miR‑6734‑5p在制备Luminal型乳腺癌诊断工具中的应用的制作方法

本发明属于生物医药领域，涉及mir-6734-5p在诊断乳腺癌方面的应用。

背景技术：

外泌体是由细胞膜或多囊泡胞内体与细胞膜融合过程中所产生的分子直径30～100nm的小囊泡，在真核生物的血液、尿液和唾液等多种甚至全部体液中广泛分布。在对外泌体组分的研究中，通过进一步的离心、纯化发现，外泌体由脂质双分子层构成，并含有大量与其细胞来源相关的蛋白质、核酸等组分。蛋白质主要包括以cd9、cd63、cd81和cd82为主的四跨膜蛋白、annexins和flotillin等融合蛋白以及分子伴侣蛋白和细胞骨架蛋白。以及众多与肿瘤发生发展相关的蛋白，如热休克蛋白、张力蛋白类似物等。外泌体含有的核酸主要包括mrna、mirna、sirna等，分别在蛋白质表达、翻译调控和基因沉默方面发挥各自的作用，参与众多的病理生理过程。而在这其中，mirna扮演着重要的角色。

mirna是天然存在于体内的21-22nt的非编码rna分子，是一类通过转录后基因沉默对靶基因表达进行调节的rna。据估计，生物体内约有1/3的基因受mirna的调控。mirna与risc的复合体通过碱基配对可与靶基因mrna5’-utr或者3’-utr中的互补序列相结合，抑制蛋白质翻译，或是引发mrna降解，从而负调控靶基因的表达。

检测mirna的表达水平可以为疾病的临床诊断提供参考。而mirna的异常表达直接导致一些与疾病发生相关基因的表达异常，诱发疾病的发生。已有报道证明mirna可以通过调控靶基因mrna的表达，在疾病发生、发展及转移中发挥重要作用。在未来临床治疗中，mirna不仅可以成为新的疾病早期诊断和疾病进程相关的标记物，而且也有望通过改变mirna的表达或者其靶基因的表达治疗疾病。寻找和鉴定与疾病发生相关的mirna及其靶基因为mirna的临床治疗提供基础。

技术实现要素：

本发明利用高通量测序筛选出了疗效pr的乳腺癌患者化疗前后存在差异表达的mirna，申请人通过扩大样本量对初筛结果进行了验证，最终证明疗效pr的乳腺癌患者化疗前和化疗后的血液外泌体中的mir-6734-5p表达水平存在显著差异，上述实验结果表明mir-6734-5p的差异表达与乳腺癌患病与否具有相关性，且mir-6734-5p可以作为治疗乳腺癌的治疗靶标。因此，mir-6734-5p可以作为诊断乳腺癌的生物标志物，也可以作为治疗乳腺癌的靶标。

根据本发明的一个方面，本发明提供了一种微小rna抑制剂在制备乳腺癌的治疗药物中的应用，所述微小rna是mir-6734-5p。

应当知道，本发明的微小rna包括组成型核酸分子的功能等同物，即变体，其显示完整微小rna核酸分子相同的功能，尽管它们通过核苷酸残基的缺失、置换或者插入而突变。

本领域人员应该了解，为了保证微小rna的稳定性，可以在微小rna的一端或者两端增加保护性碱基，如tt，也可对微小rna碱基进行修饰，但是上述修饰不影响微小rna的功能。因此，本领域技术人员熟知，在不影响mir-6734-5p功能的条件下，对mir-6734-5p进行碱基修饰或者在两端增加碱基获得的序列同样包含在本发明的保护范围之内。

在本发明的一些具体的实施方式中，所述mir-6734-5p是成熟mir-6734-5p。

进一步，所述抑制剂能够抑制mir-6734-5p的表达、或者能够抑制mir-6734-5p的稳定性、或者能够抑制mir-6734-5p的活性、或者能够缩短mir-6734-5p的作用时间。

