糖原基阳离子聚合物的制作方法
本申请是申请日为2013年02月21日、申请号为201380007182.9、发明名称为“糖原基阳离子聚合物”的中国专利申请的分案申请。
本发明涉及糖原基阳离子聚合物、包括所述聚合物和至少一种阴离子化合物的复合物、和所述复合物用于传递阴离子化合物的用途。
特别地，糖原基阳离子聚合物用作非病毒的载体，用于核酸的转染。
现有技术
为了减少有效成分的副作用并使它们的治疗效果最佳化，开发了控制释放系统，其中药物的形式控制了有效成分的释放阶段，并且系统还能够将有效成分传递并指向特定的药理学目标。
特别地，传递和指向系统必须以以下的方式来与有效成分产生交互作用：获得的复合物在储存和给药期间是稳定的，但将有效成分释放至正确的药理学目标。
典型地，在传递系统和有效成分之间形成的交互作用是非共价的，例如：静电的、离子的或范德华交互作用、氢键等。
针对低分子量有效成分，和部分针对聚合物和高分子量分子，例如核酸，解决了开发传递和指向系统的问题。
特别地，在基因治疗领域，通过术语"转染"表达的是：为了补偿缺乏基因，过表达基因、沉默(silencing)基因表达或向所述细胞引入新的功能的目的，核酸序列和/或遗传构造向靶细胞插入的自发过程。
在遗传性疾病的治疗以及在慢性疾病的治疗和防治用策略的开发两者中，这个过程似乎是有前途的。
然而，当以天然形式体内给药时，核酸，很像其它的聚阴离子物质，迅速地被阳离子酶(例如核酸酶和蛋白酶)分解，并有节制地被细胞吸收。
迄今已经研究和开发的基因载体包括病毒系统(逆转录酶病毒、腺病毒等)和非病毒系统(脂质体、聚合物、肽等)。
众所周知的是：病毒载体与非病毒系统相比具有更高的转染效率。然而，在体内使用病毒载体受到很多缺点的限制，例如复制的危险、诱导免疫反应的可能性、只有再分细胞可有效地作为目标的事实、大尺寸基因低的装载量或dna片段的随机插入。
在本领域已知的是：使用基于非病毒载体的基因治疗，包括许多益处，其中有相对的安全性和低的制备成本。
已经广泛研究了非病毒的基因载体，例如阳离子聚合物、脂质体和合成载体，作为使用病毒载体的替代。
n,n-二乙基氨基乙基-葡聚糖(deae-葡聚糖)，是要用于有效成分受控释放的天然聚合物的第一化学衍生物的一种(例如用于向粘膜中的受控释放，如，例如在wo90/09780中描述的)，并且接着作为转染试剂(如，例如在ep1738769中描述的)。
deae-葡聚糖是聚阳离子聚合物，通过n,n-二乙基氨基乙基氯化物和葡聚糖反应获得，葡聚糖是其中葡萄糖单体通过α-1,6键键合的线性聚合物，具有很少的支链，其中葡萄糖单体是通过α-1,4-键键合的(编号示于下面的式子中)。
由下列结构式表示的deae-葡聚糖，具有两个包括含氮残基的取代基，其中氮原子具有彼此不同的物理化学特性：
第一取代基包括叔胺官能(表示为n')，具有约9.5的pka，其在生理学ph下处于离子化形式。第二取代基，被称为"串联的(tandem)"，包括季铵基(n+)，其具有永久的正电荷并影响第二叔胺官能团(表示为n”)，其具有约5.7的pka的酸性，然后在生理学ph下，处于非离子化的形式(f.gubensek,journalofmacromolecularscience:parta-chemistry-2(5)1968,1045-1054)。
然而，已知的是：deae-葡聚糖在体内的正电荷，对除了核酸外的阴离子生物学结构有影响，导致毒性现象。
通常，在阳离子聚合物和核酸之间形成复合物且随后传递的机理，可以概述如下。
遗传物质被阳离子聚合物通过弱相互作用复合，例如静电相互作用。该复合物的形成，保护核酸免受核酸酶降解，并能够使核酸传递入细胞中，因为在复合物表面存在的正电荷对细胞膜有影响，通过核内体的形成，刺激复合物的细胞内吞作用。
核内体的内部具有约4.5-5的ph，它与细胞质介质的ph(它是约7.3)相比是更酸性的。由存在于核内体薄膜上的atp-依赖的质子泵来维持这个在ph中的差异，它将h+离子从细胞液推入核内体。酸性ph促进溶酶体核酸酶的活性，它是通过在核苷酸亚基之间的磷酸二酯键的水解来负责核酸降解的酶。
具有缓冲能力的聚合物，抑制溶酶体核酸酶的活性，且同时改变核内体的摩尔渗透压浓度。
实际上，当聚合物螯合h+离子时，细胞液需要其它的h+离子，同时有cl-以保持核内体的电中性。然而，对h+和cl-离子的需要，结果导致核内体内部离子浓度的增加，伴随着核内体相对于细胞液的摩尔渗透压浓度的后续增加。摩尔渗透压浓度的增加向细胞液索要水。从而，核内体溶胀直至破裂，将聚合物-核酸复合物释放进细胞质中。
这个机理，被称作"质子海绵机理"，关于聚乙烯亚胺(pei)聚合物，特别被j-p.behr描述在"theprotonsponge:atricktoentercellsthevirusesdidnotexploit"(chimia,1997,51,34-36)中，更普遍地被h.eliyahu等描述在"polymersfordnadelivery"(molecules,2005,10,34-64)中。
聚乙烯亚胺(pei)是线性或支链阳离子聚合物，特征在于高效地将低聚核苷酸和质粒释放进细胞中，在体外，如例如由o.boussif等在"aversatilevectorforgeneandoligonucleotidetransferintocellsincultureandinvivo:polyethylenimine"(proc.natl.acad.sci.usa,1995,vol.92,7297-7301)中和国际专利申请wo02/100435中描述的。pei被称作具有高电荷密度的聚合物，它保护核酸免受核酸酶的降解。人们认为：pei的高缓冲能力，保护核酸在细胞摄取(uptake)阶段期间在核内体中免受降解，通过诱导核内体的渗透膨胀("质子海绵"机理)，使得载体-核酸复合物能够被释放进细胞质中。
已经作为转染试剂广泛研究的另外的聚合物，是聚(l-赖氨酸)(pll)，它例如已经描述在国际专利申请wo03/063827中，其特点在于在生理学ph下被离子化的伯胺基，伯胺基对核酸的磷酸根基团(其是带负电荷的)有影响。然而，pll的毒性和转染效力与它们的分子量成正比：一方面，随着聚合物分子量的增加，观察到增加的转染效率，另一方面，观察到增加的细胞毒性。另外，pll的主链在生理条件下几乎不降解，它的积聚从长远来看可导致有毒的后果。
就大多数阳离子聚合物而论，pll与核酸的复合物也具有物理化学的缺点。例如，制备过程提供少的尺寸控制能力，这可能导致大颗粒的存在，大颗粒具有有限的扩散容量和/或在配制或给药阶段期间沉降的可能性。另外，看起来：pll的酸碱特性使得不可能获得高的转染能力，或许是因为有限的将核酸释放进入细胞质介质的能力。
其它的阳离子聚合物，天然的和合成的两种，都已经在现有技术中被描述为核酸的转染试剂。
例如，国际专利申请wo03/078576描述了壳聚糖作为核酸的转染试剂。
壳聚糖是天然的线性聚合物，由在聚合物中随机分布的d-葡聚糖和n-乙酰-d-葡聚糖单元组成，通过β-1,4键连接并包括具有约6.5pka的胺基。
作为核酸的转染试剂，针对包括正离子化基团的树枝状大分子已经进行了广泛的研究，例如聚(酰胺胺)(pamam)结构，线性结构的大分子；甲基丙烯酸聚合物(例如甲基丙烯酸n,n-二甲氨基乙酯，dmaema)、聚(乙烯亚胺)(pei)和这些聚合物的带有增溶性、功能性或定向性取代基的衍生物，例如含有聚(乙二醇)(peg)的聚合物结构。
例如描述在国际专利申请wo97/25067中的线性聚(酰胺胺)(pamam)，是水溶性聚合物，它允许形成可溶的和/或可分散的复合物。优选地，这些聚合物的阳离子基团的pka值应保持在7和8之间，因为已知的是：更低的pka值会降低核酸装载的能力。此外，由基于pamam和核酸的树枝状大分子通过核内体形成的复合物的释放，涉及"质子-海绵"效应。具体地说，c.l.waite等在"acetylationofpamamdendrimersforcellulardeliveryofsirna"(bmcbiotechnology,2009,9:38)描述了：伯胺残基的部分乙酰化，降低pamam基树枝状大分子的缓冲能力和sirna的释放。
