一种酶法辅助制备泡叶藻多糖的方法与流程

本发明涉及生物制剂的技术领域，尤其涉及一种酶法辅助制备泡叶藻多糖的方法。

背景技术：

泡叶藻(ascophyllumnodosum)，又称岩衣藻，是一种大型的海洋褐藻,主要在北大西洋沿岸生长繁殖。和其他褐藻(比如海带)相似。泡叶藻含有丰富的褐藻胶(alginateacid)(约占藻体所含总糖质的79％)，是工业生产褐藻胶、碘和甘露醇的主要原料之一。除褐藻胶外，泡叶藻还含有约占藻体总糖质的13％的泡叶藻聚糖(ascophyllan)和8％的岩藻聚糖(fucoidan)。在我国，泡叶藻在工业上主要被用作提取褐藻胶的原料；农业生产上用来制作化肥、饲料等；在食品行业中主要用来制作海藻粉。

泡叶藻聚糖，又称泡叶藻糖胶。早在20世纪60年代，挪威科学家larsen指出泡叶藻中存在一种区别于褐藻胶和岩藻聚糖的多糖硫酸酯，并将其命名为泡叶藻聚糖(ascophyllan)。由于很长一段时间没有从结构及生物活性方面将泡叶藻聚糖与岩藻聚糖相区分，从而忽视了对其进行深入研究。近年来，研究指出泡叶藻聚糖具有多种优良的生物活性，如免疫刺激、抗氧化、抗肿瘤、抗炎症活性等，但传统的泡叶藻多糖提取法提取率只有6％左右且颜色较深对其在食品领域的应用有很大的限制作用。多糖的提取方法有水提法、酸碱提法、微波提取、超声提取、生物酶法等与其他方法相比，酶法辅助提取多糖具有条件温和，操作方便，经济节约等优点。多糖的脱色方法有活性炭吸附、有机溶剂萃取、大孔树脂吸附、h2o2氧化脱色等，不同的脱色方法在不同的多糖脱色过程中呈现不同的效果。

有鉴于此，本发明人研究和设计了一种酶法辅助制备泡叶藻多糖的方法，本案由此产生。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种酶法辅助制备泡叶藻多糖的方法，旨在提高其提取率的同时对其颜色进行有效脱除，使其在食品领域和生物医药领域有重要的应用价值和良好的开发前景。

为了实现上述目的，本发明解决其技术问题所采取的技术方案是：

一种酶法辅助制备泡叶藻多糖的方法,包括以下步骤：

步骤一、泡叶藻粉的制备：

将泡叶藻洗净、烘干后、粉碎，过60目标准筛，制得泡叶藻粉；

步骤二、纤维素酶处理：

将泡叶藻粉浸泡于10-50倍体积的水中，再添加100iu/ml-300iu/ml的纤维素酶制剂，并在40℃-60℃温浴1h-3h；

步骤三、水提：将步骤二得到的纤维素酶处理液取出，不断搅拌，沸水浸提2h；

步骤四、除杂：将步骤三得到的提取液冷却至室温，在5000×g，20min条件下离心除去藻渣；用hcl调上清液ph至1.3，于4℃下过夜放置，在5000×g，20min条件下经冷冻离心去除沉淀褐藻胶；

步骤五、醇沉：将步骤四得到的上清液用naoh调至中性后，于4℃下用质量分数为50％的乙醇过夜沉淀，在5000×g的条件下冷冻离心获取沉淀，沉淀过程重复2次，并合并沉淀物，经3500da分子量截留的透析袋透析后，冷冻干燥获得泡叶藻多糖。

优选地，还包括步骤六、脱色：取泡叶藻多糖溶液于脱色釜中，加入双氧水至终浓度体积分数为1.4％-8.6％，置于电热恒温水槽中，ph7.0，脱色温度20℃-80℃，脱色时间0.5h-4.0h后，取出，经3500da分子量截留的透析袋透析后，冷冻干燥得成品。