所述抑制剂的靶标不限于mir-6734-5p本身，还包括mir-6734-5p的上下游，例如：编码mir-6734-5p的基因组序列，mir-6734-5p的靶基因、调控mir-6734-5p的蛋白或者基因。

本发明所述的抑制剂的类型没有限制，只要可以抑制mir-6734-5p的表达、或者能够抑制mir-6734-5p的稳定性、或者能够抑制mir-6734-5p的活性、或者能够缩短mir-6734-5p的作用时间的物质均可用于本发明，抑制剂的种类包括但不限于蛋白、寡核苷酸、小分子化合物、寡核苷酸表达载体。

所述用于寡核苷酸表达的载体包括病毒载体、真核载体。

病毒载体可以是任何适当的载体，包括但不限于逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺病毒相关病毒载体、疱疹病毒(例如单纯疱疹病毒、痘苗病毒及eb病毒)载体、甲病毒载体。

真核表达载体可以是任何适当的表达载体，包括但不限于pcmv-myc表达载体、pcdna3.0表达载体、pcdna3.1表达载体、pegfp表达载体、pefbos表达载体、ptet表达载体、ptre表达载体、或者在公知表达载体的基础上经改造的载体，比如pbin438、pcambia1301等。

优选地，所述mir-6734-5p抑制剂是mir-6734-5p的反义寡核苷酸(anti-mir-6734-5p)或者mir-6734-5p模拟物。

进一步，所述乳腺癌是luminal型乳腺癌。

根据本发明的另一方面，检测样本中mir-6734-5p表达水平的试剂在制备乳腺癌诊断工具中的应用。

进一步，所述样本的来源包括但不限于血液、尿液、泪液、唾液、组织液、脑脊液、汗液。在本发明的具体实施方案中，所述样本的来源是血液外泌体。

进一步，所述工具包括试剂盒、芯片、试纸、高通量测序平台。

优选地，所述试剂盒包括针对mir-6734-5p的引物和/或探针；所述芯片包括固相载体，以及固定在所述固相载体上的寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包括特异性地对应于mir-6734-5p的部分或全部序列；所述试纸包括针对mir-6734-5p的引物和/或探针；所述高通量测序平台包括针对mir-6734-5p的引物和/或探针。

进一步，所述乳腺癌是luminal型乳腺癌。

根据本发明的又一个方面，本发明还提供了一种乳腺癌诊断工具，所述工具包括检测mir-6734-5p表达水平的试剂。

进一步，所述检测mir-6734-5p表达水平的试剂包括针对mir-6734-5p的引物和/或探针。

优选地，所述引物序列如下所示：正向引物序列如seqidno.1所示，反向引物序列为通用反向引物。

根据本发明的前面所述的微小rna的序列，可以生成用于给定mirna的rna印记杂交的合适探针，包括但不限于，与目标mirna具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或完全互补的探针。

通过切口平移法或随机引物法，可以将探针标记成高比放射性，例如，通过根据切口平移法用高效放射性的核苷酸替换现有的核苷酸，可以制备比放射性大大超过108cpm/微克的32p-标记的核酸探针。然后通过使杂交的滤膜曝光于照相胶片，可以进行杂交的放射自显影检测。

药物筛选：在得知了前面所述的mir-6734-5p与乳腺癌的密切相关后，可以基于该特征来筛选抑制mir-6734-5p表达的物质。之后，可从所述的物质中找到对于治疗乳腺癌真正有用的药物。

因此，本发明还提供了一种筛选治疗乳腺癌的潜在物质的方法，所述的方法包括：用候选物质处理乳腺癌细胞体系，若所述候选物质可抑制mir-6734-5p的表达或活性，则表明该候选物质是治疗乳腺癌的潜在物质。所述细胞体系可以是亚细胞体系、溶液体系、组织体系、器官体系或动物体系(如动物模型，优选非人哺乳动物的动物模型，如鼠、兔、羊、猴等)等。优选地，对获得的潜在物质进行进一步的细胞实验和/或动物试验，以进一步选择和确定对于治疗乳腺癌真正有用的物质。