为了除了核酸用转染试剂外的用途，也已经开发了阳离子聚合物。
例如，在pals等(colloidsandsurfacesa:physicochem.eng.aspects289,2006,pages193-199)文章的2.2段，公开了糖原如何被阳离子化，通过在多糖糖原的主链上引入阳离子单体n-(3-氯-2-羟基丙基)-三甲基氯化铵。发现所述阳离子聚合物作为铁矿悬浮液中的絮凝剂是有效的。
已知的是：理想的转染试剂应确保高的转染容量，没有它就必须要操纵生理学的目标；它在有效剂量下不应是有毒的，并且应是可生物降解的，使得可避免任何长期的副作用。
另外，转染试剂应该是聚合物，它应该形成小于1微米(即，小于10-6m)的颗粒，优选形成纳米颗粒，因为已知的是：尺寸可以限制复合物在细胞外介质中的扩散能力和在细胞中的细胞内吞作用/吞噬作用两者。
最后，聚合物的结构应包括特征在于不同pka值的胺基和/或氮原子。事实上，具有比生理学ph值更高pka的胺基，促进核酸在生理学ph下的复合；具有大约核内体ph值的pka值的胺基，使"质子-海绵"机理活化，并确保聚合物-核酸复合物向细胞质中的释放；最后，季铵基确保与ph值无关的、从核内体的复合和释放。
技术实现要素：
申请人已经解决了如下问题：开发可以用于传递低分子量有效成分并作为核酸非病毒载体两者的新聚合物，并且它可以克服现有技术中已知材料的缺点。
令人惊讶的是，申请人现在已经发现：糖原可以被改性，以获得新阳离子衍生物。
有利的是，所述糖原的新阳离子衍生物的特征在于低的细胞毒性。
申请人相信这主要是由于两个原因。第一，糖原是生物相容的聚合物，它是糖在所有动物体内新陈代谢和储存的产物，在那里它被连续地制造并降解。另外，申请人相信：在糖原中许多的支链，赋予稳定的球形结构，它能够选择性减少对阳离子电荷的接触：可溶解的分子可以扩散到聚合物结构内部，并通过阳离子位点进行复合，然而相反，由于空间的原因，与更复杂结构的相互作用将不会被允许。这个球形结构将使得减少阳离子电荷的毒性成为可能，该毒性一般损害细胞膜。
申请人已经发现：该糖原的新阳离子衍生物，保持了它们衍生自的天然聚合物的生物相容性特性。
申请人还发现了：这些糖原的新阳离子衍生物能够与具有宽范围内的尺寸和分子量的阴离子化合物形成复合物。
有利的是，所述复合物具有纳米尺寸，并且当它们处于溶液中时不表现任何的聚集，即使在高浓度下也如此。
申请人已经发现：该糖原的新阳离子衍生物可以将阴离子化合物传递给特定的生理学目标(例如：器官、组织和细胞)。
申请人还已经发现：根据本发明的糖原的阳离子衍生物，能够渗透进入细胞中。
从而，所述糖原的新阳离子衍生物可用于将阴离子化合物传递进细胞中。
最后，申请人已经发现：根据本发明的糖原的阳离子衍生物可以用作蛋白质和酶保存中的稳定剂，和用作疫苗制造中的辅助剂。
有利的是，该糖原的新阳离子衍生物包括携带(bearing)胺基的取代基，其特征在于pka值彼此不同，使得促进阴离子化合物的复合和聚合物-阴离子化合物复合物从核内体向细胞质的释放两者。
有利的是，根据本发明的糖原的新阳离子衍生物具有低的粘度，从而可以被配置在注射使用的药物组合物中。
在第一方面，本发明因而涉及基于改性糖原的新阳离子聚合物，本发明特别涉及基于糖原的阳离子聚合物，其包括至少一个选自如下组成的组的重复单元：
(a)
其中
基团r可以是相同或不同的，是氢原子；羧甲基，任选以与药学上可接受的有机或无机碱形成的盐的形式；或选自以下的含氮基团：nh2-(c1-c6)烷基、[n,n-二(c1-c6)烷基氨基]-(c1-c6)烷基、nh2-{[(c1-c6)烷基]-二(c1-c6)烷基铵基}-(c1-c6)烷基、{[n,n-二(c1-c6)烷基氨基]-(c1-c6)烷基-二(c1-c6)烷基铵基}-(c1-c6)烷基、nh2-[(c1-c6)烷基氨基]-(c1-c6)烷基、{[n,n-二(c1-c6)烷基氨基]-(c1-c6)烷基氨基}-(c1-c6)烷基、[三(c1-c6)烷基铵基]-(c1-c6)烷基、含氮环基-(c1-c6)烷基，其中链(c1-c6)烷基可以是相同或不同的，任选地用一个或多个羟基取代；和
n是大于或等于1的整数；和
(b)
其中
r1选自：氢原子；羧甲基，任选以与药学上可接受的有机或无机碱形成的盐的形式；或选自以下的含氮基团：nh2-(c1-c6)烷基、[n,n-二(c1-c6)烷基氨基]-(c1-c6)烷基、nh2-{[(c1-c6)烷基]-二(c1-c6)烷基铵基}-(c1-c6)烷基、{[n,n-二(c1-c6)烷基氨基]-(c1-c6)烷基-二(c1-c6)烷基铵基}-(c1-c6)烷基、nh2-[(c1-c6)烷基氨基]-(c1-c6)烷基、{[n,n-二(c1-c6)烷基氨基]-(c1-c6)烷基氨基}-(c1-c6)烷基、[三(c1-c6)烷基铵基]-(c1-c6)烷基，其中链(c1-c6)烷基可以是相同或不同的，任选地用一个或多个羟基取代；
x1和x2可以是相同或不同的，是基团-oh或含有氮的基团-nhr2，其中r2选自：氢原子、(c1-c6)烷基和h-[nh-(c1-c6)烷基]p-，其中p是大于或等于1的整数，且基团(c1-c6)烷基可以相同或不同；和
m是大于或等于1的整数；
条件是：r、r1、x1和x2中至少一个是如分别对各个r、r1、x1和x2限定的含氮基团，且
条件是：所述糖原基阳离子聚合物不同于由糖原与n-(3-氯-2-羟基丙基)-三甲基氯化铵反应而获得的产物。
上述的表述"条件是r、r1、x1和x2中至少一个是如分别对各个r、r1、x1和x2限定的含氮基团"意指：在r是含氮基团的情况下，这个基团如在r中所定义的；在r1是含氮基团的情况下，这个基团如在r1中所定义的；在x1是含氮基团的情况下，这个基团是如在x1中所定义的；并且，在x2是含氮基团的情况下，这个基团如在x2中所定义的。
在第二方面，本发明涉及在糖原基阳离子聚合物和阴离子化合物之间形成的复合物。
根据优选实施方案，所述阴离子化合物是有效成分。有利的是，所述阴离子化合物是核酸。
在第三方面，本发明涉及药物组合物，其包括在糖原基阳离子聚合物和阴离子化合物之间形成的复合物以及至少一种药学上可接受的赋形剂。
在第四方面，本发明涉及在糖原基阳离子聚合物和阴离子化合物之间形成的复合物的用途，用于将所述阴离子化合物传递或转染至特定的药理学目标中，例如器官、组织或细胞。
根据一个优选实施方案，所述阴离子化合物是有效成分。有利的是，所述阴离子化合物是核酸。
附图简要说明
附图的简要说明
图1至8表示按照凝胶电泳获得的八种琼脂糖凝胶剂，如在实施例5中描述的。在所有的图1至8中，接种sirna(*)和dna(*)标记物，以获得相应的谱带(bands)，用于比较的目的并核对电泳法的功能(functioning)。
图1表示琼脂糖凝胶，在其上接种在根据本发明的聚合物3和在各个浓度(从0.5重量％至8重量％)下的sirna之间获得的复合物。不含核酸(0％)的聚合物3被用作比较，以核对根据本发明的阳离子聚合物不会妨碍关于sirna的斑点的检测。
图2表示琼脂糖凝胶，在其上接种了：
-在根据本发明的聚合物3和在从10重量％至20重量％的浓度下的sirna之间获得的复合物；
-不含核酸(0％)的聚合物3，作为比较，以核对根据本发明的阳离子聚合物不会妨碍关于sirna的斑点的检测；和
-聚合物50(未改性的polglumyttm糖原)，作为比较，以核对未根据本发明改性的糖原不能复合核酸。
图3表示琼脂糖凝胶，在其上接种在根据本发明的聚合物3和在各个浓度(从30重量％至800重量％)下的sirna之间获得的复合物。
