包含糖原和透明质酸或其盐的协同组合的眼科组合物的制作方法

本发明涉及包含糖原和透明质酸或其盐的协同组合的眼科组合物，涉及其制备方法，和涉及其用于治疗干眼综合征的用途。具体地，本发明涉及一种眼科组合物，其中糖原和透明质酸(ha)或其药学上可接受的盐以提供治疗有效性的协同增加的量存在。本发明的眼科组合物可用于解除由具有潜在表面上皮损伤的眼睛的充分润滑和水分的长期缺乏引起的眼不适症状。
背景技术：
：泪膜是由浅表脂质层和与粘液凝胶层混合的水层组成的相对稳定的薄膜，所述粘液凝胶层部分地附着于角膜和结膜表面上皮。天然泪膜对于眼表面的润滑和维持而言是重要的。干眼综合征(des)是一种多因子疾病，其特征在于眼睛不能维持足以适当地润滑它的泪液层。des的特征在于泪膜的一种或多种组分的功能障碍，从而导致泪膜稳定性的丧失、泪膜的摩尔渗透压浓度(osmolarity)增加和眼睛表面的炎症。该病症与眼不适的症状(诸如发痒、刺激、异物感、发红、畏光和疼痛)有关。这些症状经常在傍晚或者需要视觉注意力的长时间段(诸如阅读、驾驶或计算机工作)以后加重。des可以源自以下原因之一：减少的泪液产生、过度的泪液蒸发、在泪液层中常见的粘液或脂质的产生的异常。泪腺对泪液的产生不足可能是年龄、激素变化或各种自身免疫疾病(诸如原发性舍格伦综合征(sjogrensyndrom)、类风湿性关节炎或狼疮)的结果。水样泪液层的蒸发损失经常是上覆脂质层不足的结果。一些药物诸如抗组胺药、抗抑郁药、β-阻滞剂和口服避孕药可能减少泪液产生。lasik和其它视力矫正操作可能在它们穿透眼睛的表面并且降低角膜神经敏感性之后造成干眼。此后，眼睛不能感知对润滑的需要，并且造成不足的泪液产生。如果不治疗且不矫正的话，des可以导致对眼睛的永久性损伤，暴露的眼组织的降解或角膜组织的分解，在极端情况下需要角膜移植。由眼睛的充分润滑和水分的长期缺乏引起的眼不适的最常见治疗包括通过局部施用泪液替代物来减轻症状，所述泪液替代物向眼睛的前表面添加一定体积的液体。人工泪液尝试替代天然泪液，模仿它们的高含水量和它们的生理化学性能(摩尔渗透压浓度、ph、粘度、润湿能力)。典型的泪液替代物组合物包含水溶性的、水性的聚合物组合物。许多聚合物已经用在局部地可施用的眼科组合物中。在这些中包括纤维质聚合物诸如羟丙基甲基纤维素、羟乙基纤维素和乙基羟乙基纤维素。还包括合成的聚合物诸如羧基乙烯基聚合物和聚乙烯醇。其它包括多糖诸如黄原胶、瓜尔胶、葡聚糖和透明质酸。聚合物的组合也已经用在眼科组合物中。已知某些聚合物组合会提供粘度的协同效应，和在某些情况下，甚至从液体至凝胶的相变。人工泪液作为滴剂递送至眼睛，且它们通过鼻泪管进行快速引流。为了克服该问题，人工泪液由增加与眼睛表面的接触时间的成分组成。这些成分被设计成具有粘膜粘着性能。一个问题是所述成分的高粘度。在许多情况下，如果组合物含有足够高浓度的活性成分，它是如此粘稠以致于应用对于患者而言是不舒服的，且高粘度导致问题诸如刺激和视力模糊。在克服高粘稠物质的应用的缺点的尝试中已经执行多种制剂策略。一种策略是应用不太粘稠的制剂，其依赖于它的粘膜粘着性能以保留在眼睛表面上。透明质酸钠具有粘膜粘着性能，是一种粘弹性的聚合物且具有抗炎性能，其可以用于治疗在des中普遍的表面炎症。它是一种高分子量聚合物，且它的溶液是非常粘稠的。使用单独ha的尝试已经产生以下问题：当以足以治疗des的高浓度使用时，该成分倾向于刺激眼睛。