根据本发明的又一个方面，本发明还提供了一种治疗乳腺癌患者的药物组合物，所述药物组合物包括有效量的前面所述的mir-6734-5p抑制剂。

本发明使用的“有效量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量。本发明所述的mir-6734-5p抑制剂的有效量可随给药的模式和待治疗的疾病的严重程度等而变化。优选的有效量的选择可以由本领域普通技术人员根据各种因素来确定(例如通过临床试验)。所述的因素包括但不限于：所述mirna抑制剂的药代动力学参数例如生物利用率、代谢、半衰期等；患者所要治疗的疾病的严重程度、患者的体重、患者的免疫状况、给药的途径等。

本发明的药物组合物除了上述mir-6734-5p抑制剂之外，还可包括药物学上可以接受的载体，所述载体包括但不限于：稀释剂、缓冲剂、混悬剂、乳剂、颗粒剂、包囊剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、喷雾剂、透皮吸收剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、着色剂、矫味剂或吸附载体。

本发明的药物组合物可根据需要制备成各种剂型。包括但不限于，经皮、粘膜、鼻、口颊、舌下或经口使用的片剂、溶液剂、颗粒剂、贴剂、膏剂、胶囊剂、气雾剂或栓剂。

本发明的药物组合物的施用途径不受限制，只要它能发挥期望的治疗效果或预防效果即可，包括但不限于静脉内，腹膜内，眼内，动脉内，肺内，口服，小泡内，肌肉内，气管内，皮下的，通过皮肤，通过胸膜，局部的，吸入，通过粘膜，皮肤，肠胃，关节内，心室内，直肠，阴道，颅骨内，尿道内，肝内，瘤内。在某些情况下，可以系统地给药。在某些情况下是局部地给药。

本发明的药物组合物的剂量不受限制，只要获得期望的治疗效果或者预防效果即可，可以依据症状、性别、年龄等来恰当的确定。本发明的治疗药物或预防药物的剂量可以使用例如对疾病的治疗效果或者预防效果作为指标来确定。

施用本发明的药物组合物的受体可以是人类或者其他哺乳动物。更具体地，受体可以是器官、组织、细胞。

本发明用于分析mirna表达谱的方法包括但不限于以下几种：反转录聚合酶链式反应方法(rt-pcr)、实时荧光定量聚合酶链式反应方法(real-timepcr)、northern印迹杂交方法(northernblotting)、核糖核酸酶保护分析方法(rnaseprotectionassay)、solexa测序技术(solexasequencingtechnology)和生物芯片。

本发明中“微小rna”和“mirna”通用。

本发明所述的“诊断”包括对疾病状态的判断、也包括对疾病风险的判断。

本文所用的“治疗”涵盖患有相关疾病或病症的哺乳动物例如人类中治疗相关的疾病或疾病状态，并且包括：

(1)预防疾病或疾病状态在哺乳动物中发生，尤其是当该哺乳动物易感于所述疾病状态，但尚未被诊断出患有这种疾病状态时；

(2)抑制疾病或疾病状态，即阻止其发生；或者

(3)缓解疾病或疾病状态，即使疾病或疾病状态消退。

术语“治疗”通常涉及治疗人类或动物(例如，被兽医所应用)，其中可达到某些预期的治疗效果，例如，抑制病症的发展(包括降低发展速度、使发展停止)、改善病症和治愈病症。还包括作为预防措施(例如预防)的治疗。对还没有发展为病症但有发展为该病症危险的患者的用途，也包括在术语“治疗”中。

本发明的优点和有益效果：

本发明首次发现了mir-6734-5p与luminal型乳腺癌相关，通过检测受试者mir-6734-5p表达，可以判断受试者是否患有乳腺癌、或者判断受试者是否存在患有乳腺癌的风险，从而指导临床医师给受试者提供预防方案或者治疗方案。