图4表示琼脂糖凝胶，在其上接种了在根据本发明的聚合物1、2和6与在相对于每个聚合物总重量为5重量％至20重量％的sirna之间获得的复合物。
图5表示琼脂糖凝胶，在其上接种了在根据本发明的聚合物10、14和15与在相对于每种聚合物总重量为5重量％和20重量％的sirna之间获得的复合物。
图6表示琼脂糖凝胶，在其上接种了在根据本发明的聚合物8、12和16与在相对于每种聚合物总重量为5重量％和20重量％的sirna之间获得的复合物。
图7表示琼脂糖凝胶，在其上接种了在根据本发明的聚合物21、24和25与在相对于每种聚合物总重量为5重量％和20重量％的sirna之间获得的复合物。
图8表示琼脂糖凝胶，在其上接种了在根据本发明的聚合物20、23和28与在相对于每种聚合物总重量为5重量％和20重量％的sirna之间获得的复合物。
图9表示如在实施例8中描述而获得的根据本发明的聚合物2、3和4用的滴定曲线。
图10表示如在实施例8中描述而获得的聚合物4(根据本发明)和18(比较的)用的滴定曲线。
本发明详细说明
在本说明书和随后的权利要求书中，措词"阳离子聚合物"表示在生理学ph下具有总体正电荷的聚合物。
在本说明书和随后的权利要求书中，术语"糖原"通常是指其特征在于高支化度的葡萄糖均聚物，其中葡萄糖单体在直链中通过α-(1,4)键的方式键接，而支链通过α-(1,6)键的方式接枝，通常但不限于：每7-11个葡萄糖单体如下式中所示：
为了本说明书和随后的权利要求书的目的，措辞"糖原基"用来表示：聚合物包括如上所述的糖原结构，其被部分改性以获得按照本发明的阳离子聚合物。
为了本说明书和随后的权利要求书的目的，措辞"重复单元"标识在按照本发明的阳离子聚合物中出现至少一次的单体。
为了本说明书和随后的权利要求书的目的，措辞"(c1-c6)烷基"表示含有1至6个碳原子的线性或支链烷基，例如甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、仲戊基、3-戊基、异戊基、新戊基、正己基、仲己基或新己基。
为了本说明书和随后的权利要求书的目的，术语"含氮环基"表示3-至7-元芳族或脂族杂环，含有至少一个n原子，例如氮丙啶、吡咯、吡咯啉、吡咯烷、吡啶或哌啶。任选地，上述杂环可以包括至少一个选自n、o和s的第二杂原子，例如噻唑、噁嗪或噻嗪。
为了本说明书和随后的权利要求书的目的，术语"复合物"表示：根据本发明的糖原基阳离子聚合物与至少一种阴离子化合物，通过非-共价相互作用(例如静电的、离子的或范德华交互作用、氢键等)的交互作用获得的产物。
为了本说明书和随后的权利要求书的目的，措词"有效成分"包括天然的、半合成的或合成的分子，其在给药后能够与细胞或活的有机体交互作用，并且有改进所述生物机能的可能。因此，按照本发明有用的有效成分，是带有整体负电荷的分子，即：阴离子分子，其可以用于病理状态的治疗、预防或诊断。所述阴离子分子可以是有机的或无机的。例如，它们可以是有机阴离子分子，并可以具有低分子量(例如氨基酸、磺酰胺或维生素)或高分子量(例如疫苗或葡糖胺聚糖，例如肝素)。
为了本说明书和随后的权利要求书的目的，术语"核酸"表示天然或合成来源的核苷酸大分子，其是双链或单链的，并且其具有整体负电荷。特别地，这个术语包括低聚核苷酸、rna(sirna、dsrna、ssrna、shrna、mirna、rrna、hnrna、mrna、trna、snrna、前信使rna、催化rna、反义rna)、dna(cdna、mtdna、ssdna、dsdna、反义dna、质粒dna)。
为了本说明书和随后的权利要求书的目的，措词"递送有效成分"和"传递有效成分"表示：将复合至根据本发明的阳离子聚合物的有效成分，传输到特定的生理学目标，例如组织或器官。
为了本说明书和随后的权利要求书的目的，术语"转染"表示：将核酸序列引入细胞中，特别是引入到细胞质和/或核中。
特别地，本发明涉及糖原基阳离子聚合物，包括至少一种选自如下组成的组的重复单元：
(a)
其中
基团r可以是相同或不同的，是：氢原子；羧甲基，任选以与药学上可接受的有机或无机碱形成的盐的形式；或含氮的基团，选自nh2-(c1-c6)烷基、[n,n-二(c1-c6)烷基氨基]-(c1-c6)烷基、nh2-[(c1-c6)烷基-二(c1-c6)烷基铵基]-(c1-c6)烷基、{[n,n-二(c1-c6)烷基氨基]-(c1-c6)烷基-二(c1-c6)烷基铵基}-(c1-c6)烷基、nh2-[(c1-c6)烷基氨基]-(c1-c6)烷基、{[n,n-二(c1-c6)烷基氨基]-(c1-c6)烷基氨基}-(c1-c6)烷基、[三(c1-c6)烷基铵基]-(c1-c6)烷基、含氮环基-(c1-c6)烷基，其中链(c1-c6)烷基可以是相同或不同的，任选地用一个或多个羟基取代；和
n是大于或等于1的整数；和
(b)
其中
r1选自：氢原子；羧甲基，任选以与药学上可接受的有机或无机碱形成的盐的形式；或含氮的基团，选自nh2-(c1-c6)烷基、[n,n-二(c1-c6)烷基氨基]-(c1-c6)烷基、nh2-[(c1-c6)烷基-二(c1-c6)烷基铵基]-(c1-c6)烷基、{[n,n-二(c1-c6)烷基氨基]-(c1-c6)烷基-二(c1-c6)烷基铵基}-(c1-c6)烷基、nh2-[(c1-c6)烷基氨基]-(c1-c6)烷基、{[n,n-二(c1-c6)烷基氨基]-(c1-c6)烷基氨基}-(c1-c6)烷基、[三(c1-c6)烷基铵基]-(c1-c6)烷基，其中链(c1-c6)烷基可以是相同或不同的，任选地用一个或多个羟基取代；
x1和x2可以是相同或不同的，是基团-oh或含有氮的基团-nhr2，其中r2选自：氢原子、(c1-c6)烷基和h-[nh-(c1-c6)烷基]p-，其中p是大于或等于1的整数，且基团(c1-c6)烷基可以相同或不同；和
m是大于或等于1的整数；
条件是：r、r1、x1和x2中至少一个是如分别对各个r、r1、x1和x2限定的含氮基团，和
条件是：所述糖原基阳离子聚合物不同于由糖原与n-(3-氯-2-羟基丙基)-三甲基氯化铵反应而获得的产物，特别是如在pals等的文章(colloidsandsurfacesa:physicochem.eng.aspects289,2006,第193-199页)的2.2段公开的。
优选地，基团r可以是相同或不同的，是氢原子；羧甲基，任选以与药学上可接受的有机或无机碱形成的盐的形式；或选自以下的含氮基团：[n,n-二(c1-c3)烷基氨基]-(c1-c3)烷基、{[n,n-二(c1-c3)烷基氨基]-(c1-c3)烷基-二(c1-c3)烷基铵基}-(c1-c3)烷基、{[n,n-二(c1-c3)烷基氨基]-(c1-c3)烷基氨基}-(c1-c3)烷基或[三(c1-c3)烷基铵基]-(c1-c3)烷基、含氮环基-(c1-c3)烷基，其中链(c1-c3)烷基可以是相同或不同的，任选地用一个羟基取代。
优选地，由术语"含氮环基"表示的含有至少一个n原子的杂环是5-或6-元芳族或脂族杂环，例如吡咯、吡咯啉、吡咯烷、吡啶或哌啶。有利的是，所述5-或6-元杂环包括选自n、o和s的至少一种第二杂原子，并且例如由二唑、噁嗪和噻嗪代表。优选地，所述杂环是脂族的。更优选地，所述杂环是吗啉或哌啶。
更优选地，基团r可以是相同或不同的，是氢原子；羧甲基，任选以与药学上可接受的有机或无机碱形成的盐的形式；或选自以下的含氮基团：n,n-二甲基氨基乙基、n,n-二甲基氨基丙基、n,n-二乙基氨基乙基、[(n,n-二甲基氨基-乙基)二甲基铵基]乙基、[(n,n-二甲基氨基丙基)二甲基铵基]丙基、[(n,n-二乙基氨基-乙基)二乙基铵基]-乙基、[三甲基铵基]-2-羟基丙基、哌啶基-n-乙基或吗啉基-n-乙基。