wo2009/044423公开了被指示用作泪液替代物的眼科溶液，其含有0.4％的透明质酸和0.2％的多糖(被称作tsp，酸豆籽多糖(tamarindusindicaseedpolysaccharide)的组合，它们当一起组合施用时能够在刺激恢复至受干眼综合征影响的结膜粘膜层的正常状态中协同地起作用。ep1069885公开了基于糖原多糖的用于眼科应用的保湿剂和润滑剂溶液，这样的溶液表现出低粘度和低胶体渗透压(oncoticpressure)，并对角膜产生舒适的清爽的、润滑的和保湿的效果。技术实现要素：申请人面对获得用于治疗和/或预防des的眼科组合物的问题。具体地，申请人面对这样的问题：获得用于治疗des的低粘稠的、粘膜粘着的和非刺激性的眼科组合物。广泛研究以后，申请人已经令人惊讶地发现，与从含有等量的单独任一种组分的组合物预见到的效力相比，或者与从两种组分的性能的组合预见到的效力相比，含有透明质酸钠和糖原的组合物在以下方面显示出提高的效力：减轻与眼不适的症状(其由眼睛的充分润滑和水分的长期缺乏引起)有关的炎症参数，保护眼睛免于过度的基质降解，和促进表面上皮损伤以后的角膜重新上皮形成。观察到的这两种成分之间的协同效应使得能够配制这样的组合物：其中它们以低浓度存在，通常在对于透明质酸(通常作为透明质酸钠)而言0.15％和对于糖原而言3％的量级。含有透明质酸钠和糖原的联合(association)的组合物具有以下另外优点：是粘膜粘着的、假塑性的和低粘稠的。因此，在第一方面，本发明涉及一种眼科组合物，其包含糖原和透明质酸或其药学上可接受的盐的协同组合、和至少一种药学上可接受的赋形剂，其中所述组合物包含在1％至6％w/w范围内的量的所述糖原和在0.05％至0.3％w/w范围内的量的所述透明质酸或其药学上可接受的盐。除非另外指出，所有百分比w/w(％w/w)以相对于眼科组合物的总重量的重量表示。在第二方面，本发明涉及一种用于治疗干眼综合征的眼科组合物，其包含糖原和透明质酸或其药学上可接受的盐的协同组合、和至少一种药学上可接受的赋形剂。根据另一个方面，本发明也涉及一种用于治疗干眼综合征的方法，其中所述方法包括向有此需要的患者应用治疗有效量的眼科组合物，其包含糖原和透明质酸或其药学上可接受的盐的协同组合、和至少一种药学上可接受的赋形剂。附图说明图1解释了在根据实施例3.1b的治疗以后，人角膜上皮(hce)表面在2,000倍、10,000倍和20,000倍的放大率的sem照片。图2解释了在根据实施例3.2b的治疗以后，hce切片在20倍的放大率的光学显微术照片。图3解释了在根据实施例3.2c的治疗以后，hce表面在2,000倍的放大率的sem照片。发明详述本发明的眼科组合物包含糖原和透明质酸或其药学上可接受的盐的协同组合。在本发明的眼科组合物中使用的糖原得自天然糖原，所述天然糖原可以提取自动物或植物或者化学地和酶促地合成。软体动物类、尤其贻贝(紫贻贝(mytilusedulis)和mytilusgallusprovincialis)是特别有用的糖原来源，因为它们可以以低成本大量得到并含有适当量的糖原(平均而言2.5重量％至3.9重量％)。糖原的其它天然来源包括其它双壳软体动物类诸如蛤、牡蛎，腹足类或海螺类的某些种，诸如slipperlimpets(大西洋舟螺(crepidulafornicata))，以及富含糖原的脊椎动物器官，诸如肝和肌肉。糖原的另一种来源是淀粉，其可以使用特定酶转化成糖原(如在ep1813678中公开的)。