本发明发现了一种新的微小rna标记物，相比传统的检测手段，微小诊断更及时、更特异、更灵敏，能够实现乳腺癌的早期诊断，从而降低乳腺癌的死亡率。

附图说明

图1显示利用电镜观察外泌体的结构图；

图2显示利用westernbolt检测外泌体表面蛋白表达的免疫印迹图；

图3显示利用qpcr检测mir-6734-5p表达水平的柱状图。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明进行具体的描述，有必要在此指出的是以下实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术人员可以根据上述本发明内容对本发明作出一些非本质的改进和调整。下述实施例中，若非特意表明，所用的试剂均为分析纯，所用试剂均可从商业渠道获得。文中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如j.萨姆布鲁克等编著的科学出版社2002年出版的《分子克隆实验指南》一书中所述的条件，或按照制造商所建议的条件。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。

实施例1筛选与luminal型乳腺癌相关的mirna

1.研究对象

1.1纳入标准

研究纳入2014年10月到2016年12月中国医学科学院肿瘤医院接受新辅助化疗的luminal型乳腺癌住院患者样本作为实验组，患者均为女性，均由空心针穿刺确诊为乳腺浸润性癌，病理免疫组化结果显示为luminal型。x线、ct、超声、mri及全身骨显像等影像学检查证实无远处转移，有局部淋巴结转移。均采用表柔比星+紫杉醇(at)方案进行5周期的新辅助化疗。

1.2样本和临床资料采集

全部患者均在中国医学科学院肿瘤医院住院治疗，由住院医师采集病史资料，主要包括性别，出生日期，家族史，影像学检查，病理类型，免疫组化，化疗方案及疗效评价。取得患者知情同意后，在开始新辅助化疗前，用一次性真空采血针采集患者血样，用4mledta抗凝bd采血管保存。静置10分钟后3000rpm离心10分钟，将上层血浆(约2.5ml)转移至2个1.5ml离心管中，于-80℃冰箱中保存，实验过程中避免反复冻融。

疗效评价

按照国际抗癌联盟(uicc)实体瘤通用疗效评定标准进行评估。完全缓解(cr)：临床检查肿瘤完全消失超过1个月；部分缓解(pr)：肿瘤最大直径与其最大垂直径的乘积减少>50％以上；病情稳定(sd)：肿瘤最大直径与其最大垂直径的乘积减少<50％，或增加<25％；疾病进展(pd)：肿瘤最大直径与其最大垂直径的乘积增加>25％。