优选地，r1是氢原子；羧甲基，任选以与药学上可接受的有机或无机碱形成的盐的形式；或选自以下的含氮基团：[n,n-二(c1-c3)烷基氨基]-(c1-c3)烷基、{[n,n-二(c1-c3)烷基氨基]-(c1-c3)烷基-二(c1-c3)烷基铵基}-(c1-c3)烷基、{[n,n-二(c1-c3)烷基氨基]-(c1-c3)烷基氨基}-(c1-c3)烷基或[三(c1-c3)烷基铵基]-(c1-c3)烷基，其中链(c1-c3)烷基可以是相同或不同的，任选地用一个羟基取代。
更优选地，r1是氢原子或羧甲基。
优选地，x1和x2可以是相同或不同的，是-nhr2基，其中r2是氢原子或h-[nh-(c1-c4)烷基]p-，其中p是大于或等于1的整数，且基团(c1-c4)烷基可以是相同或不同的。
优选地，所述基团h-[nh-(c1-c4)烷基]p-是：聚乙烯亚胺，具有50至3000道尔顿的分子量，更优选具有1000至2300道尔顿的分子量；精胺(h2n(ch2)3nh(ch2)4nh(ch2)3nh2)或亚精胺(h2n(ch2)4nh(ch2)4nh2)。
药学上可接受的有机碱的例子是氨丁三醇、赖氨酸、精氨酸、甘氨酸、丙氨酸、甲胺、二甲胺、三甲胺、乙胺、二乙胺、三乙胺、丙胺、二丙胺、三丙胺、乙二胺、单乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、胍、吗啉、哌啶、吡咯烷、哌嗪、1-丁基哌啶、1-乙基-2-甲基哌啶、n-甲基哌嗪、1,4-二甲基哌嗪、n-苄基苯乙胺、n-甲基葡糖胺和三(羟甲基)氨基甲烷。
药学上可接受的无机碱的例子是碱金属或碱土金属氢氧化物或碳酸盐，例如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙、碳酸钠、碳酸钾和碳酸钙。
有利的是，所述重复单元(a)和(b)在糖原链中随机分布。
重复单元(a)和(b)的例子分别列在下表a和b中。
表a–重复单元(a)的例子
表b–重复单元(b)的例子
根据优选实施方案，所述重复单元(a)和(b)包括：至少一个含有氮的基团，其是在生理学ph下是可离子化的，并且它促进所述阴离子化合物的复合；和至少一个含氮的基团，其是在低于生理学ph的ph下是可离子化的，并且它促进复合物从核内体的释放。
优选地，所述在生理学ph下可离子化的含氮基团以1％至30％的数值百分比存在，所述数值百分比是相对于在用于制备根据本发明的阳离子聚合物的糖原中的羟基总数的数值百分比。
优选地，所述在低于生理学ph的ph下可离子化的含氮基团以0.1％至10％的数值百分比存在，所述数值百分比是相对于在用于制备根据本发明的阳离子聚合物的糖原中的羟基总数的数值百分比。
为了本发明的目的，所述在生理学ph下可离子化的含氮基团，是nh2(c1-c6)烷基、[n,n-二(c1-c6)烷基氨基]-(c1-c6)烷基、nh2-[(c1-c6)烷基氨基]-(c1-c6)烷基、{[n,n-二(c1-c6)烷基氨基]-(c1-c6)烷基氨基}-(c1-c6)烷基和含氮环基-(c1-c6)烷基。
为了本发明的目的，所述在低于生理学ph的ph下可离子化的基团，是nh2-{[(c1-c3)烷基]-二(c1-c6)烷基铵基}-(c1-c6)烷基和{[n,n-二(c1-c6)烷基氨基]-(c1-c3)烷基-二(c1-c6)烷基铵基}-(c1-c6)烷基。
有利的是，根据本发明的糖原的新阳离子衍生物具有低的粘度，并且从而可以被配置在注射使用的药物组合物中。特别地，根据本发明的糖原的新阳离子衍生物，具有小于10mpa*s的粘度，优选小于5mpa*s，所述粘度是在pbs中1％的浓度下用转动流变仪测量的。
用于制备根据本发明的阳离子聚合物的糖原，可以按照本领域已知方法的一种来获得。
优选地，如在国际专利申请wo94/03502中描述的来制备糖原。
优选地，所述糖原是从贻贝(mytilusedulis)和紫贻贝(mytilusgalloprovincialis)物种获得的。
可以用于本发明目的的糖原的其它来源，包括：有壳的水生动物，例如蚝和履螺属(crepidula)fornicata；和脊椎动物的富糖原器官，例如肝脏和肌肉。
优选地，所述糖原基本上不含含有氮的化合物和还原糖。如在本说明书和随后的权利要求书中使用的，表述"基本上不含含有氮的化合物和还原糖"表示：氮含量小于60ppm，如通过kieldahl方法测量的；并且还原糖的含量小于0.25％，通过f.d.snell和snell("colorimetricmethodsofanalysis",newyork,1954,vol.iii,p.204)方法测量的。
优选地，根据本发明使用的糖原的特征还在于：碳含量从约44％至约45％，分子量约(2.5±0.1)×106道尔顿，且旋光度(α)d20是197±2.0(c＝1，在水中)。
更优选地，根据本发明使用的糖原是polglumyttm糖原，由aziendechimicheriuniteangelinifrancescoa.c.r.a.f.s.p.a制得。
本领域技术人员将容易理解：本发明本质上不致力于新种类的具有治疗效果的化合物。相反地，本发明涉及如前述的糖原基阳离子聚合物用于形成与至少一种阴离子化合物的复合物的用途。
在第二方面，本发明涉及在糖原基阳离子聚合物和阴离子化合物之间形成的复合物，其中所述糖原基阳离子聚合物包括至少一个选自由之前描述的(a)和(b)组成的组的重复单元。
优选地，所述的阴离子化合物是有机的或无机的，具有低分子量或高分子量。
更优选地，所述阴离子化合物是属于例如下列分类的有效成分：抗感染剂，例如抗生素和抗病毒剂；镇痛药；食欲抑制剂；抗蠕虫药；止喘药；抗惊厥药；抗抑郁药；抗糖尿病药；止泻剂；抗组胺剂；消炎药；抗偏头痛剂；抗恶心剂；抗肿瘤药；抗帕金森氏病药；抗痒疹剂；抗精神病药；解热药；镇痉药；抗胆碱能药；拟交感神经药；黄嘌呤衍生物；心血管系统用的药物，例如钾、钙通道阻滞剂、β阻滞剂、α阻滞剂和抗心律失常药；抗高血压药；利尿剂和制尿药；中央和周围血管扩张药；中枢神经系统兴奋剂；血管收缩剂；止咳药；减充血剂；激素；催眠药和镇静药；免疫抑制剂；肌肉松弛药；解副交感神经剂；精神兴奋剂；镇静剂；镇定剂。
根据优选实施方案，所述阴离子化合物是核酸。
优选地，所述核酸选自：低聚核苷酸、rna(sirna、dsrna、ssrna、shrna、mirna、rrna、hnrna、mrna、trna、snrna、前信使rna、催化rna、反义rna)和dna(cdna、mtdna、ssdna、dsdna、反义dna、质粒dna)。
本申请人注意到：所述复合物能够形成具有1和200nm之间、优选在20至100nm之间、并更优选30和50nm之间的平均直径(z)的纳米颗粒。
根据优选方案，所述复合物包括含量相对于所述糖原基阳离子聚合物重量在5重量％至60重量％之间的所述阴离子化合物。
优选地，所述复合物包括含量相对于所述糖原基阳离子聚合物重量在10重量％和50重量％之间的所述阴离子化合物。
更优选地，所述复合物包括含量相对于所述糖原基阳离子聚合物的重量在10重量％和30重量％之间的所述阴离子化合物。
在糖原基阳离子聚合物和阴离子化合物之间形成的复合物可有利地被制备为药物组合物。
在第三方面，本发明涉及包括在糖原基阳离子聚合物和阴离子化合物之间形成的复合物以及至少一种药学上可接受赋形剂的药物组合物，其中所述糖原基阳离子聚合物包括至少一个选自由之前描述的(a)和(b)组成的组的重复单元。
在一个优选实施方案中，所述阴离子化合物是核酸。
术语"赋形剂"意指本领域已知的适合于制备药物形式的任何试剂。
根据本发明适宜的赋形剂的例子是：防腐剂、稳定剂、表面活性剂、渗透压力调节盐、乳化剂、甜味剂、矫味剂、染料等等。
所述药物组合物可以根据本领域已知的方法制备在单位剂型中。
优选地，所述的药物组合物用于注射使用，例如水溶液、悬浮液或乳液，或者可以是要被重构用于制备静脉内、肌内、皮下、透皮或腹膜内给药用的水溶液、悬浮液或乳液的粉末形式。
或者，所述药物组合物例如可以是如下形式：口服用的片剂、胶囊、糖衣片剂、颗粒、溶液和糖浆；透皮给药用的加药硬膏剂、溶液、糊剂、乳膏剂或润发油；直肠给药用的栓剂；气溶胶给药用的无菌溶液；用于立即和持续释放的形式。
