一种酶响应性释放蛋白与基因的氧化石墨烯复合材料及其制备方法与流程

本发明属于纳米复合材料及其制备领域，特别涉及一种酶响应性释放蛋白与基因的氧化石墨烯复合材料及其制备方法。

背景技术：

目前在研究中发现越来越多的纳米粒具有非常好的载药和基因载体的作用。作为一种新型的二维纳米材料，它一方面保持了石墨烯单一原子层的片状结构，另一方面，经过氧化处理后，在石墨烯片层上引入了许多氧功能团，因而具有良好的水溶液稳定性和生物相容性。同时由于氧化石墨烯具有单原子层结构，其表面积很大因此非常适合作为药物载体。

然而，氧化石墨烯虽然具有高效的载药能力，但是在释药性能上缺乏细胞特异性，特别是对于双载药体系来说不能智能性释放特定药物，且释放药物难于控制。纳米材料的表面化学修饰是改善纳米材料的生物相容性以及控制其在生物系统中的行为的关键因素。基质金属蛋白酶家族成员中的mmp-2酶已被证实在多种细胞中高表达，例如直肠肿瘤细胞、乳腺癌细胞、骨髓间充质干细胞等。而sdf-1蛋白已被证实可吸引或靶向到达这些细胞，当mmp-2酶高表达的细胞释放该酶后，切断mmp-2酶切位点的多肽，基因因此释放。基于上述理由，利用mmp-2酶切位点的多肽让纳米粒载体智能性的释放蛋白与基因是一种全新的纳米载药体系的设计。

技术实现要素：

针对上述不足，本发明所要解决的技术问题是设计一个可以双载药智能释放体系，设计了基质金属蛋白酶mmp-2酶的酶切位点的多肽作为氧化石墨烯与基因之间的连接载体，并提供一种酶响应性释放蛋白与基因的氧化石墨烯复合材料及其制备方法。该复合材料外层的sdf-1蛋白释放后可吸引或靶向到达可分泌mmp-2酶的细胞，进而切断mmp-2酶切位点的多肽，最后基因释放。并且该制备方法操作简单，反应条件温和。

本发明解决技术问题所采用的技术方案如下：一种酶响应性释放蛋白与基因的氧化石墨烯复合材料，所述复合材料包括氧化石墨烯以及依次接枝在氧化石墨烯表面含氧基团的mmp-2酶响应性多肽、bfgf质粒dna和sdf-1蛋白，该复合物材料在mmp-2酶的作用下可顺序性释放蛋白与基因，其中氧化石墨烯为14-20重量份，mmp-2酶响应性多肽为7-60重量份,sdf-1蛋白为6.1-30重量份，bfgf质粒dna为40-60重量份。

本发明的另一目的是提供一种酶响应性释放蛋白与基因的氧化石墨烯复合材料的制备方法，包括如下步骤：

(1)在氧化石墨烯溶液中加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(edc)与n-羟基硫代琥珀酰亚胺(nhs)进行超声活化30-60分钟；