将疗效cr和pr的患者定义为化疗有效，将疗效sd和pd的患者定义为化疗无效。

18例患者详细信息见表1。

表1患者基本临床信息汇总

3、血浆提取外泌体

使用sbi公司的exoquick外泌体沉降试剂盒提取血浆中外泌体，详细步骤如下：

1)将血样在冰上冻融，将凝血酶按每0.5ml血浆5μl的比例加入至离心管中，使终浓度为5u/ml。枪头吹打混匀后，室温放置5分钟；

2)室温、12000转/分钟，离心5分钟。将上清转移至一新的1.5ml离心管中；

3)将exoquickexosomeprecipitationsolution按照每250μl样品加63μl的比例加入离心管中，上下颠倒混匀。4℃孵育1小时；

4)4℃、1500g，离心30分钟；

5)吸去上清后将剩余的样品在4℃、1500g离心5分钟。用移液器吸去所有剩余的液体后，将外泌体于-80℃冰箱中保存备用。

4、westernblot实验步骤

4.1外泌体总蛋白提取

1)取由exoquick试剂盒沉淀所得的血浆外泌体，用100μl冰预冷的l×pbs将外泌体重悬、溶解；

2)向溶解的外泌体溶液中加入适量(200-300μl)蛋白裂解液，冰上作用40分钟，每10分钟剧烈震荡一次；

3)12,000rpm，4℃，离心20分钟；

4)上清即为裂解所得的外泌体蛋白，转至新的1.5ml微量离心管内于-80℃冰箱中保存备用。

4.2westernblot

bradford法测定总蛋白浓度，将各组蛋白浓度调到同一水平。制备10％sds-聚丙烯酰胺凝胶,每孔加蛋白样品100μg，电泳后通过半干式电转移仪(美国bio-rad公司)将蛋白转到硝酸纤维素滤膜。丽春红s染色确定转膜情况并标记蛋白marker位置。5％脱脂奶粉tbs缓冲液封闭4℃冰箱过夜；一抗1∶1000稀释，室温下摇2h后tbs洗膜3次；按1∶1000加入过氧化物酶标记羊抗兔igg-hrp60min，tbs洗3次后加入ecl2-3min，暗室显影2min后冲洗胶片。凝胶成像分析系统摄像分析。westernblot保存图片，用image-quant进行整合及条带灰度值分析。

5、电镜鉴定外泌体

实验步骤：

1)取由exoquick试剂盒沉淀所得的血浆外泌体，用100μl冰预冷的l×pbs将外泌体重悬、溶解；

2)用移液器吸取溶解的外泌体样品30μl(若浓度过高影响观察，可用pbs稀释10-100倍)，滴加到直径2mm的铜网上，用滤纸从液珠边缘吸去多余的液体；

3)将醋酸铀溶于水，约20-30分钟，配制成1％的醋酸铀染液。滴加至铜网上，室温负染10分钟；

4)滤纸吸干负染液后自然环境下晾干，约2小时，干燥后即可电镜观察；

5)将铜网置于透射电镜的样品室内，120kv条件下观察，拍照记录外泌体形态。

6、提取外泌体总rna

使用qiagen公司的rneasyminikit试剂盒提取外泌体总rna，详细步骤如下：

1)将700μlqiazollysisreagent加入离心管中裂解外泌体，枪头吹打混匀，室温放置5分钟；

2)加入140μl三氯甲烷，剧烈振摇混匀15秒，室温孵育2-3分钟；

3)4℃、12000g，离心15分钟；

4)离心后分为3层，其中上层水相为rna，小心将其移入新的1.5mlrnaasefree离心管中，加入1.5倍体积(约525μl)的无水乙醇后，用移液器吹打混匀；

5)吸取700μl样品(包括沉淀)，移入2ml离心管内的rneasymini过滤柱中，盖紧盖子，室温、8000g条件下离心15秒。丢弃滤液，将剩余样品重复这一操作；

6)将700μlrwt缓冲液加入到rneasymini过滤柱中，盖上盖子，室温、8000g条件下离心15秒，丢弃滤液；

7)将500μlrpe缓冲液加入到rneasymini过滤柱中，盖上盖子，室温、8000g条件下离心15秒，丢弃滤液。再次加入500μlrpe缓冲液，盖上盖子，室温、8000g条件下离心2分钟，丢弃滤液；

8)将rneasymini过滤柱转移至一新的2mlrnaasefree离心管中，室温、12000g条件下离心1分钟；

9)将rneasymini过滤柱转移至一新的2mlrnaasefree离心管中，再向过滤柱中加入适量(150μl)depc水。盖上盖子，室温、8000g条件下离心1分钟，丢弃过滤柱，滤过的rna于-80℃冰箱中保存备用。

7、mirna文库构建主要步骤

7.1实验原理

将提取的总rna样本进行片段选择，通过胶分离技术收集17-30nt或15-35nt的小rna片段，富集后按照truseqsmallrnasamplepreparationkit(illumina，rs-200-0048)方法及流程进行。在分离得到的rna片段的两端分别连接上接头，然后反转录成cdna，进行pcr扩增建立测序文库，具体如下。

7.2实验步骤

7.2.1小rna分离纯化

将血浆外泌体提取所得的总rna样本于上样缓冲液及去离子甲酰胺中混匀，55℃孵育30分钟。冰浴后采用15％page胶进行小rna(18-30nt)分离，分离后的小rna经乙醇沉淀离心富集。