在第四方面，本发明涉及在糖原基阳离子聚合物和阴离子化合物之间形成的复合物的用途，用于将所述阴离子化合物传递或转输到特定的药理学目标，例如器官、组织或细胞，其中所述糖原基阳离子聚合物包括至少一个选自由之前描述的(a)和(b)组成的组的重复单元。
根据优选实施方案，所述阴离子化合物是有效成分。有利的是，所述阴离子化合物是核酸。有利的是，所述药理学目标是细胞。
在优选实施方案中，按照本发明的糖原基阳离子聚合物可以直接或通过间隔基被共轭到定向基团，它能够以高度特异的方式结合细胞表面上的目标，并且能够促进复合物被吸收进特定细胞(例如肿瘤细胞、肝细胞、造血细胞等)中。
定向基团也可以用于将阳离子聚合物定向到细胞小室(例如细胞核、线粒体等)。
定向基团例如可以选自叶酸、单糖、低聚糖、肽、蛋白质和透明质酸低聚物。
随后的实施例用于说明本发明，然而不以任何方式限定它。
实施例
实施例1
制备包括单元(a)的糖原基阳离子聚合物
(i)合成包括含氮基团的糖原基阳离子聚合物
在装备有磁力搅拌器和回流冷凝器的两颈圆底烧瓶中，将10gpolglumyttm糖原(61.73mmol的葡萄糖)溶解在124ml1n的naoh(合成产物1-7、9-11和13-15用的)或2n的naoh(合成产物8、12和16用的)。一旦溶解完全，将混合物加热到70℃，并搅拌2小时。
取决于需要的产物，以在表1中列的量(表示为mmol试剂)添加下列试剂(i)至(vi)的一种：
(i)2-氯-n,n-二乙基乙胺盐酸盐，；
(ii)3-氯-n,n-二甲基丙胺盐酸盐；
(iii)2-氯-n,n-二甲基乙胺盐酸盐；
(iv)3-氯-2-羟丙基三甲基氯化铵在水中60重量％的溶液；
(v)1-(2-氯乙基)哌啶；和
(vi)4-(2-氯乙基)吗啉。
将混合物在70℃下搅拌整夜。
次日，停止加热，并将混合物冷却至室温。然后将粗反应产物慢慢倒入400ml丙酮中。一旦完成添加，将获得的悬浮液搅拌约30分钟。在停止搅拌后，将混合物放置来沉积，直至上层清液分离，并获得沉淀物。
丢弃上层清液，并将获得的沉淀物用丙酮(200ml)洗涤两次。将由此获得的固体滤出，溶解在200ml蒸馏水中，用1n的hcl溶液调节到中性ph，最后在再生纤维素管(截止(cut-off)15000)中反蒸馏水进行透析，直至电导率为常数(等于约2-3μs)。将获得的溶液通过0.45μm过滤器过滤，在真空下浓缩，并最后冻干。
合成产率列于下表1中。
通过所述的方法，制备具有下述表2中所示结构的阳离子聚合物1-16和40-41。
在所示的结构中，缩略语"glu"表示：可以采用未改性葡萄糖的重复单元或者与按照本发明的重复单元延续的聚合物链。另外，为了便于可视化，未表示支链，并且只在位置6和不同重复单元上表示取代基。
本领域技术人员将容易理解：相同的重复单元可以包括1至3个取代基，其可以是相同或不同的，并且这些取代基可以独立地存在于位置2、3和/或6。
(ii)合成包括含氮基团和羧甲基的糖原基阳离子聚合物
如下所述地合成含有至少一个羧甲基的polglumyttm糖原(glycogen-cm)。
将预先在60℃烘箱中真空下干燥至恒重的无水polglumyttm糖原的9.57g(59.07mmol的葡萄糖)，放进装备有磁力搅拌器并处于氮气流下的两颈圆底烧瓶中，并溶解在200ml无水二甲基亚砜中。一旦溶解完成，以表3中所列的量加入氢化钠，并将混合物在室温下搅拌1小时。然后，以表3中所列的量加入氯乙酸钠，并将混合物在室温下搅拌整夜。
次日，将混合物慢慢倒入丙酮(800ml)中，并将获得的悬浮液搅拌约30分钟。将获得的固体滤出，用丙酮(400ml)冲洗两次，再次滤出，并溶解在蒸馏水(200ml)中。将获得的溶液在再生纤维素管(截止(cut-off)15000)中反蒸馏水进行透析，直至电导率为常数(等于约2-3μs)。将获得的溶液通过0.45μm过滤器过滤，在真空下浓缩，并最后冻干。
衍生化程度(dd)，被理解为是每100个葡萄糖单体中采用羧甲基衍生化的葡萄糖分子的数量，通过用含有已知滴定度的polglumyttm糖原和醋酸钠的混合物产生标准曲线，通过ir光谱确定。
表3
由此获得的糖原-cm被用于下列合成中，以获得包括氮基团的阳离子聚合物。
特别地，合成包括二乙基氨基乙基的糖原-cm(deae-糖原-cm)和2-羟基丙基三甲基铵的糖原-cm(2-oh-ptma-糖原-cm)。
deae-糖原-cm
在装备有磁力搅拌器和回流冷凝器的两颈圆底烧瓶中，将1g产物103溶解在10.8ml的1nnaoh中，并在70℃下加热2小时。
添加0.929g2-氯-n,n-二乙基乙基胺盐酸盐(5.4mmol)，并将混合物在70℃下搅拌整夜。
次日，停止加热，并将混合物冷却至室温。然后将粗反应产物慢慢倒入100ml丙酮中。在添加的结尾，将获得的悬浮液搅拌30分钟。
将由此获得的固体滤出，用丙酮(100ml)冲洗两次，溶解在50ml蒸馏水中，用1n的盐酸调节到6.5-7的ph，最后在再生纤维素管(截止(cut-off)15000)中反蒸馏水进行透析，直至电导率为常数(等于约2-3μs)。将获得的溶液通过0.45μm过滤器过滤，在真空下浓缩，并最后冻干。
2-oh-ptma-糖原-cm
在装备有磁力搅拌器和回流冷凝器的两颈圆底烧瓶中，将2.5g产物103溶解在27ml的1nnaoh中，并在70℃下加热2小时。
然后，加入3-氯-2-羟基丙基三甲基氯化铵溶液(在水中60重量％，＝8.1mmol)，并将混合物在70℃下搅拌整夜。
次日，停止加热，并将混合物冷却至室温。然后将粗的反应产物慢慢倒入80ml丙酮中。
将获得的固体滤出，用丙酮(80ml)冲洗两次，溶解在50ml蒸馏水中，随后在再生纤维素管(截止(cut-off)15000)中反蒸馏水进行透析，直至电导率为常数(等于约2-3μs)。将获得的溶液通过0.45μm过滤器过滤，在真空下浓缩，并最后冻干。
通过所述方法获得的阳离子聚合物17和19示于下表4中。
另外，为了便于可视化，未显示支链，并且只在位置6和不同重复单元上显示了取代基。在所示的结构中，缩略语"glu"表示：可以采用未改性葡萄糖的重复单元或者采用按照本发明的重复单元延续的聚合物链。
本领域技术人员将容易理解：相同的重复单元可以包括1至3个取代基，其可以是相同或不同的，并且这些取代基可以独立地存在于相同的重复单元的2、3和/或6位。
实施例2
制备包括单元(b)的糖原基阳离子聚合物
按照下面的方法，将polglumyttm糖原用高碘酸钾氧化。
在暗色玻璃瓶中，将20g的polglumyttm糖原(123.46mmol的葡萄糖)溶于400ml蒸馏水中。以表5中所示的量(用试剂的mmol表示)加入高碘酸钾，并将混合物在室温下搅拌30分钟。
通过加入过量的乙二醇(26ml)，在室温下持续搅拌2小时，将反应停止。
将获得的混合物在再生纤维素管(截止(cut-off)15000)中反蒸馏水进行透析，直至电导率为常数(等于约2-3μs)。然后，将混合物通过0.45μm过滤器过滤，并冻干。
然后，通过用0.1n的naoh滴定由盐酸羟胺和在各个碳水化合物上存在的自由醛基之间的反应释放的盐酸，来确定氧化程度(氧化的葡萄糖单体的％)。反应如下：
糖原-(ch＝o)z+z·h2n-oh*hcl＝糖原-(ch＝n-oh)z+z·h2o+z·hcl
通过下式确定氧化单体的百分比：
其中
v＝naoh的ml数
n＝naoh的当量浓度(normality)
w＝无水样品的mg数
162＝葡萄糖重复单元的分子量
表5
由此获得的氧化polglumyttm糖原与以下试剂(vii)至(x)之一反应，以在表6中给出的量(表示为试剂的mmol)：
(vii)精胺(fluka，参照号85590)；
(viii)四亚乙基五胺(fluka，参照号15652843)；