在本发明的眼科组合物中使用的糖原可以原样使用，诸如得自上述提取过程和化学或酶促合成，或可以在后续纯化操作中处理。市售糖原的特性取决于更大或更小量的蛋白残基(以表达为ppm的氮量的方式测量)和还原糖的存在。为了本发明的目的，具有低还原糖和氮含量的糖原的应用是优选的。在本发明中优选地使用的市售产品的例子是由sigma-aldrich生产和分销的糖原。优选地，在本发明中使用的糖原包含小于1重量％且更优选地小于0.25重量％的还原糖，这根据f.d.snell和snell,“colorimetricmethodsofanalysis”,newyork,1954,第iii卷,第204页的方法测量。优选地，在本发明中使用的糖原包含小于1000且更优选地小于100ppm的氮，这使用kjeldahl方法测量。有利地，在本发明中使用的糖原是polglumyttm糖原，即由意大利罗马的a.c.r.a.f.s.p.a.生产和销售的脱蛋白化糖原的商业名称，并根据在专利ep654048b1中描述的纯化方法获得。本发明的眼科组合物包含1％至6％w/w、优选地2％至5％w/w和更优选地3％至4％w/w的范围内的量的糖原。有利地，本发明的眼科组合物包含约3％w/w的量的糖原。透明质酸在化学上可定义为无分支的糖胺聚糖，其由通过交替的β-1,4和β-1,3糖苷键连接的d-葡糖醛酸(gicua)和n-乙酰基-d-葡糖胺(gicnac)的交替单元组成，其结构可以由下式表示：其显示了二糖单元，且其中单元的重复对的数目n使得多糖的分子量被包含在50,000和数百万道尔顿(da)之间。在本发明的优选实施方案中，透明质酸(以对应钠盐的形式)的平均分子量是在100,000da至10,000,000da之间，且更优选地在1,000,000da至5,000,000da之间。在最优选的实施方案中，透明质酸(以对应钠盐的形式)的平均分子量是在2,000,000da至3,000,000da之间。透明质酸可以分离自多种来源，例如，人脐带、公鸡的鸡冠或脊椎动物的结缔组织。透明质酸也存在于细菌诸如链球菌中，且因此也可以通过发酵过程获得。根据本发明可以使用透明质酸或透明质酸的盐。优选地，所述盐是药学上可接受的盐。药学上可接受的盐的例子是碱金属盐诸如钠或钾盐或碱土金属盐诸如镁或钙盐。在最优选的实施方案中，采用透明质酸钠。本发明的眼科组合物包含在0.05％至0.3％w/w、优选地0.1％至0.25％w/w和更优选地0.15％至0.2％w/w的范围内的量的透明质酸或其药学上可接受的盐。有利地，本发明的眼科组合物包含约0.15％w/w的量的透明质酸或其药学上可接受的盐。本发明的眼科组合物包含在约5:1至约40:1、优选约10:1至约30:1、更优选约15:1至约25:1的范围内的重量比的糖原和透明质酸或其药学上可接受的盐。有利地，本发明的眼科组合物包含约20:1的重量比的糖原和透明质酸或其药学上可接受的盐。通常，根据本发明的眼科组合物具有在5-100cp之间、优选地在10-40cp之间、和甚至更优选地在15-30cp之间的粘度。通常，根据本发明的眼科组合物具有小于5mmhg的胶体渗透压。优选地，它具有小于3mmhg的胶体渗透压。根据本发明的眼科组合物也可以含有其它常规成分诸如一种或多种药学上可接受的缓冲剂、防腐剂、张度调节剂、ph-调节剂、增溶剂、稳定剂、着色剂、抗氧化剂、螯合剂、软化剂、保湿剂和/或润滑剂。所述缓冲剂可以包括适合用于维持希望的ph范围的任何弱共轭酸碱对。