一种特异性靶向光热材料及其制备方法和用途与流程

本发明属于医学治疗领域，涉及一种药物，具体来说是一种特异性靶向光热材料及其用途。

背景技术：

前列腺癌在美国男性中一直处于发病率首位，死亡率第二位。国内的数据显示，中国男性人群中前列腺癌发病率处于第六位，而且发病率逐年上升。迄今为止，对于局部早期的前列腺癌推荐前列腺癌根治术，但仍然存在尿控及勃起功能障碍等并发症多，生活状态差的劣势。因此我们研发一种特异性杀伤肿瘤细胞及组织，但保留正常组织的新的治疗方法具有非常好的前景。目前采用纳米颗粒介导并近红外光催化的局部光热物理治疗，在前列腺癌的治疗上已有产品进入临床研究，但存在靶向能力不足，杀伤效率低等劣势。因此，我们需要研发一种具有特异性靶向能力且具有高效杀伤效果的新的光热介质体系。

间充质干细胞是一类新型靶向实体肿瘤的生物载体。近两年，间充质干细胞作为一种普适性的纳米药物载体靶向治疗开始成为国际医学和材料界一个前沿研究领域。纳米材料如纳米金棒、高分子聚合物纳米颗粒、以及介孔纳米二氧化硅等通过与间充质干细胞结合，用于输送化疗药物或者光热介质。间充质干细胞具有很多独特的优势，首先对肿瘤细胞有很强的趋向性；其次可以躲避机体的免疫杀伤，避免大量的纳米材料损失；然后能自我更新，这样可以在体内维持干细胞整体的稳定，更有利于将纳米材料稳定输送。

近红外光激发的纳米材料介导的光热治疗具有安全、穿透深、光热效果好的特点。金纳米材料的优点体现在在近红外光(波长为750-1400nm)的激发下能选择性的杀死癌症细胞，且对正常组织细胞的损伤较小。而纳米金星结构由于其表面等离子共振(lspr)效应，共振吸收峰位可调，具有很好的光热转化效率，是一种生物相容性很好的光热转换材料，通过自组装可加强纳米颗粒间的lspr的耦合，进一步提高光热转化效率，可以在更低的浓度下达到更高的热杀伤温度，在肿瘤热疗方面示出潜在的应用前景。

技术实现要素：

针对现有技术中的上述技术问题，本发明提供了一种特异性靶向光热材料及其用途，所述的这种特异性靶向光热材料及其用途要解决现有技术中的治疗前列腺癌的纳米材料靶向能力不足，杀伤效率低的技术问题。

本发明提供了以纳米金星作为光热介质，利用间充质干细胞作为纳米金星的载体，先在纳米金星的表面修饰有巯基聚乙二醇羧基，再采用细胞穿膜肽对纳米金星进行表面修饰，所述的细胞穿膜肽的氨基酸序列为ygrkkrrqrrr-nh2。

本发明还提供了上述的一种特异性靶向光热材料的制备方法，包括如下步骤：

1)将1mm的haucl4水溶液和38mm的二水合柠檬酸三钠水溶液混合，所述haucl4水溶液和二水合柠檬酸三钠水溶液的体积比为20～25ml：4～5ml，90～110℃油浴回流，得到金种子；

2)将25mmhaucl4、1mhcl、步骤1)的金种子、3mmagno3及0.1m的抗坏血酸分散于蒸馏水中搅拌得到纳米金星水溶液，所述的haucl4、hcl、金种子、agno3及抗坏血酸的体积比为500～700μl：550～750μl：450～650μl：400～800μl：100～400μl；

3)在步骤2)的纳米金星水溶液中加入巯基peg羧基，所述的巯基peg羧基的分子量为5000，浓度为5mg/ml，所述纳米金水溶液和巯基peg羧基的体积比为50～60ml：2～3ml，搅拌过夜，得到聚乙二醇修饰的纳米金星；

4)在步骤3)的聚乙二醇修饰的纳米金星体系中，加入细胞穿膜肽，控制加入后体系中所述的细胞穿膜肽最终浓度为10～40μμ，以1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和n-羟基琥珀酰亚胺为催化剂，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和n-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为0.5～1.5：1～2，得到细胞穿膜肽修饰的纳米金星；