(ix)聚乙烯亚胺mw1300在水中50重量％的溶液(aldrich，参照号482595)；
(x)聚乙烯亚胺mw2000在水中50重量％的溶液(aldrich，参照号408700)。
按照以下一般的方法来合成衍生物。
在装备有机械搅拌器(ikalabortechnik型)的三颈圆底烧瓶中，将2g氧化polglumyttm糖原溶解在ph8.5下的200ml硼酸盐缓冲液中。将胺溶于40ml硼酸盐缓冲液中，慢慢加入反应烧瓶，并将混合物在室温下机械搅拌。
在4小时后，添加硼氢化钠(473mg；12.5mmol)，并将混合物在室温下机械搅拌整夜。
次日，将粗反应产物慢慢倒入400ml丙酮中，并将获得的悬浮液搅拌30分钟。将获得的固体滤出，用丙酮(400ml)冲洗两次，再次滤出，并溶解在蒸馏水(100ml)中。将溶液用1nhcl中和，并在再生纤维素管(截止(cut-off)15000)中反蒸馏水进行透析，直至电导率为常数(等于约2-3μs)。将获得的溶液获得通过0.45μm过滤器过滤，并最终冻干。
表6
通过所述方法获得的阳离子聚合物20-30示于下表7中。在所示的结构中，缩略语"glu"表示：可以使用未改性葡萄糖的重复单元或者使用按照本发明的重复单元延续的聚合物链。为了便于可视化，未显示支链，并且在不同的重复单元上显示取代基。
实施例3
确定含有(a)类重复单元的阳离子聚合物的衍生度(衍生程度)(dd)
相对于在含有重复单元(a)的聚合物中存在的含氮基团数量的衍生度，是通过将胺基转化成相应的盐酸盐并确定在胺基或季铵基上存在的卤素离子数来计算的。
将相同的过程应用于deae-葡聚糖盐酸盐(商业产品deae-葡聚糖盐酸盐，sigma，参照号d9885)，用作比较产品。
基于聚合物干重确定卤素离子数量，干重是通过减去由karlfischer方法确定的含水量获得的。
将1g胺衍生物溶于10ml蒸馏水中。一旦溶解完成，加入10ml1n的盐酸，并将混合物搅拌30分钟。一旦搅拌完成，将混合物注入丙酮中(100ml)。将获得的固体滤出，用丙酮(100ml)冲洗两次，并在60℃下烘箱中真空干燥。
卤素离子的量表示为重量百分数，即：如同每100g阳离子聚合物的卤素离子重量。
为了确定的目的，每个氮原子被认为是独立取代的。
按照如下给出的等式，计算衍生度。
dd＝衍生度
h.i.＝每100g含水样品的卤素离子克数
mw＝用单个烷基胺盐酸盐基取代的单体的分子量
35.45＝氯的分子量
获得的结果示于下表8中。
表8
(*)比较的：deae-葡聚糖
研究了衍生度和官能团的影响，作为两个操作参数的函数：(i)聚集的倾向，其必须被最小化；和(ii)装载容量，其必须被最大化。
实施例4
动态光散射(dls)测量
动态光散射研究用来研究阳离子聚合物的聚集倾向。
针对如在实施例1中描述而制备的基于polglumyttm糖原的阳离子聚合物，并针对以各个sirna/聚合物重量百分比制备的各自与sirna(invitrogen，供应商参照号1299001)形成的复合物，如下面报告的进行动态光散射研究。
对于光散射研究，制备下列溶液：
-溶液1：sirna在无rnase的pbs中0.1mg/ml的贮备液；
-溶液2：各种阳离子聚合物在无rnase的pbs中在0.2mg/ml浓度下的贮备液，通过0.22μm无菌过滤器过滤；
-溶液3：无rnase的pbs溶液，过滤通过0.22μm无菌过滤器。
缩略语pbs(磷酸盐缓冲盐水)表示：在7.4ph下的标准磷酸盐缓冲盐水，包括8g/l氯化钠、1.78g/l磷酸钠、0.2g/l氯化钾和0.27g/l磷酸钾的水性盐溶液。
通过将溶液1、2和3按照表9中给出的比例混合，获得分析的样品。然后将样品通过搅拌处理30秒，并静置30分钟，进行两次。在通过搅拌30秒并静置1小时的随后处理之后，用dlszetasizernanomalvern分析样品，在分析之前通过搅拌5分钟来小心处理该溶液。
在25℃下在173°散射角下，利用氦氖激光器(λ＝632.8nm)进行测量。利用zetasizer软件处理结果。
表9
该研究使得确定下列参数成为可能：
1.不含sirna的polglumyttm糖原的阳离子衍生物的平均直径(z)(结果列示于表10中)；
2.纳米颗粒的长径比(结果列在表10中)；和
3.相对于没有观察到聚集现象的聚合物的重量，sirna的最大重量百分比(结果列在表10中)。
表10
(*)比较的：deae-葡聚糖
(1)平均直径(z)
如可以从表10看出的，所有衍生物具有小于100nm的平均直径(z)。
有利的并且与deae-葡聚糖形成对比的是，按照本发明的阳离子衍生物形成具有小于70nm平均粒径(z)的纳米颗粒。
(2)长径比
长径比是在由平均直径标准化的颗粒尺寸分布峰中间高度的宽度，且因此描述尺寸分布峰的形状。
如可以看出的，所有按照本发明的阳离子聚合物具有长径比在0.8和1.1之间的粒径分布，与deae-葡聚糖不同，deae-葡聚糖具有长径比等于4.5的粒径分布。
这表明了：通过使用相同的合成方法，按照本发明的糖原基阳离子聚合物使得获得在接近于平均值的粒度范围内的受控尺寸的纳米颗粒成为可能。
(3)对于没有观察到聚集的那些的sirna/聚合物的最大重量百分比
结果显示：根据本发明的包括所有取代基的阳离子聚合物，形成高达50重量％sirna的无聚集体的复合物，与衍生度有关。
聚合物18(deae-葡聚糖)只形成达到20重量％sirna的无聚集体的复合物。
实施例5
确定装载容量
通过凝胶电泳来确定一系列含有重复单元(a)和(b)的衍生物的装载容量。
按照下列方法来制备复合物。
使用各个sirna/聚合物比例(重量％)，来制备sirna和各个聚合物衍生物之间的复合物。
如在表11和12中描述的各个浓度下的聚合物溶液，与不含核糖核酸酶(rnase)的pbs混合，采用在不含rnase的水中0.340mg/ml的sirna溶液(invitrogen，参照号1299001)，过滤通过0.2μm过滤器。然后，通过搅拌约30秒来处理混合物，在室温下静置15分钟，再次搅拌处理30秒，并且在静置约30分钟后，进行凝胶电泳。
通过将10μl各个复合物的溶液装载在(在mops-edta-醋酸钠缓冲液中制备的)含有1:200000比例greengelplustmnucleicacidstain20000x的4％琼脂糖凝胶上，来显影(developed)凝胶。
在80v的恒压下，来显影1小时的琼脂糖凝胶。通过imagequantlas4000系统(gehealthcare)的方式，来获得图像。
获得的凝胶示于图1至8中。
利用聚合物溶液和sirna，以在下表11中给出的量，来制备在聚合物3(deae-糖原)和sirna之间形成的复合物。将聚合物3装载0.5重量％至800重量％的sirna。
在其上接种聚合物3和sirna之间形成的复合物，且随后通过电泳来显影的凝胶，示于在表11中所列的图中。
表11
将未改性的polglumyttm糖原(50*)用作比较：
在图1中，可以看出：在与sirna以0.5重量％至8重量％百分比复合的聚合物3的栏中，不存在单独相当于sirna的白色谱带。该谱带的不存在表明：聚合物3能够与相对于聚合物重量为0.5重量％至8重量％的sirna完全复合。
在图2中，在与sirna复合的聚合物3的栏中，相当于sirna的谱带的不存在表明：聚合物3能够与相对于聚合物重量为10重量％至20重量％百分比的sirna完全复合。在聚合物50(未改性的polglumyttm糖原)的栏中，相当于sirna的谱带的存在表明：未改性的polglumyttm糖原不能与sirna复合，即使在相对于聚合物的重量等于10重量％的百分比下也如此。
在图3中，在与30％的sirna复合的聚合物3的栏中，相当于sirna的谱带的不存在表明：聚合物3能够与相对于聚合物总重量为30重量％的sirna完全复合。相反，相当于在50重量％至800重量％的百分比的sirna谱带的存在，表明：聚合物3不能与相对于聚合物总重量为50重量％的sirna复合。