有用的例子包括、但不限于碳酸氢盐缓冲剂、乙酸盐缓冲剂、柠檬酸盐缓冲剂、磷酸盐缓冲剂、硼酸盐缓冲剂或氨丁三醇(tris，2-氨基-2-羟基甲基-1,3-丙二醇)缓冲剂和它们的组合。例如，可以使用磷酸二氢盐、磷酸氢盐等的组合、或氨丁三醇和氨丁三醇盐酸盐，并且将选择它们的量从而调节根据本发明的眼科组合物的ph在5-9之间，优选地在6-8之间。优选地，所述缓冲剂将是磷酸盐缓冲剂或氨丁三醇缓冲剂。有利地，将调节根据本发明的眼科组合物的ph在6.5和7.5之间。所述防腐剂可以变化，且可以包括适合用于防止眼用制剂中的微生物污染的任何化合物或物质。防腐剂选自过酸盐诸如过硼酸盐、过碳酸盐等；醇，诸如苯甲醇、三氯叔丁醇等；含有季铵盐的防腐剂诸如苯扎氯铵、苯扎溴铵、聚季铵盐；基于胍的防腐剂，包括聚六亚甲基双胍(phmb)、氯己定等；汞防腐剂诸如硫柳汞、醋酸苯汞和硝酸苯汞；金属亚氯酸盐，诸如碱金属和碱土金属亚氯酸盐等；山梨酸和眼睛可接受的盐诸如山梨酸钾和混合物；氧化性防腐剂诸如稳定化的氧氯复合物(例如)。是allergan,inc.的注册商标。防腐剂的量在相对宽的范围内变化，取决于采用的具体防腐剂。如果不将防腐剂加入眼科溶液中，所述眼科溶液可以用作单剂量型滴眼剂，其中所述眼科溶液在一次施用中用完。否则，所述眼科溶液可以用作多剂量型滴眼剂，其被包括在例如用于分配滴眼剂的容器(所述容器具有连接至容器的喷嘴的过滤器)中，或被包括在无空气应用系统装置中。通过张度增强剂(tonicityenhancingagent)来调节张度。这样的试剂可以例如属于离子型和/或非离子型。离子型张度增强剂的例子是碱金属或碱土金属卤化物，例如，以下一种或多种：氯化钙、氯化钾、氯化钠、氯化锂、溴化钾、溴化钠、碘化钠、磷酸钠、磷酸钾、硫酸钠和硫酸钾、碳酸氢钠和碳酸氢钾和硼酸。非离子型张度增强剂是，例如，脲、甘油、山梨醇、甘露醇、丙二醇、右旋糖或它们的组合。甘油、氯化钠和甘露醇是最优选的张度增强剂。张度剂(tonicityagent)的量可以随需要等渗、高渗或低渗液体而变化。本发明的组合物通常具有在150-1500mosm/kg的范围内、优选地在150-500mosm/kg的范围内和最优选地在180-250mosm/kg的范围内的重量摩尔渗透压浓度(osmolality)。通过将所述成分溶解在水性介质中，可以制备根据本发明的眼科组合物。去离子水是优选的水性介质，其可以包含小量的其它亲水溶剂，诸如二醇类和/或多元醇类。可以如下制备所述组合物：制备一种或多种成分的溶液，并然后加入剩余的一种或多种成分，或制备两种或更多种单独的溶液，各自包含一种或多种成分，然后将这样的溶液都混合在一起。在一个优选的实施方案中，如下制备本发明的眼科组合物：将糖原加入预先制备的透明质酸或其盐、优选透明质酸钠的水溶液中，然后加入其它的常规成分。但是，加入常规成分的确切次序不是特别相关的。作为一个非限制性例子，可以在已经混合所有活性成分以后，而不是在制备含有它们中的仅一种的溶液以后，加入所述缓冲剂。通常，摩尔渗透压浓度和ph的调节是制备的最后一步，但是发明人预见到盐、酸和碱的中间添加(发生在本发明的其它步骤之间)是在本发明范围内。最后将所述溶液通过常规方法灭菌，例如，通过在高温(优选50℃至80℃，更优选60℃至80℃)加热在30分钟至几小时的范围内的时间段。优选地，如下获得无菌组合物：在70℃加热1小时，并然后将所述溶液穿过0.22μmpes灭菌过滤器(如在us20110195925a1中公开的，通过引用并入本文)过滤。