5)以10000个/ml浓度接种人脐带间充质干细胞于培养皿中，然后加入细胞穿膜肽修饰的纳米金星，加入后的所述的细胞穿膜肽修饰的纳米金星的浓度为100-300pm进行孵育，20～30h后消化收集得到特异性靶向光热材料。

本发明还提供了上述的一种特异性靶向光热材料在制备治疗前列腺癌的药物中的用途。

进一步的，步骤4)中的反应体系为水相。

进一步的，步骤5)中，与间充质干细胞共孵育的tat修饰的纳米金星的浓度为160pm，且孵育时间为24h，培养环境为37℃，5％co2。

具体的，所述的细胞穿膜肽的氨基酸序列为：tyrglyarglyslysargargglnargargarg-nh2。通过24h细胞穿膜肽的孵育达到干细胞溶酶体内自组装的效果。

本发明以种子生成法生成纳米金星，通过聚乙二醇(peg)稳定金星，tat(ygrkkrrqrrr-nh2)进行表面修饰增加干细胞内吞量，利用人脐带来源的间充质干细胞作为纳米金星的载体，在干细胞内部进行自组装，得到具有特异性靶向功能的智能型复合体系，用于前列腺癌的局部光热治疗，可以增加纳米金星在肿瘤内部的输送及分布浸润，在近红外激光(808nm)的激发下，金星可以迅速升温，达到靶向局部光热治疗的效果。

本发明的采用特异性靶向光热材料对前列腺癌局部光热治疗的新方法是，把载有纳米金星的干细胞局部注射于小鼠前列腺癌皮下荷瘤模型中，利用干细胞的归巢能力，增加纳米金星在瘤内的分布和浸润，在近红外激光(808nm)激发下迅速产热，达到杀灭肿瘤的温度，成功抑制肿瘤的生长，实现前列腺癌局部光热治疗的目的。

具体的是通过瘤内注射的方法，收集携带纳米金星的间充质干细胞，计数10万细胞，悬浮于10μl的pbs中，通过瘤内注射于小鼠前列腺癌皮下荷瘤模型中。在近红外激光(808nm，1w/cm²，10min)的照射下，可以有效抑制肿瘤的生长。

本发明利用间充质干细胞的特异性归巢作用，以及纳米金星的高效光热转化效果，结合两者的优势，有机结合得到特异性靶向作用的高效光热介质，在小鼠前列腺癌皮下荷瘤模型中具有很好的肿瘤杀伤效果，为前列腺癌局部物理治疗提供一种新的治疗方法及治疗策略。

本发明和已有技术相比，其技术进步是显著的。本发明第一次采用间充质干细胞和纳米金星的有机结合，纳米金星表面无有毒表面活性剂，间充质干细胞具有很好的免疫逃逸及生物相容性。本发明在细胞及动物实验中表明，采用间充质干细胞装载纳米金星的体系可以促进纳米金星的靶向输送及在肿瘤内的分布浸润。在近红外光的激发下可以达到更好的肿瘤杀伤效果，为进一步的临床前研究打下基础。

附图说明

图1是tat-gns的透射电镜图片。

图2是peg-gns和tat-gns的紫外吸收图谱和红外光谱。

图3是peg-gns和tat-gns的dls粒径分布。

图4是peg-gns和tat-gns的zeta电位。

图5是peg-gns和tat-gns在808nm激光激发下的升温曲线。

图6是peg-gns和tat-gns在间充质干细胞中的内吞能力对比(a)和tat-gns对间充质干细胞的毒性作用。

图7是间充质干细胞装载纳米金星的细胞电镜图和icp-ms结果。

图8是间充质干细胞装载纳米金星在近红外激光的暴露下对pc-3细胞的杀伤效果。

图9是小鼠前列腺癌皮下荷瘤模型中进行局部光热治疗结果。

图10是本发明的机制和流程图。

具体实施方式

实施例1种子生成法制备纳米金星(gns)，tat-gns

强细胞内吞能力纳米金星合成：

金种子制备：25ml的1mmhaucl4，加入4ml的38mm二水合柠檬酸三钠，100℃油浴回流15min，冷却，4℃保存。

将25mmhaucl4、1mhcl、金种子、3mmagno3及0.1m的抗坏血酸分散于60ml蒸馏水中搅拌1min得到纳米金星，所述的haucl4、hcl、金种子、agno3及抗坏血酸的体积比为500～700μl：550～750μl：450～650μl：400～800μl：100～400μl。