7.2.2连接3’接头

1)将1μgrna溶于5μl无rna酶水中，与1μlra3一起加入一新的200μlpcr管中(总体积6μl)。

2)用枪头混匀，短暂离心后放入预热的pcr仪中，于70℃孵育2分钟。

3)将样品取出置于冰盒内，pcr仪设定为28℃。

4)将2μl连接缓冲液、1μlrna酶抑制剂及1μlt4rna连接酶2加入到一新的200μlpcr管中，操作在冰盒内进行(总体积4μl，可根据样品数量作相应调整)。

5)用枪头混匀，短暂离心后加入ra3/小rna混合物(总体积10μl)，用枪头混匀后放入预热的pcr仪中。

6)于28℃孵育1小时，加入1μl终止液后混匀，继续于28℃孵育15分钟。

7)将样品取出置于冰盒内暂存。

7.2.3连接5’接头

1)将1.1μlra5加入到一新的200μlpcr管中，放入预热的pcr仪中，于70℃孵育2分钟。

2)将样品取出置于冰盒内，pcr仪设定为28℃。

3)将1.1μl10mmatp加入到pcr管内并混匀，再加入1.1μlt4rna连接酶，混匀。

4)取出3μl加入到ra3混合物中并混匀，于28℃孵育1小时。

5)将样品取出置于冰盒内暂存。

7.2.4反转录

1)将0.5μl25mmdntp混合物及0.5μl超纯水加入到dntp混合管中，稀释为12.5mmdntp，总体积1μl(可根据样品数量作相应调整)。

2)混匀短暂离心后置于冰上。

3)将6μl加上接头的rna文库加入到一新的200μlpcr管内，再加入μlrna反转录引物，混匀。

4)短暂离心后放入预热的pcr仪中，于70℃孵育2分钟。

5)将样品取出置于冰盒内暂存，pcr仪设定为50℃。

6)将2μl5×第一链缓冲液、0.5μl12.5mmdntp混合物、1μl100mmdtt、1μlrna酶抑制剂、1μlsuperscriptii反转录酶加入到一新的200μlpcr管内，总体积5.5μl。

7)混匀后短暂离心，取5.5μl加到文库/引物混合物中，混匀后短暂离心，总体积为12.5μl。

8)放入预热的pcr仪中，于50℃孵育1小时，将样品取出置于冰盒内暂存。

7.2.5文库扩增

1)将8.5μl超纯水、25μlpcr混合物、2μlrnapcr引物、2μlrnapcr引物index加入到一新的200μlpcr管中，总体积37.5μl；

2)混匀短暂离心后置于冰上，将37.5μl的混合物与连接接头的rna混合物混匀；

3)短暂离心后放入预热的pcr仪中，pcr条件：98℃30秒；98℃10秒；60℃30秒；72℃16秒；进行11个循环，然后72℃10分钟，完后4℃保温。

7.2.6文库纯化

1)将2μlrnaladder与2μldna上样染料在1.5ml微量离心管内混匀，上样2条泳道。

2)将1μl高分辨ladder与1μldna上样染料在1.5ml微量离心管内混匀，上样1条泳道。

3)将所有扩增的cdna(约48-50μl)与10μldna上样染料在1.5ml微量离心管内混匀，上样2条泳道，总上样量50μl。

4)145v恒压电泳1小时，至染料跑出凝胶。

5)将胶取下，用溴化乙锭染2-3分钟后用凝胶成像系统显影。

6)用刀片将22-30nt小rna片段的凝胶切下，放入0.5ml的破胶离心管中。

7)在20000g条件下离心2分钟除去胶。

7.2.7文库浓缩

1)加300μl超纯水至残胶中，振荡2小时以上或过夜以析出dna。

2)将残胶和液体滤过5μlm滤器，600g离心10秒，弃去滤器。

3)向滤液中加入2μl糖原、30μl3m乙酸钠、975μl无水乙醇，4℃、20000g离心20分钟。

4)弃去上清，若沉淀疏松，再次20000g离心2分钟。

5)用500μl75％乙醇洗涤沉淀，20000g离心2分钟，弃去上清。

6)开盖37℃下将沉淀烘干(约7分钟)，用10μl10mmtris-hcl(ph8.5)将沉淀重悬。

7)取1μl重悬的文库于agilenttechnologies2100bioanalyzer进行库检及测序。(由安诺优达公司完成)