更优选地，通过将所述溶液穿过0.22μm灭菌过滤器过滤，获得无菌组合物。下述实施例用于举例说明本发明，但是不限制它。实施例1眼科溶液的制备通过在室温将下表1列出的组分溶解在预定量的水中，制备一组六种眼科溶液1-6。在所有成分完全溶解以后，将所述溶液加热至70℃保持1小时。在热处理步骤以后，将所述水溶液穿过0.22μmpes灭菌过滤器过滤以提供灭菌的溶液。表11(i)2(i)3(i)4(i)5(c)6(c)透明质酸钠0.150.150.100.150.15-polglumyt3333-3nacl0.65--0.680.650.65氨丁三醇0.0910.0910.091-0.0910.091甘露醇-3.53.5---na2hpo4*12h2o---0.056--nah2po4---0.004--hcl适量至ph7.27.27.2-7.27.2水适量至ml100100100100100100如上所述制备的六种眼科溶液1-6具有在下表2中总结的性能。表21(i)2(i)3(i)4(i)5(c)6(c)ph7.27.27.27.27.27.2重量摩尔渗透压浓度(mosm/kg)234232231235234233粘度(cp)16551718202无菌度是是是是是是使用knauer自动渗透压计设备确定重量摩尔渗透压浓度。使用bohlingemini150流变仪在0.5pa的应力和在25℃确定粘度。实施例2粘膜粘着性能的确定粘膜粘着可以定义为这样的状态：其中借助于界面力将两种物质长时间维持在一起，其中至少一种物质是生物衬底(substrate)诸如粘蛋白。人体的粘膜(包括鼻、眼、口腔、阴道和直肠膜)以其表面被粘液覆盖的上皮层为特征。所述粘液含有糖蛋白，其中最重要的是粘蛋白。粘蛋白通过建立与在粘膜粘着制剂中所含的大分子的相互作用而参与粘着机制。基于粘度的测量的流变学试验是用于测量制剂-粘蛋白相互作用的简单体外方法。从这样的试验，可能如下获得粘膜附着力：监测由待测制剂和粘蛋白的混合物构成的系统的粘度测定变化，并与分别仅由制剂和粘蛋白构成的系统的总和对比(hassan,e.e.,gallo,j.m.,“asimplerheologicalmethodfortheinvitroassessmentofmucin-polymerbioadhesivebondstrength”,pharm.res.,第7卷,第5期,第491-495页,1990)。将胃猪粘蛋白(ii型)(sigma-aldrich,米兰,意大利)在4％w/w和8％w/w悬浮于含有6.8g/lnacl、2.2g/lnahco3、0.084g/lcacl22h2o、1.4g/lkcl的模拟泪液中，并用hcl1n调至ph7.4。借助于配有锥板组合(cp1/60)的旋转流变仪(rheostress600,haake,enco,意大利)进行粘度测量。用本发明的眼科溶液1、2和4进行试验。对于每个流变学试验，制备和试验以下样品：-在模拟泪液中的4％w/w的粘蛋白分散体(样品a)；-以1:1重量比与模拟泪液混合的本发明的眼科溶液(样品b)；-以1:1重量比与模拟泪液中的8％粘蛋白分散体混合的本发明的眼科溶液(样品c)。对每个样品进行在32℃的粘度测量。如下在剪切速率范围(10-1001/s)内借助于生物粘着粘度组分δη定量粘蛋白和本发明的组合物之间的相互作用：δη＝ηc-(ηb+ηa)其中：ηc是样品c的粘度(pa.s)；ηb是样品b的粘度(pa.s)，ηa是样品a的粘度(pa.s)，且δη是生物粘着粘度组分。