因此，这些研究表明：聚合物3的最大装载容量是30重量％的sirna。相反，未改性的polglumyttm糖原(聚合物50)不能复合sirna。
另外，利用下列聚合物来制备聚合物-sirna复合物：
-第1、2、6、8、10、12、14、16号，包括重复单元(a)；
-第20、21、23、24、25、28号，包括重复单元(b)；
使用两个sirna装载百分比：相对于聚合物的重量为5％和20％。使用的溶液列于下表12中。
表12
在图4中，在分别与5重量％和20重量％的sirna复合的聚合物1的栏中，相当于sirna的谱带的存在表明：聚合物1(具有低衍生度的deae-polgumyt)不能复合sirna。聚合物2能够与相对于聚合物总重为5重量％的sirna复合，并且聚合物6也能够与相对于聚合物总重为20重量％的sirna复合。
在图5中，在与20重量％的sirna复合的聚合物10和14的栏中，相当于sirna的谱带的存在表明：这些聚合物能够与5重量％的sirna复合。相反，聚合物15能够复合20重量％的sirna。
在图6中，相对于sirna的谱带的不存在表明：聚合物8、12和16能够复合20重量％的sirna。
在图7中，在聚合物24和25的栏中，相当于sirna的谱带的存在表明：这些聚合物不能复合5％的sirna。相反，聚合物21也复合了20％的sirna。
在图8中，在与20％的sirna复合的聚合物23和20的栏中，相当于sirna的谱带的存在表明：这些聚合物复合了5％的sirna。相反，聚合物28复合了20％的sirna。
因此，通常，该研究使得可能表明：仅仅聚合物1(具有最低衍生度的deae-糖原)、24和25够复合小于5重量％的sirna。
所有其他衍生物能够复合20％的sirna，像比较的聚合物18(deae-葡聚糖)。相反，聚合物50(未改性的polglumyttm糖原)不能与sirna形成复合物。
实施例6
polglumyttm糖原的阳离子衍生物的细胞毒性研究
针对(deae)-糖原(聚合物1-4)、(dmap)-糖原(聚合物5-8)、(dmae)-糖原(聚合物9-12)、(2-oh-ptma)-糖原(聚合物13-16)、针对未改性的polglumyttm糖原(聚合物50)、针对deae-葡聚糖盐酸盐(聚合物18)和针对其它已经被广泛研究了核酸运送的其它参照聚合物、支链聚乙烯亚胺(pei)(aldrich，参照号40872-7)(聚合物60)，进行细胞毒性研究。
(a)针对按照本发明的阳离子聚合物的研究
制备阳离子聚合物
将阳离子聚合物溶于水中，并适当地在细胞培养介质中稀释，以获得10至10-5mg/ml的最终浓度，在24、48和72小时后，用于评价针对以下两个细胞系的细胞毒性：monomac-6和ht29。
monomac-6细胞系
人类单核/巨噬细胞系monomac-6由mantovani教授(humanitas，意大利)友好地捐赠。
将细胞保持在37℃下含有5％co2的细胞培养器中，在补充有10％胎儿小牛血清(fcs)、2％l-谷氨酰胺、1％青霉素/链霉素溶液、1％非必需的氨基酸、1％100mm丙酮酸钠和1％草酰乙酸的rpmi1640介质中。
将在悬浮液中生长的细胞维持在培养物中，通过经由细胞培养基在新鲜的完全培养基中1:4的稀释，以每周一次频率，进行传代。
ht-29细胞系
将从americantypeculturecollection(atccmaryland,usa)获得的人类结肠腺癌细胞系ht-29，维持在dulbecco'smodifiedeagles介质(dmem高葡萄糖ph7.4)中，该介质补充有10％胎儿小牛血清(fcs)、2％l-谷氨酰胺、1％青霉素/链霉素溶液、1％非必需氨基酸、1％100mm的丙酮酸钠和2％1m的hepes溶液。
将通过粘附生长的细胞维持培养，通过在每周每个烧瓶接种300000个细胞的频率下，在用胰蛋白酶/edta处理以从单层中移除细胞之前进行传代。
细胞毒性分析
将在实验前24小时铺板在96孔板(10000细胞/孔)中的monomac-6和ht-29细胞，与各个浓度下的阳离子衍生物一起孵育24、48和72小时。
在用测试化合物处理结束时，使用试剂盒atplite(perkin-elmer)来确定细胞的生存力，其为腺苷三磷酸(atp)生产量。
atplite分析是基于发光的产生，发光是在存在于细胞中的atp与在读数之前加入到孔中的荧光素酶和d-荧光素的反应产生的。产生的发光强度与存在于样品中的atp浓度直接成正比，并且利用发光计(victor-3wallac)测量。
在进行发光计测量之前，向每个孔中加入在100μl培养基中50μl的溶胞溶液(在0.2nnaoh中0.5％的tritonx-100)。在室温下孵育并在700rpm下搅拌5分钟后，向每个孔加入50μlatplite试剂盒，在搅拌5分钟后，将板在黑暗中再孵育10分钟，之后进行发光测量。
对于每种衍生物，一式两份地进行试验。
通过考虑处理的细胞的发光值和未处理的对照细胞的发光值的平均值，来确定细胞生存力的百分比。
对于每种衍生物的细胞生存力百分比(％cv)，表示为相对于对照物(control)的平均百分比，按照下列等式：
当生存力的百分比小于50％时，化合物被认为是细胞毒性的。
表13-阳离子聚合物浓度0.01mg/ml
(*)用于比较的聚合物：
18＝deae葡聚糖；
50＝未改性的polglumyttm糖原；
60＝聚乙烯亚胺(pei)。
表13中的结果，使得可能表明：按照本发明的阳离子聚合物，在0.01mg/ml的浓度下，不是细胞毒性的。
表14-阳离子聚合物浓度0.1mg/ml
(*)用于比较的聚合物：
18＝deae葡聚糖；
50＝未改性的polglumyttm糖原；
60＝pei。
表14中的结果，使得可能表明：按照本发明的阳离子聚合物，在0.1mg/ml的浓度下，不是细胞毒性的，与deae-葡聚糖和pei不同。
表15-阳离子聚合物浓度1.0mg/ml
(*)用于比较的聚合物：
18＝deae葡聚糖；
50＝未改性的polglumyttm糖原；
60＝pei。
表15中的结果，使得可能表明：按照本发明的阳离子聚合物，除了聚合物7之外，在1mg/ml的浓度下，不是细胞毒性的，与deae-葡聚糖和pei不同。衍生物7被证明只在悬浮液中对细胞培养物是细胞毒性的。
表16-阳离子聚合物浓度10.0mg/ml
(*)用于比较的聚合物：
18＝deae葡聚糖；
50＝未改性的polglumyttm糖原；
60＝pei。
表16中的结果使得可能表明：按照本发明的阳离子聚合物，在10mg/ml的浓度下，不是细胞毒性的，不像deae-葡聚糖和pei。
(b)针对按照本发明的阳离子聚合物的荧光衍生物的研究
还利用按照本发明的阳离子聚合物的荧光衍生物进行细胞毒性研究，以确定最高非细胞毒性浓度(在该浓度下进行细胞摄取(uptake)研究)的目的。
如下来合成按照本发明的阳离子聚合物的荧光衍生物。
在不存在光的情况下，在装备有磁力搅拌器的两颈圆底烧瓶中，将500mg按照本发明的阳离子聚合物的一种溶解在10ml蒸馏水中。加入2ml1n的naoh，并将混合物在室温下搅拌1.5小时。然后，加入溶解在约0.3mldmso中的36mg异硫氰酸荧光素(fitc)。将混合物在室温下搅拌整夜。
次日，将20ml丙酮注入反应烧瓶中，并且在搅拌约30分钟后，使聚合物沉淀。丢弃上层清液，并将沉淀物用约20ml丙酮洗涤两次。
然后，将沉淀物溶解在约10ml蒸馏水中，随后在再生纤维素管(截止(cut-off)15000)中反蒸馏水进行透析，在不存在光的情况下。一旦完成透析，将获得的溶液通过0.45μm过滤器过滤并冻干。
针对如之前描述而制备的ht29粘附细胞，进行这些研究。
结果示于下表17中，其中按照本发明的阳离子聚合物的荧光衍生物，已经通过与表2中相同的编码外加"f"进行表示。
表17
(*)比较的：