8、二代测序及分析

illumina测序技术基于微阵列和可逆终止子技术进行大规模的平行测序及边合成边测序。cdna的随机片断通过接头序列附着到流动槽(flowcell)表面，然后通过桥式扩增，形成数以亿计的dna簇，然后用4种不同荧光标记的末端封闭的碱基进行边合成边测序。illumina测序技术在一定程度上保证了高精确度，单个碱基逐个测序可有效避免同聚物和重复序列产生的测序错误。7.数据过滤处理对高通量测序结果所获得的原始测序序列(rawreads)进行去接头、去低质量片段等处理，以获得用于后续分析的目标序列(cleanreads)。

数据过滤处理的具体步骤包括：

1)去除测序质量较低的序列；

2)去除无法确定碱基信息的比例大于10％的序列；

3)去除没有3'接头的序列；

4)去除有5'接头污染的序列；

5)去除没有插入片段的序列；

6)去除包含ploya/t的序列(大部分连续的polya/t，可能来源于测序错误)；

9、信息分析

9.1已知mirna分析

通过与存储mirna信息的最主要数据库之一的mirbase(release21)中基因组注释信息进行比对，或者将数据库中的mirna序列比对到样本的基因组中，从而得到目前已知的所有mirna成熟体和前体在基因组中的定位信息，继而按100％的位置重叠来匹配目标序列在基因组中的比对信息与mirna的定位信息，便能鉴定出两组样品中已知的mirna，通过统计学方法得出数据，进一步对其序列、结构特征和数量等进行分析。

9.2mirna差异表达分析

mirna的表达具有组织特异性和时序性，因而两组样本中mirna的表达可能存在差异，这些差异表达的mirna可能在耐药性方面发挥至关重要的作用。通过差异分析，可以筛选出差异表达显著的mirna。具体如下：

首先将两组样品的测序结果归一化到同一量级，根据标准化的结果将两组中共同表达的已知mirna使用log2-ratio比较表达量的差异，结果用差异倍数(foldchange)及校正后的显著水平(p值)两个水平进行评估，foldchange＝log2(sd/pr)。

10、统计学分析采用graphpadprism7软件进行统计学分析及作图，p<0.05被认为具有统计学差异。计量资料采用平均值±标准差表示，两组间比较采用lsd-t检验。

11、结果

11.1透射电镜鉴定血浆外泌体

试剂盒沉降法所获得的血浆外泌体样品如图1(x80000)所示。图1中白色箭头所指透亮的囊泡状结构为外泌体，背景中深色斑块考虑为试剂盒沉降杂质。

11.2westernblot

westernblot法检测血浆分离的外泌体的特异性表面蛋白cd63、cd81的表达结果如图2所示。其中53kda条带代表cd63，28kda条带代表cd81，选取2个病人的外泌体进行验证。结果显示，由外泌体沉降试剂盒从病人血浆中分离的外泌体其表面蛋白cd63和cd81均高表达，结合电镜结果，试剂盒所提取的为外泌体相对较为明确。

11.3血浆外泌体mirna测序结果及分析

化疗前后血浆mirna的差异表达

为明确在疗效pr患者在化疗前后的差异表达的mirna，通过edger软件对表达量以log2-ratio进行两两比较，筛选出表达量存在差异的mirna，利用p值表示mirna在两组间表达差异的显著程度。