优选地，所述步骤二中，水与泡叶藻粉的质量比为30。

优选地，所述步骤二中，酶制剂的添加量为200iu/ml。

优选地，所述步骤二中，酶解温度为50℃，酶解时间为2h。

优选地，所述步骤六中，加入双氧水至终浓度为8.6％。

优选地，所述步骤六中，脱色温度60℃。

优选地，所述步骤六中，脱色时间4.0h。

本发明的技术效果是加入纤维素酶制剂可以提高泡叶藻多糖的提取率，可使多糖的提取率与不加酶处理的最高提高50％。同时经双氧水脱色后多糖白度值和多糖保留率分别可达到61.1％、90.0％，此条件下，泡叶藻聚糖白度值、保留率以及免疫刺激活性均处于较优的水平，脱色成本和设备要求较低，有利于泡叶藻多糖的工业化生产。

附图说明

图1为正交实验组多糖诱导raw264.7细胞放出no的测定结果。

具体实施方式

实施例1

一种酶法辅助制备泡叶藻多糖的方法,包括以下步骤：

步骤一、泡叶藻粉的制备：

将泡叶藻洗净、烘干后、粉碎，过60目标准筛，制得泡叶藻粉；

步骤二、纤维素酶处理：

将泡叶藻粉浸泡于10-50倍体积的水中，再添加100iu/ml-300iu/ml的纤维素酶制剂，并在40℃-60℃温浴1h-3h；

步骤三、水提：将步骤二得到的纤维素酶处理液取出，不断搅拌，沸水浸提2h；

步骤四、除杂：将步骤三得到的提取液冷却至室温，在5000×g，20min条件下离心除去藻渣；用hcl调上清液ph至1.3，于4℃下过夜放置，在5000×g，20min条件下经冷冻离心去除沉淀褐藻胶；

步骤五、醇沉：将步骤四得到的上清液用naoh调至中性后，于4℃下用质量分数为50％的乙醇过夜沉淀，在5000×g的条件下冷冻离心获取沉淀，沉淀过程重复2次，并合并沉淀物，经3500da分子量截留的透析袋透析后，冷冻干燥获得泡叶藻多糖。

实施例2

一种酶法辅助制备泡叶藻多糖的方法,包括以下步骤：

步骤一、泡叶藻粉的制备：

将泡叶藻洗净、烘干后、粉碎，过60目标准筛，制得泡叶藻粉；

步骤二、纤维素酶处理：

将泡叶藻粉浸泡于30倍体积的水中，再添加300iu/ml的纤维素酶制剂，并在50℃温浴3h；

步骤三、水提：将步骤二得到的纤维素酶处理液取出，不断搅拌，沸水浸提2h；

步骤四、除杂：将步骤三得到的提取液冷却至室温，在5000×g，20min条件下离心除去藻渣；用hcl调上清液ph至1.3，于4℃下过夜放置，在5000×g，20min条件下经冷冻离心去除沉淀褐藻胶；

步骤五、醇沉：将步骤四得到的上清液用naoh调至中性后，于4℃下用质量分数为50％的乙醇过夜沉淀，在5000×g的条件下冷冻离心获取沉淀，沉淀过程重复2次，并合并沉淀物，经3500da分子量截留的透析袋透析后，冷冻干燥获得泡叶藻多糖。根据称量得到泡叶藻聚糖质量得到提取率为11.43％。

实施例3

一种酶法辅助制备泡叶藻多糖的方法,包括以下步骤：

步骤一、泡叶藻粉的制备：

将泡叶藻洗净、烘干后、粉碎，过60目标准筛，制得泡叶藻粉；

步骤二、纤维素酶处理：

将泡叶藻粉浸泡于30倍体积的水中，再添加200iu/ml的纤维素酶制剂，并在60℃温浴1h；

步骤三、水提：将步骤二得到的纤维素酶处理液取出，不断搅拌，沸水浸提2h；

步骤四、除杂：将步骤三得到的提取液冷却至室温，在5000×g，20min条件下离心除去藻渣；用hcl调上清液ph至1.3，于4℃下过夜放置，在5000×g，20min条件下经冷冻离心去除沉淀褐藻胶；

步骤五、醇沉：将步骤四得到的上清液用naoh调至中性后，于4℃下用质量分数为50％的乙醇过夜沉淀，在5000×g的条件下冷冻离心获取沉淀，沉淀过程重复2次，并合并沉淀物，经3500da分子量截留的透析袋透析后，冷冻干燥获得泡叶藻多糖。根据称量得到泡叶藻聚糖质量得到提取率为14.39％。

