胞接种于12孔板，待细胞贴壁生长24h后，去除原有的培养液，加入预先配制好的含its的软骨诱导分化培养液(fbs5％、10μg/ml人胰岛素、5.5μg/ml人转铁蛋白、5ng/ml亚硒酸钠)，每隔两天换液1次。

westernblot分析

用ripa裂解液裂解细胞，提取总蛋白，并用bradford测定总蛋白的浓度。采用聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds-page)分离，转膜，用5％的脱脂牛奶封闭1h，一抗4℃孵育过夜，tbst漂洗3次后，二抗室温孵育40min，洗膜后用ecl发光液以及全自动曝光仪曝光。用imagej软件对蛋白条带进行扫描，定量分析相应蛋白的表达变化情况。

实时荧光定量pcr分析

采用trizol试剂，按照试剂盒的要求提取细胞总rna。根据反转录试剂盒说明书逆转录合成cdna的第一条链后，以此为模版，进行实时荧光定量pcr(real-timepcr)检测目的基因的表达变化，引物序列如表1所示。pcr的反应程序：95℃预变性30s，95℃变性5s，64℃退火延伸30s，共40个循环。基因的相对表达量用2^-△△ct法计算，采用小鼠gapdh作为内对照。

表1引物序列

免疫荧光

将细胞加入到铺有细胞玻片12孔板中，待细胞爬片后进行相应处理。4％多聚甲醛固定细胞30min，pbs漂洗3次，每次5min。0.1％tritonx-100室温透化10min，pbs漂洗3次，每次5min。用3％bsa室温封闭1h，pbs漂洗3次，每次5min。加入一抗4℃孵育过夜，pbs漂洗3次，每次5min。然后加入fitc标记的二抗，孵育2h，dapi复染5min，pbs漂洗3次，每次5min，90％甘油封片，激光共聚焦观察拍照。

统计学分析

实验数据统计分析采用graphpadprism5统计软件进行统计分析，结果以均数±标准差来表示，并用单因素方差分析进行处理，组间进行t检验，以p<0.05认为差异具有统计学意义。

结果：

ncam缓解炎症诱导的肥大软骨细胞分化

atdc5细胞中过表达ncam

atdc5细胞接种于12孔板，转染pcdna4/myc-ncam的全长质粒，每孔转染1.6ug，作为实验组，并转染相同质量的空载的pcdna4/myc质粒作为对照组。结果显示，与对照组相比，实验组中ncam的表达量具有明显的上调，并且外源性的myc标签也有表达，证明ncam在atdc5细胞中实现了过表达(图1)。

图1：在atdc-5细胞中转染pcdna4/myc–ncam的全长质粒作为实验组，转染pcdna4/myc作为对照组。取生长状态良好的细胞，加入细胞裂解液，提取总蛋白质，用anti-ncam和anti-myc做westernblot检测ncam和myc标签的表达情况，并以β-actin作为内参。

ncam缓解il-1β刺激的软骨细胞肥大标志物mrna的表达

real-timepcr结果显示，在软骨细胞分化的条件下在ncam过表达后，与转染空质粒的对照组相比，加入不同浓度的il-1β后，软骨细胞肥大标志物runx2和colx的表达量具有明显的下调(图2)。

在图2a至图2b中：将atdc5细胞铺至12孔板中，转染pcdna4/myc-ncam过表达质粒(1.6ug/孔)，加入不同浓度的il-1β(0.01ng/ml，0.1ng/ml)后诱导软骨细胞分化，分化1d后，提取rna，逆转录后，real-timepcr检测runx2(图2a)和colx(图2b)的变化情况，并以gapdh作为内对照。其中n＝4，其中，*p<0.05,**p<0.01的结果为ncam过表达质粒与空质粒相比较。

ncam缓解il-1β刺激的软骨细胞肥大标志物蛋白质的表达

westernblot结果显示，与转染空质粒的对照组相比，加入il-1β产生炎症后，在软骨细胞分化的条件下，转染ncam过表达的质粒能明显的抑制软骨细胞肥大标志物runx2和colx蛋白质的表达。另外，和预期的结果相一致，细胞免疫荧光的结果也证明，与转染空质粒的对照组相比，软骨细胞肥大标志物colx蛋白质的表达量在转染ncam过表达质粒后同样明显降低(图3)。

在图3a至图3b中：将atdc5细胞铺至12孔板中，转染pcdna4/myc-ncam过表达质粒(1.6ug/孔)，加入不同浓度的il-1β后诱导软骨细胞分化，分化1d后，(图3a)加入一定体积的细胞裂解液，提取总蛋白质，用anti-runx2和anti-colx做westernblot检测runx2和colx的变化情况，并以β-actin作为内参。(图3b)同样的，将转染空质粒的atdc5细胞和转染pcdna4/myc-ncam-140(1.6ug/孔)的atdc5细胞铺到带有细胞爬片的12孔板中，培养24h后更换为软骨细胞分化培养液，分化1d后，做细胞免疫荧光检测colx的变化情况。

在软骨前体细胞atdc5中，加入促炎细胞因子il-1β诱导炎症环境；转染pcdna4/myc-ncam质粒，将ncam进行过表达，采用real-timepcr，westernblot和免疫荧光等方法检测ncam对软骨细胞肥大的指标runx2和colx的影响。ncam过表达后，real-timepcr结果显示，炎症诱导的软骨细胞肥大标志物runx2和colx的表达量明显下调；westernblot结果显示，ncam能明显抑制炎症诱导的软骨肥大标志物runx2和colx蛋白质的含量；免疫荧光的结果也显示，炎症诱导的软骨肥大标志物runx2和colx，在ncam过表达后明显受到抑制。以上结果说明，ncam能抑制炎症诱导的软骨细胞肥大分化。

以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。