通过对5位pr组患者化疗前及化疗过程中血浆外泌体的mirna变化情况进行分析，在所有患者中呈下降趋势的mirna共6个；在所有患者中呈上升趋势的mirna共99个。其中，mir-6734-5p在化疗后表达下调且差异具有统计学意义。

实施例2大样本验证差异表达mirna

1、1.研究对象

1.1纳入标准

研究纳入2014年10月到2016年12月中国医学科学院肿瘤医院接受新辅助化疗的luminala型乳腺癌住院患者样本作为实验组，共80例，患者均为女性，均由空心针穿刺确诊为乳腺浸润性癌，病理免疫组化结果显示为luminal型。x线、ct、超声、mri及全身骨显像等影像学检查证实无远处转移，有局部淋巴结转移。均采用表柔比星+紫杉醇(at)方案进行5周期的新辅助化疗。其中50例患者疗效为pr。

1.2样本和临床资料采集

全部患者均在中国医学科学院肿瘤医院住院治疗，由住院医师采集病史资料，主要包括性别，出生日期，家族史，影像学检查，病理类型，免疫组化，化疗方案及疗效评价。取得患者知情同意后，在开始新辅助化疗前，用一次性真空采血针采集患者血样，用4mledta抗凝bd采血管保存。静置10分钟后3000rpm离心10分钟，将上层血浆(约2.5ml)转移至2个1.5ml离心管中，于-80℃冰箱中保存，实验过程中避免反复冻融。

2、外泌体rna提取步骤同实施例1。

3、逆转录：将10pg-1μg的总rna模板与2μl10*缓冲液、2μldatp(10mm)、0.5μlpolya多聚酶、0.5μl核糖核酸酶(rnase)抑制剂和无核糖核酸酶水(rnasefreewater)混合，体积最后为20μl，37℃孵育1h。然后反应管中加入1μl0.5μg/μloligo(dt)特异性rt引物，70℃孵育5min后立刻冰上孵育至少2min，打断rna和引物的二级结构。最后，将上述20μl反应混合物与4μl5*缓冲液、1μldntp(10mm)，0.5μlm-mlv逆转录酶，0.5μl核糖核酸酶(rnase)抑制剂，10μlpolya反应混合液和4μl无核糖核酸酶水(rnasefreewater)混合，42℃孵育1h。

4、qpcr反应：采用25μl反应体系，每个样本设置3个平行管，所有扩增反应均重复三次以上以保证结果的可靠性。配制以下反应体系：sybrgreen聚合酶链式反应体系12.5μl，正向引物(5μm/μl)1μl，反向引物(5μm/μl)1μl，模板cdna2.0μl，无酶水8.5μl。各项操作均于冰上进行。扩增程序为：95℃10min，(95℃15s，60℃55s)*45个循环。以sybrgreen作为荧光标记物，在lightcycler荧光实时定量pcr仪上进行pcr反应。扩增mir-6734-5p的正向引物序列为：5’-ttgaggggagaatgaggtggaga-3’(seqidno.1)，反向引物为通用反向引物(购自北京旷博生物技术有限公司)。以snrnau6作为参照基因，其上游引物序列为：5’-ctcgcttcggcagcaca-3’(seqidno.2)；下游引物序列为：5’-aacgcttcacgaatttgcgt-3’(seqidno.3)。通过融解曲线分析和电泳确定目的条带，δδct法进行相对定量。

5、结果

如图3所示，与化疗前相比，化疗后患者的血液外泌体中mir-6734-5p的表达水平显著降低(p＜0.05)，表明mir-6734-5p与乳腺癌具有相关性。

上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

序列表

<110>中国医学科学院肿瘤医院

<120>mir-6734-5p在制备luminal型乳腺癌诊断工具中的应用

<160>3

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>23

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

ttgaggggagaatgaggtggaga23

<210>2

<211>17

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

ctcgcttcggcagcaca17

<210>3

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

aacgcttcacgaatttgcgt20