实施例4泡叶藻聚糖酶辅助提取响应面试验

以酶浓度，酶解时间，酶解温度为三因素对纤维素酶提取泡叶藻聚糖进行响应面试验，如表1所示，结果如表2所示。

表1box‐behnken实验因素和水平编码值表

表2中心组合试验方案及泡叶藻聚糖提取率结果

实施例5不同脱色方法对泡叶藻聚糖脱色效果的影响

将泡叶藻多糖通过活性炭吸附法脱色：取15.0ml泡叶藻聚糖溶液(4.0mg/ml)，按质量体积比加入3.0％的活性炭，室温脱色12h，离心(5000×g，5min)，上清液冷冻干燥至恒重备用；

有机溶剂萃取法脱色：取60.0mg泡叶藻聚糖粉末5份，分别加入15.0ml甲醇、乙醇、异丙醇、丙酮和四氢呋喃试剂沉淀聚糖，室温脱色12h后，离心(5000×g，5min)弃上清，取出沉淀，烘干至恒重后备用；

大孔树脂吸附法脱色：将大孔树脂(d101、d101-1和dm130)活化后，填入层析柱(2.6cmi.d.×20cm)，取5.0ml泡叶藻聚糖溶液(4.0mg/ml)，上样进入大孔树脂的层析柱，室温孵育12h，蒸馏水洗至洗脱液无色，收集洗脱液溶液，冷冻干燥至恒重备用；

h2o2氧化法脱色：15.0ml泡叶藻聚糖溶液(4.0mg/ml)，分别加入1.4、3.0、7.5ml的体积分数为30％的h2o2溶液，至h2o2溶液终浓度的体积分数分别为2.5、5.0、10.0％，室温孵育12h，经纯水透析(3500dacut-off)后冷冻干燥至恒重，备用。

分别以干燥后泡叶藻聚糖保留率和白度为指标比较不同脱色方法对泡叶藻聚糖脱色效果的影响。以脱色率和多糖保留率为指标，各脱色剂脱色效果见表3，确定双氧水为理想脱色剂。

表3不同脱色方法对泡叶藻聚糖脱色效果的影响

对泡叶藻聚糖的h2o2氧化脱色法进行因素水平正交试验，如表4所示，结果如表5所示。

表4泡叶藻聚糖脱色正交试验因素及水平

表5泡叶藻聚糖的h2o2氧化脱色法因素水平正交试验设计及结果

对上述正交实验组(如表5所示的实验组号1-9)及未脱色处理(as)的多糖诱导raw264.7细胞放出no的测定，实验组号1-9分别对应d1-as、d2-as、d3-as、d4-as、d5-as、d6-as、d7-as、d8-as、d9-as，结果如图1所示。

其中，取15.0ml泡叶藻聚糖溶液(20.0mg/ml)，ph调至7.0，加入8.0ml的30％h2o2至h2o2终浓度为8.6％、置于60℃的电热恒温水槽脱色4.0h，脱色后泡叶藻聚糖样品经纯水透析(3500dacut-off)后冷冻干燥至恒重，计算泡叶藻聚糖保留率为90.0％，并用白度仪测定泡叶藻聚糖的蓝光白度值为61.1％，再对脱色后的泡叶藻聚糖诱导raw264.7细胞放出no进行测定，结果表明脱色后的泡叶藻聚糖对巨噬细胞刺激产生的no可达到原多糖的76.7％。

其中，取15.0ml泡叶藻聚糖溶液(20.0mg/ml)，ph调至7.0，加入8.0ml的30％h2o2至h2o2终浓度为8.6％、置于60℃的电热恒温水槽脱色2.0h，脱色后泡叶藻聚糖样品经纯水透析(3500dacut-off)后冷冻干燥至恒重，计算泡叶藻聚糖保留率为93.4％，并用白度仪测定泡叶藻聚糖的蓝光白度值为32.8％，再对脱色后的泡叶藻聚糖诱导raw264.7细胞放出no进行测定，结果表明脱色后的泡叶藻聚糖对巨噬细胞刺激产生的no可达到原多糖的126.7％。

以上所述，仅为本发明较佳实施例而已，故不能依此限定本发明实施的范围，即依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。