本发明的组合物与粘蛋白的混合物(样品c)的粘度相对于单独的本发明的组合物(样品b)和粘蛋白(样品a)溶液的粘度的总和的增加显示正生物粘着粘度组分(δη>0)，且因此显示所述组合物的正粘膜粘着性能。正生物粘着粘度组分代表混合物粘度的增长，其发生在本发明的组合物与粘蛋白分散体混合时，且其取决于大分子物质的链之间的相互作用。换而言之，组分δη的高于0的值代表，相对于在分别采取的粘蛋白和本发明的组合物提供的粘度贡献的简单累加的基础上预见到的值，粘蛋白与本发明的组合物的相互作用对粘度的额外贡献。在不同的剪切速率用本发明的眼科溶液1、2和4进行的每个流变学试验的结果总结在下表3中。表3sd:标准差实施例3用于研究眼不适症状的体外模型通过两种不同的体外模型描述了由透明质酸钠和糖原的组合提供的对治疗有效性的协同效应：用于研究干眼症状的模型，和用于研究表面上皮损伤的模型。第一种模型是3d人角膜干度和高摩尔渗透压浓度(hyper-osmolarity)模型。监测的参数证实了透明质酸钠和糖原在降低炎症参数中和在保护眼睛免于过度基质降解中的协同效应。用于研究表面上皮损伤的模型是用于监测人角膜上皮对机械损伤的应答的体外模型。使用该模型证实本发明的组合在促进表面上皮损伤以后的角膜重新上皮形成中的协同效应。两种模型都采用3d重构的人角膜上皮(hce)，其由laboratories(尼斯,法国)提供。hce是由永生化的hce细胞组成的模型，所述永生化的hce细胞具有与人角膜上皮类似的整体形态(overallmorphology)。实施例3.1用于研究干眼症状的模型在该实施例中，已经使用hce来建立人角膜干度和高摩尔渗透压浓度的模型(hyp-dryhce)。将hce组织置于受控环境条件(<40％相对湿度，t°>37℃，有0.6m山梨醇存在于介质中)下以模仿干度16h。在应激阶段结束时，将样品用产品(30μl)处理24h，并针对不同参数(mrna表达、组织学和超结构分析)研究组织。用本发明的眼科溶液1和比较眼科溶液5和6进行试验。实施例3.1a-转录分析已经通过转录分析(实时pcr)分析了从hce提取的总mrna，以定量基质金属肽酶(matrixmetallopeptidase)-9(mmp-9)和整联蛋白-β1(itg-β1)的表达。mmp-9是在眼睛表面上存在的最重要的明胶酶。该酶裂解多种不同的底物，包括角膜上皮基膜的组分和维持角膜上皮屏障功能的紧密连接蛋白。在具有干眼的患者的泪液中产生(dosed)高水平的mmp-9。泪液mmp-9活性水平与角膜疾病的严重程度正相关。增加的mmp-9表达与增加的眼睛表面炎症相关。itg-β1是整联蛋白的大家族的一个成员。整联蛋白是免疫细胞向具有干眼的患者的眼睛表面迁移和活化的关键组分。已经证实，itg-β1可以充当炎症性障碍的治疗靶标。α4β1-整联蛋白拮抗剂的局部应用会导致疾病减轻；α4β1的阻断会减轻干眼症状和炎症。itg-β1的增加是干眼症状和炎症的信号，其指示免疫细胞向眼睛表面的活化。在下表4中所示的结果表达为相对定量(rq)，其指示相对于校准物(未治疗的hce组织)的表达的倍数变化。