(2)在活化后的溶液中加入mmp-2酶响应性多肽,搅拌6-12h，透析袋过滤掉未反应的多肽后，制备成go-x；

(3)将bfgf质粒dna加入步骤(3)所得go-x中，振摇20-60分钟，并在抽滤膜上形成一层go-x-基因层；

(4)在步骤(4)中所得go-x-基因层加入到sdf-1蛋白溶液中，6-12小时后重悬制备成go-x-基因-蛋白复合材料。

进一步的，在步骤(1)中，所述氧化石墨烯溶液的浓度为0.5-1mg/ml。

进一步的，在步骤(1)中，所述的氧化石墨烯的直径为90-120nm。

进一步的，在步骤(2)中，所述edc和氧化石墨烯的质量比为1：2-1：6，nhs和氧化石墨烯的质量比为1：2-1：6。

进一步的，在步骤(2)中，所述透析袋分子量为7000-14000；所制得的go-x的粒径在150-210nm。

进一步的，在步骤(3)中，所述mmp-2酶响应性多肽与氧化石墨烯的质量比为1：2-6：2。

进一步的，在步骤(3)中，所述mmp-2酶响应性多肽为rgd多肽、phsrn多肽、c16y多肽中的一种。

进一步的，在步骤(4)中，所述的bfgf质粒dna与go-x的质量比为1：2-6：2。

进一步的，在步骤(5)中，所述sdf-1蛋白溶液的浓度为0.1-1mg/ml。

进一步的，在步骤(5)中，所述go-x-基因层与sdf-1蛋白的质量比1：0.1-1：0.3。

进一步的，在步骤(5)中，所得go-x-基因-蛋白粒径为360-450nm。

将所述酶响应性释放蛋白与基因的氧化石墨烯复合材料作用于骨髓间充质干细胞与皮肤角质细胞，看该材料释放的sdf-1是否特异性吸引或靶向可分泌mmp-2酶的细胞。

将所述酶响应性释放蛋白与基因的氧化石墨烯复合材料在mmp-2酶作用下验证其特异性断裂性。

通过上述方法制备本发明中的二维纳米氧化石墨烯复合材料，利用mmp-2酶切位点的多肽，响应性智能性顺序释放蛋白与基因。

本发明的有益效果如下：

(1)本发明利用mmp-2酶响应性酶切位点多肽作为氧化石墨烯与基因之间的连接载体，在mmp-2酶作用下响应性释放基因。

(2)本发明的酶响应性释放蛋白与基因的氧化石墨烯复合材料药物装载量高。

(3)本发明所需设备简单，成本低廉，工艺操作方便等。

附图说明

下面结合附图对本发明作进一步地说明；

图1为本发明对实施案例1进行的对骨髓间充质干细胞与皮肤角质细胞的细胞吸引迁移的统计结果图；

图2为本发明实施案例1在sdf-1蛋白的释放对骨髓间充质干细胞以及皮肤角质细胞的促迁移作用研究的结果图；

图3为本发明实施案例1中go-x对dna的压缩能力考察的结果图；

图4为本发明实施案例1在mmp-2酶作用下复合材料mmp-2酶切位点断裂前后材料的扫描电镜图；

图5为本发明实施案例1中载的pgl3质粒dna对骨髓间充质干细胞转染效率考察的结果图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明技术方案做进一步的描述。

实施例1：

1.在尺寸为90nm的氧化石墨烯溶液(0.5mg/ml,1ml)中加入edc0.25mg与nhs0.25mg,进行超声活化30min，随后向该溶液中加入rgd多肽0.25mg，搅拌6h，用分子量为7000-14000的透析袋过滤掉缩合剂edc和nhs，透析后得go-x，得到0.75mg,测其粒径为150nm；

2.将375ugbfgf质粒dna加入所得go-x中，振摇20分钟制备成go-x-基因层，将所得go-x-基因层进行抽滤，在抽滤膜上形成薄薄一层go-x-基因层；

3.将所得go-x-基因层加入sdf-1蛋白溶液(0.1mg/ml,1.125ml)，6小时后重悬制备成go-x-基因-蛋白复合材料,测其粒径为360nm。

4.将go-x-基因-蛋白复合材料进行蛋白释放实验。结果显示(图1)，sdf-1蛋白可在48小时内释放约百分之八十。

5.将go-x-基因-蛋白复合材料作用于骨髓间充质干细胞与皮肤角质细胞，结果显示(图2)，在48小时这段时间内，该复合材料释放的蛋白sdf-1可以显著的吸引骨髓间充质干细胞，促进其迁移。

6.将go-x-基因-蛋白复合材料与pgl3质粒dna复合，通过琼脂糖凝胶电泳考察go-x对基因的压缩能力，图3结果显示，当dna与go-x的质量比为3：1时，go-x就可以对基因进行压缩。

7.通过mmp-2酶溶液(1mg/ml)作用于go-x-基因-蛋白复合材料前后，将其进行扫描电镜观察其降解情况，结果显示(图4)，酶未降解前其粒为300nm左右，降解后，由于mmp-2酶响应性多肽的断裂，基因响应性释放后，该复合材料为氧化石墨烯的粒径90nm。

8.将go-x-基因-蛋白复合材料中载入pgl3质粒dna对骨髓间充质干细胞进行转染，结果如图5所示。该go-x-基因-蛋白复合材料与dna的质量比为1：3时转染效果较高。

实施例2：

1.在尺寸为120nm的氧化石墨烯溶液(1mg/ml,0.6ml)加入edc0.1mg与nhs0.1mg进行超声活化40min，随后向该溶液中加入phsrn多肽1.8mg，透析后制备成go-x,得到2.4mg,测其粒径为210nm；

2.将7.2mgbfgf质粒dna加入所得go-x中，振摇35分钟制备成go-x-基因层，将所得go-x-基因层进行抽滤，在抽滤膜上形成薄薄一层go-x-基因层；

3.将所得go-x-基因层加入sdf-1蛋白溶液(1mg/ml,2.88ml)，6小时后重悬制备成go-x-基因-蛋白复合材料,测其粒径为450nm。

实施例3：

1.在尺寸为100nm氧化石墨烯溶液(0.5mg/ml,1ml)中加入edc0.125mg与nhs0.125mg进行超声活化60min，随后向该溶液中加入c16y多肽0.5mg，透析后制备成go-x,得到1mg,测其粒径为185nm；

2.将1mgbfgf质粒dna加入所得go-x中，振摇60分钟制备成go-x-基因层，将所得go-x-基因层进行抽滤，在抽滤膜上形成薄薄一层go-x-基因层；

3.将所得go-x-基因层加入sdf-1蛋白溶液(1mg/ml,0.4ml)，6小时后重悬制备成go-x-基因-蛋白复合材料,测其粒径为395nm。

实施例4：

1.在尺寸为110nm氧化石墨烯溶液(1mg/ml,0.5ml)中加入edc0.16mg与nhs0.16mg进行超声活化35min，随后向该溶液中加入phsrn多肽1mg，透析后制备成go-x,得到1.5mg,测其粒径为203nm；

2.将1.5mgbfgf质粒dna加入所得go-x中，振摇60分钟制备成go-x-基因层，将所得go-x-基因层进行抽滤，在抽滤膜上形成薄薄一层go-x-基因层；

3.将所得go-x-基因层加入sdf-1蛋白溶液(0.1mg/ml,3ml)，6小时后重悬制备成go-x-基因-蛋白复合材料,测其粒径为425nm。