在纳米金体系中加入巯基peg羧基(5k)，所述的巯基peg羧基浓度为5mg/ml，所述纳米金水溶液和巯基peg羧基的体积比为50～60ml：2～3ml，搅拌过夜，得到聚乙二醇修饰的纳米金星(peg-gns)。

在10ml的聚乙二醇修饰的纳米金星体系中，终浓度300pm的peg-gns以及终浓度为30μμ的tat(ygrkkrrqrrr-nh2)，加入25μmol的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(edc)和30μmol的n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)，edc/nhs的摩尔比＝1：1.2。反应24h后10000rpm离心10min，并清洗3遍，得到tat-gns。

通过透射电镜观察得到的材料平均粒径在70nm左右，在780nm附近有最强吸收峰，通过红外光谱检测，在1650cm^-1和1550cm^-1附近有双峰，为羰基及酰胺键的特征吸收峰，可见tat以成功修饰上纳米金星表面。通过dls测得结果可得tat-gns的水合粒径为102.13nm，电位为-3.74mv，如图1至图4所示。tat-gns在近红外激光(808nm)的激发下，可以在10min内最高升温35℃。说明本发明中的纳米金星具有很好的光热转化效果。

实施例2间充质干细胞装载纳米金星的制备

以10000个/ml浓度接种干细胞于6孔板中，以160pm的浓度孵育tat-gns于间充质干细胞中，24h后消化收集携带纳米金星的间充质干细胞并计数。

同时将收集的间充质干细胞装载纳米金星与前列腺癌细胞系(pc-3)共培养，在808nm激光暴露下，2.5w/cm²，3min，4h后通过活-死细胞染色及cck-8试剂盒检测活性。图5显示了peg-gns和tat-gns在808nm激光激发下的升温曲线。

如图6所示，孵育24h后，通过显微镜观察，tat-gns具有很强的细胞内吞能力，纳米金星聚集于干细胞内(a)。通过cck-8试剂盒检测间充质干细胞装载纳米金星后的增殖能力，可见320pm浓度的纳米金星也不会对间充质干细胞产生毒性影响(b)。说明本发明中的tat-gns对干细胞几乎无毒性。

如图7所示，通过细胞透射电镜观察，4h孵育后，纳米金星在间充质干细胞内呈现散在的状态，内吞量较小(a)。而24h孵育后得到的材料聚集于干细胞的溶酶体内，呈细胞内自组装的形态(b)。通过icp-ms检测，24h孵育的纳米金星内吞量远远大于4h孵育。

如图8所示，1：1的共培养比例下，一次照射就可达到60％的杀伤效率，在4：1的共培养比例下，一次照射就可达到90％以上的杀伤效率。

实施例3小鼠前列腺癌皮下荷瘤模型中进行局部光热治疗结果

收集携带纳米金星的间充质干细胞，计数10万细胞，悬浮于10μl的pbs中，通过瘤内注射于小鼠前列腺癌皮下荷瘤模型中。分成pbs组(注射10μlpbs)、gns组(注射10μl的等量tat-gns溶液)和mscs(间充质干细胞)+gns组(注射悬浮于10μlpbs的10万细胞)三组。在近红外激光(808nm，1w/cm²，10min)的照射下，可以有效抑制肿瘤的生长。

如图9所示，a为pbs组、gns组和mscs+gns组在1w/cm2的激光照射下的红外热成像仪，可见本发明中用间充质干细胞装载纳米金星的组具有最高的升温效果，从b中可以看出，可在3min内，升温效果达到平台期，可以升温10℃，温度远高于肿瘤能耐受的临界温度(42℃)，并维持一段时间。c图所示在经过治疗后，三组小鼠的体重并无太大变化。从d图和e图中所示，mscs+gns组可以达到最好的肿瘤抑制效果。由此可见，本发明中的间充质干细胞装载纳米金星体系具有非常好的靶向局部光热治疗效果。