18f＝deae-葡聚糖的荧光衍生物
从获得结果可以看出：最高浓度是1mg/ml，在内所述浓度所有按照本发明的阳离子聚合物的荧光衍生物，在24小时周期内是非细胞毒性的。相反，deae-葡聚糖的荧光衍生物在所有分析的浓度下都是高细胞毒性的。
实施例7
细胞摄取研究
利用本发明阳离子聚合物的荧光衍生物(1f-16f)和deae-葡聚糖盐酸盐，在1mg/ml的浓度下，即：在细胞毒性研究中分析的，荧光衍生物1f-16f被证明在24小时期间是非细胞毒性的最高浓度下，在2、6和24小时进行细胞摄取研究。
利用按照下列过程处理的ht29粘附细胞，进行研究。
将在试验前一天在20000个细胞/孔的密度下析出的ht-29细胞，与各自的在1mg/ml浓度下的荧光衍生物一起孵育2、6和24小时。在每个孵育期的末尾，从孔中除去介质，并将细胞用标准的ph7.4磷酸盐缓冲盐水(pbs)冲洗三次。
然后，用200μl溶胞溶液(在0.2nnaoh中0.5％的tritonx-100)处理细胞，并用荧光测定法(λexc.485nm；λem.535nm)测量荧光。
对于每个化合物和每次测试，计算两个重复实验的平均荧光，其数值示于表18中。
表18
通过构造每个荧光衍生物在溶胞溶剂(在0.2nnaoh中0.5％的tritonx-100)中的校准曲线，来计算荧光衍生物的细胞摄取有效量。
从校准曲线和观察到的荧光强度，计算细胞摄取以mg/ml计的量，如在表19中所示。
表19
(*)荧光的deae-葡聚糖
获得的结果表示：按照本发明的阳离子聚合物的细胞摄取度与deae-葡聚糖有关。
此外，值得注意的是：衍生度对细胞摄取具有直接成正比的影响。
实施例8
缓冲容量的评价
评价缓冲容量，以核对按照本发明的阳离子聚合物将具有以下特征，使得它们也将诱导"质子-海绵"效应，这被认为是在细胞吸收后，使聚合物-核酸复合物从核内体释放所必需的。
将按照本发明的阳离子聚合物(deae-糖原)和deae-葡聚糖用naoh滴定，以转变成盐酸盐(如实施例2所示)，通过ph变化来监测滴定。
将100mg聚合物盐酸盐溶解在100ml蒸馏水中，将溶液在室温下搅拌整夜。次日，将溶液用0.01nnaoh滴定，用剂量计来进行滴定剂的添加，并且用ph计监测滴定。
针对按照本发明阳离子衍生物进行的滴定研究，使得可能标识在约4.5-8范围内的低于和大约为生理学ph的pka分配，这赋予本发明阳离子聚合物以高的缓冲容量。
在大约生理学ph的pka值，对于赋予本发明阳离子聚合物以复合核酸所需的正电荷是有用的。
在低于生理学ph的pka值，对于确保复合物从核内体向细胞质中的释放(通过"质子海绵"效应)是有用的。
图9显示：用于比较目的的阳离子聚合物2、3和4(deae-糖原，按照本发明)的滴定曲线。可注意到的是：同一种类的衍生物，缓冲容量随着衍生度增加而增加。
另外，可以看出：聚合物4(deae-糖原)和产物18(deae-葡聚糖)具有相似的衍生度和可比较的缓冲容量，如在图10中所示。
实施例9
流变性测量
针对按照本发明的阳离子衍生物1-16(deae-、dmap-、dmae-、2-oh-ptma-糖原)和deae-葡聚糖盐酸盐，在pbs中1％的浓度下，进行流变性研究。
利用bohlingemini150转动流变仪进行测量，该流变仪是由bohlinr640.5.32软件引导的，装备有圆锥体-板几何体2°/55mm，用peltierbohlin仪器保持恒温在25℃下的，并且在"控制应力"模式下和1-5pa的剪切应力范围中进行的。
所有分析的样品显示mpa*s等级的极低粘度值。这个特征使得还可能通过注射来使用根据本发明的阳离子衍生物。
举例来说，表20报道了各个衍生物在单一应力值(2.5pa)下的粘度值。
表20
(*)比较的：deae-葡聚糖
实施例10
复合有阴离子分子的糖原的阳离子衍生物的细胞毒性研究
在实验前一天，以10000个细胞/孔的密度，采用体积100μl的含有10％血清的dmem介质，铺板ht-29细胞。
在试验当天，从孔中除去介质，并加入150μl含有2.5％血清的dmem介质。然后，添加50μl由按照本发明的阳离子聚合物和荧光的sirna形成的复合物。由按照本发明的阳离子聚合物和荧光的sirna形成的复合物是按照以下操作制备的。
制备四种溶液，各自在40ml不含rnase的pbs中含有6.283mg阳离子聚合物3、7、11和15。向142.86μl各个溶液加入6.6μlsirna在不含rnase的pbs中的溶液(浓度20μm)，并且在几分钟后，将每个用350.54μl不含rnase的pbs稀释。sirna在溶液中的最终浓度是264nm，相当于相对于聚合物重量为10重量％的sirna。
将由此获得溶液搅拌约30秒，在室温下孵育10分钟，再次搅拌30秒，并静置5分钟。在进行试验前，将溶液再次搅拌30秒。
将未添加sirna的阳离子聚合物3、7、11和15在40ml不含rnase的pbs中的溶液(50μl)，用作第一比较例。
将在sirna和转染试剂
将未添加sirna的转染试剂
将复合物和所有如上所述制备的比较材料被放置以与细胞接触。
将细胞在37℃下培养4和24小时，之后除去上层清液，并加入100μl含有2.5％血清的介质。
在用测试化合物处理的末尾，以使用试剂盒atplite(perkin-elmer)确定细胞的生存力，其为腺苷三磷酸(atp)生产量的函数，如上文实施例6所描述的。
如在实施例6中所描述而确定的结果，在下表21中表示为活细胞的百分数。
表21
获得的结果表明：在按照本发明的阳离子聚合物和sirna之间获得的复合物不是细胞毒性的。
从而，将阳离子聚合物3、7、11和15用于以下的细胞摄取研究。
实施例11
复合有荧光阴离子分子的糖原的阳离子衍生物的细胞摄取研究
以与上文实施例7中描述的类似的方式进行该研究，利用ht29粘附细胞。
在实验前一天，以20000个细胞/孔的密度，使用体积100μl的含有10％血清的dmem介质，铺板ht-29细胞。
在试验当天，从孔中除去介质，并加入150μl含有2.5％血清的dmem介质。然后，添加50μl由按照本发明的阳离子聚合物和荧光的sirna形成的复合物。
由按照本发明的阳离子聚合物和荧光的sirna形成的复合物是按照下列方法制备的。
制备四种溶液，各自在40ml不含rnase的pbs中含有6.2832mg阳离子聚合物3、7、11和15。向142.86μl每个这些溶液，加入6.6μlsirna在不含rnase的pbs中的溶液(浓度20μm)，并且在几分钟后，将每个用350.54μl不含rnase的pbs稀释。sirna被荧光化合物alexa-488标记。sirna的最终浓度是264nm，相当于相对于聚合物重量为10重量％的sirna。
将由此获得溶液搅拌约30秒，在室温下孵育10分钟，再搅拌30秒，并静置5分钟。在进行试验前，将溶液再次搅拌30秒。
将在sirna和转染试剂
测量单独sirna的荧光，作为随后的比较。
将复合物和所有如上所述制备的比较材料放置以与细胞接触。
将细胞在37℃下孵育4小时，在舍弃上层清液之后，将细胞用200μlpbs冲洗两次。
然后，在室温与搅拌下，将细胞用200μl溶胞溶液(在0.2nnaoh中0.5％的tritonx-100)处理5分钟。
在将聚合物和sirna之间形成的复合物已经与细胞保持接触4小时之后，用荧光计(λexc.485nm；λem.535nm)测量由alexa-488标记的sirna(其被摄取)发射的荧光。
对于各个聚合物，一式三份地进行试验，然后计算平均荧光强度。由这个值减去由单独培养基计算的荧光强度平均值(它等于1366)，得到最终的荧光强度。
对第一比较例(
结果示于表22中。
表22
获得的结果表明：按照本发明的阳离子聚合物能够诱导sirna向细胞膜中的摄取。另外，与用作比较的复合物(包括
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