表4mmp-9itg-β1hce11hyp-dryhce2.82*5.39*溶液12.08*4.8*溶液52.71*11.37*溶液62.40*6.28**该值被认为相对于未治疗的hce(rq＝1)上调(当rq>2时)或下调(当rq<0.5时)结果清楚地表明，对比溶液5没有相对于hyp-dryhce改变mmp-9的水平(2.71相对于2.82)，且对比溶液6仅能够相对于hyp-dryhce轻微降低mmp-9的水平(2.4相对于2.82)，而本发明的溶液1诱导最高的mmp-9表达减少，从而指示保护免于过度基质降解(2.08相对于2.82)。结果进一步清楚地表明，与阳性对照(hyp-dryhce)相比，对比溶液5和6诱导itg-β1的过表达，而本发明的溶液1产生最低表达。itg-β1的减少是减轻干眼症状和炎症的积极信号。实施例3.1b-超结构分析使用扫描电子显微术(sem)进行超结构分析。用semzeisssigma电子显微镜观察样品。已经进行了2000倍的放大率。归因于角膜上皮的评分是基于角膜光滑度的特性评估：0(标准:最光滑的表面)，1(轻微)，2(强烈)和3(严重：表面褶皱)。结果总结在下表5和图1中。表5sem评分hce0hyp-dryhce3溶液11溶液50/1溶液61实施例3.2用于研究表面上皮损伤的模型在该实施例中，已经使用hce建立人角膜伤口愈合的模型。用在上皮表面上的4个对称损伤来损伤hce，且在损伤以后1小时，已经将组织用产品(30μl)处理24h和72h。在处理结束时，针对不同的参数(mrna表达、免疫荧光、组织学和超结构分析)研究组织。用本发明的眼科溶液1和比较眼科溶液5和6进行试验。实施例3.2a-转录分析已经通过转录分析(实时pcr)分析了从hce提取的总mrna，以定量基质金属肽酶-1(mmp-1)的表达。基质金属蛋白酶(matrixmetalloproteinases)(mmp)是一组锌依赖性的蛋白水解酶，其底物包括细胞外基质和基膜的大多数组分。在损伤以后，且响应于细胞因子的释放，角膜中的几种mmp通过转录或活化而上调。mmp-1是上皮迁移的关键介质。离体创伤的人角膜组织的研究证实了在间质上表皮细胞再生过程中mmp-1在先导角膜上皮细胞中的存在。在下表6中所示的结果表达为相对定量(rq)，从而指示所述表达相对于校准物(未治疗的hce组织)的倍数变化。表6*该值被认为相对于未治疗的hce(rq＝1)上调(当rq>2时)或下调(当rq<0.5时)在受伤的组织中，证实mmp-1在24h上调，从而证实细胞对表皮细胞再生和基质改造的第一积极反应。溶液5和6强烈地降低在24h的mmp-1的水平，从而指示减少的表皮细胞再生过程和基质改造。由本发明的溶液1促进的较高mmp-1水平是表皮细胞再生和基质改造的积极迹象。实施例3.2b-组织学分析在暴露结束时，将组织固定在缓冲的10％福尔马林中并包括在石蜡块中以便获得5μm的切片。将切片用苏木精和曙红染色，并在光学显微术(20倍)下分析。评估愈合的进展以对比对照组织中的愈合状态。已经将它用于基于愈合速率(好>中等>差)的分类。结果总结在下表7和图2中。表7愈合速率hce-受伤的hce差溶液1好溶液5中等溶液6中等实施例3.2c-超结构分析使用扫描电子显微术(sem)进行超结构分析。用semzeisssigma电子显微镜观察样品。已经进行了2000倍的放大率。归因于创伤角膜上皮的评分是基于迁移上皮细胞的特征性变化：0(标准：创伤表面不存在)，1(角膜上皮细胞层维持和再生)，2(不完全再生)和3(表皮细胞再生不存在)。结果总结在下表8和图3中。表8sem评分hce-受伤的hce2-3溶液11溶液53溶液61当前第1页12